Como la prevalencia del trastorno neurocognitivo está aumentando continuamente, nuestro objetivo es obtener, caracterizar y almacenar muestras de tejido cerebral de calidad para lograr un diagnóstico preciso y arrojar luz sobre los mecanismos neurodegenerativos. Teniendo en cuenta la asimetría cerebral, nuestra metodología de muestreo permite que todos los metaecon estudios se realicen en tejidos histológicamente bien definidos de ambos hemisferios y los muchos datos se pueden recopilar y correlacionar a través del aprendizaje profundo. Con frecuencia se observan efectos aditivos sobre el daño cerebral por múltiples patologías.
El diagnóstico definitivo requiere combinar el síndrome clínico con los hallazgos neuropatológicos para descubrir la patogénesis de la enfermedad y las posibles terapias. Los procedimientos de corte fresco, así como la gestión de la sección macro son complicados, pero también son esenciales para lograr buenos resultados. Un equipo entrenado y unido es crucial para superar estas dificultades.
Nuestro protocolo incluye una serie de pasos que se requieren destreza de mamíferos, por lo tanto, la demostración visual puede ser más útil que los textos descriptivos para los investigadores que deseen dominar estas técnicas. Después de confirmar la antomografía, usa un bisturí afilado para hacer una incisión del cuero cabelludo a través de la piel del cabello y tejido subcutáneo en la placa coronal desde la punta del proceso mastoideo de un lado al otro, pasando sobre el vértice. Separe los dos pliegues del cuero cabelludo cuidadosamente del cráneo y continúe con la incisión hasta que la grasa super orbital amarilla se haga visible.
Refleja el cuero cabelludo antes y tira de la otra sección del tejido posteriormente. Usando un bisturí y fórceps, cosecha una pequeña muestra del músculo temporal a cada lado del cráneo, colocando un espécimen en 4%formaldehído y el otro muestra a cuatro grados centígrados. Usando una sierra eléctrica cortar el cráneo en un corte V en el lado frontal y quitar la tapa del cráneo.
Después de cortar las meninges, cosechar una pieza de dura para la fijación y otra para la congelación. Inserte una aguja de 20 calibres de 3,5 pulgadas unida a una jeringa de 10 mililitros a través del cuerpo calloso para llegar al tercer ventrículo y retraiga el émbolo para obtener unos 10 mililitros de líquido cefalorraquídeo cerebral. Evaluar el color de la apariencia y la turbidez del fluido y medir el pH.
Tire suavemente de ambos lóbulos frontales para levantar el cerebro y cortar ambos nervios ópticos infundibulum, las arterias carótidas internas y el tercer, cuarto, quinto y sexto nervio craneal. Cortar el tentorio para llegar a la fosa posterior y cortar las arterias vertebrales y los nervios craneales inferiores. A continuación, inserte el bisturí lo más profundo posible a través del foramen magnum para cortar la porción más caudal de la medula y eliminar cuidadosamente todo el cerebro.
Usa el bisturí para aparecer en el hueso sobre la cueva de Meckel y recoge el ganglio Gasserian de cada lado para fijarlo y congelarse. Utilice un mazo quirúrgico y un cincel para fracturar la sella turcica ósea y extraer la glándula pituitaria para fijarla en 4%formaldehído. Inspeccione el cráneo y todo el cerebro a partir de alteraciones macroscópicas y cambios vasculares.
Utilice una cinta métrica para medir los diámetros de postura transversal y anterior del cerebro y pesar el cerebro en una escala. Recuperar cuidadosamente el círculo de Willis para la evaluación macroscópica para la presencia de variantes anatómicas, lesiones o estenosis de los vasos. Separe e inspeccione el cerebrum, el cerebelo y el tronco encefálica antes de pesar los tejidos individualmente.
Retire de uno a dos, de dos a cuatro centímetros cuadrados trozos de leptomeninges de la convexidad y conserve las muestras en un medio de cultivo DMEM de glucosa alta completa a cuatro grados centígrados. Cosecha la glándula pineal para fijarla en 4%formaldehído y retira las bombillas olfativas y los nervios ópticos para la fijación y congelación de uno de cada par. Coloque el cerebrum, el cerebelo y el tronco encefálica en hielo a cuatro grados centígrados.
Cuando todos los tejidos de interés han sido cosechados utilice un pegamento súper adhesivo para volver a conectar el hueso y utilizar una aguja quirúrgica, y suturas no absorbibles para coser hacia atrás el cuero cabelludo. Para la disección del banco cerebral, utilice un cuchillo disección para cortar el tronco encefálica axialmente y hacer el primer corte a nivel del cerebro medio rostral a través del colliículo superior para obtener dos rebanadas para exponer la sustancia nigra. Cortar el tronco encefálica en rodajas de 10, ocho milímetros teniendo cuidado de incluir cortes que pasan a través de los pons rostrales cerca de los márgenes superiores del cuarto ventrículo para observar el locus caeruleus y a través de la médula oblongata inferior a la estría acústica, justo por encima del ápice inferior del cuarto ventrículo para obtener rodajas incluyendo el núcleo motor dorsal del vágus.
Etiquete todas las rebanadas de una manera caudal rostral como BS para tronco encefálica seguido de números árabes. Después de la última sección de tronco encefálico, utilice la designación SC para la médula espinal seguida de números arábigos. Corte el cerebelo en el plano sagital para separar los dos hemisferios cerebelosos a nivel de los vermis y realizar seccionamiento sagital para obtener cinco rebanadas de cada hemisferio.
Asigne un nombre a todos los sectores del vermis como CBR o CBL para el cerebelo derecho e izquierdo respectivamente, y utilice números árabes para identificar cada sección. A continuación, separe los dos hemisferios del cerebro a través del cuerpo calloso en el plano sagital antes de cortar el hemisferio como singularmente a lo largo del plano coronal que pasa entre el quiasmo óptico y los cuerpos mamilares a través del polo temporal del lóbulo frontal, cingulado anterior, comisura anterior, núcleo menor y ganglios basales. Haga un segundo corte de aproximadamente un centímetro posterior pasando a través de los cuerpos mamilarios y exponiendo los ganglios basales, el tálamo anterior sub tálamo y la amígdala.
Continúe cortando para diseccionar las regiones anterior y posterior hasta que se hayan obtenido rodajas de 15 a 21 centímetros para cada hemisferio. Coloque la rebanada en una superficie plana a medida que se alcanzan siguiendo su posición original en la dirección posterior anterior desde el frontal hasta el polo occipital, con la porción continua con las diapositivas anteriores hacia arriba. Cuando se hayan colocado todas las rebanadas, seleccione las secciones principales que se fijarán para la histopatología, incluidas las secciones adquiridas anteriormente y las secciones del hipocampo, parietal y occipital, y etiquete las rebanadas como L o R seguidas de números árabes, incluida una etiqueta que indique si la rebanada debe ser fijada o congelada.
Cuando todos los tejidos hayan sido seccionados y etiquetados, obtenga una imagen para cada serie de secciones antes de su fijación o congelación. Para congelar las muestras coloque las secciones de tejido alternativo reservadas en una bandeja de aluminio precongelada y cubra las secciones con una placa de aluminio entrelazada para mantenerlas planas. A continuación, congele las rodajas en nitrógeno líquido durante tres minutos antes de colocar las muestras congeladas dentro de una bolsa de plástico etiquetada con sus correspondientes códigos de identificación y los números de corte para un almacenamiento en la caja criogénica apropiada a 80 grados centígrados.
Para fijar las muestras coloque las secciones de tejido alternativo reservadas en trozos individuales de gasa y coloque las rodajas en una solución de formalina tamponada de 10% de fosfato durante cinco días en una sala fría de cuatro grados centígrados. 24 de 27 cerebros cosechados recibieron la caracterización neuropatológica completa con un diagnóstico patológico clínico definido. El análisis preliminar cuantitativo de electroencefalogramas de una serie de 36 donantes cerebrales indica que el porcentaje de ritmo alfa principal es significativamente menor en los principales trastornos neurocognitivos que en el trastorno neurocognitivo leve de edad avanzada normal.
Aquí se muestra un ejemplo de una patología asimétrica con una atrofia del lado derecho evidente macroscópicamente con las dilataciones ventriculares graves observadas en la sección coronal derecha en comparación con la izquierda. Otro caso muestra un infarto del hemisferio derecho, mientras que otro espécimen muestra una clara atrofia del cuerpo mamilario derecho. Las secciones macro se pueden teñir para identificar la pérdida de mielina o la distribución de la inmunorreactividad dentro de los hemisferios.
Estas muestras son de gemelos que tuvieron un inicio clínico de la enfermedad de Alzheimer en diferentes períodos de tiempo debido a factores epigenéticos y ambientales. Sin embargo, el análisis microscópico reveló un cuadro neuropatológico muy similar que indica una alta patología de la enfermedad de Alzheimer y angiopatía amiloide. En estos dos pacientes, sin embargo, el mismo diagnóstico clínico de la enfermedad de Alzheimer no se correspondía exactamente con las características neuropatológicas, que revelaron un dúo de demencia en múltiples etiologías.
De hecho, el primer caso presentó a los cuerpos de Lewy en el gyrus single lie and substantia nigra. Y el segundo caso mostró cuerpos de Lewy asociados con neuritas de Lewy en la amígdala y en el núcleo de menores. La fotografía de las rebanadas es cuidadosamente para una identificación precisa de las áreas anatómicas durante el análisis microscópico.
La fijación y congelación de rodajas individuales también son importantes para preservar la microestructura tisular Omics la topografía de la activación genética y la distribución de proteínas y correlacionar estos datos con la histopatología. Cultivos celulares de tejidos bien caracterizados, también una investigación sobre la patogénesis de la enfermedad. Llevar siempre un equipo de protección personal adecuado, ya que un tejido cerebral creado se considera potencialmente infeccioso y porque se requiere el uso de herramientas peligrosas como instrumentos afilados y nitrógeno líquido.
