¿Alguna vez has pensado en aprovechar el poder de la microdisección de captura láser para el análisis de la expresión génica en células óseas específicas dentro de su entorno natural? Aquí, describimos un protocolo que le permitirá obtener cantidades suficientes de ARN de alta calidad a partir de criocciones de huesos de ratón. Esta tecnología es una gran herramienta para examinar los cambios en la expresión génica en células óseas específicas en modelos de ratón genéticamente diseñados o en modelos de enfermedades.
El protocolo descrito aquí se centra en los huesos del ratón, pero se puede utilizar para estudiar in situ una expresión génica en las células de cualquier tejido duro en cualquier especie. Ayudando a demostrar este procedimiento, estará Christiane Schueler, una técnico de mi laboratorio. Después de eutanasiar ratones por exsanguinación bajo anestesia general, retire los fémures enteros rápidamente.
Use un bisturí y toallas de papel para limpiar los fémures de los tejidos blandos circundantes. A continuación, vierta el compuesto de temperatura de corte óptimo en el molde de incrustación y coloque los fémures en la parte inferior de los moldes de incrustación. Enganche congelar las muestras en nitrógeno líquido.
Una vez que las muestras estén completamente congeladas, envuélvalas en papel de aluminio y transfiéralas sobre hielo seco a un congelador. Guárdelos a menos 80 grados centígrados hasta que estén listos para su posterior procesamiento. En primer lugar, ajuste la temperatura en el criostato a menos 19 grados centígrados y la temperatura del soporte del bloque a menos 17 grados centígrados.
A continuación, limpie el interior del criostato con 70% de etanol. Coloque la cuchilla desechable para los tejidos duros, los portaobjetos de vidrio y una herramienta de ajuste en el criostato para enfriar, y manténgalos dentro del criostato durante la segado. Transfiera el bloque de tejido congelado sobre hielo seco al criostato y deje que se equilibre durante al menos 10 minutos.
A continuación, presione la parte inferior del molde de incrustación para empujar el bloque OCT fuera del molde. Aplique suficiente medio OCT al soporte del bloque para adherirse al bloque y espere hasta que el medio OCT se congele por completo. Después de esto, coloque el soporte del bloque en el soporte del objeto y apriételo en su lugar.
Ajuste la posición de la hoja y recorte el bloque en incrementos de corte de 15 micrómetros para eliminar el OCT que cubre la muestra. Ajuste el criostato para generar secciones de ocho micrómetros y corte de dos a tres criocciones que se descartarán. Coloque la película adhesiva en el bloque y utilice la herramienta de montaje para adherir la película al bloque.
Ahora, haga un corte lentamente y a velocidad constante, mientras mantiene la sección junto a la película. Coloque la película con la muestra mirando hacia arriba en un tobogán de vidrio preenfriado en el criobar dentro del criostato para evitar la descongelación de la muestra. Utilice cinta adhesiva para fijar la película a la corredera de vidrio para facilitar la tinción.
En una campana de humo, prepare las soluciones necesarias de etanol, agua libre de RNase y xileno sobre hielo como se describe en el protocolo de texto. Incubar las secciones en 95%etanol durante 30 segundos. A continuación, sumerja cuidadosamente las secciones en agua libre de RNase durante 30 segundos para eliminar completamente el OCT.
A continuación, dispensar 50 microlitros de sección congelada comercial LCM manchado en la sección e incubar a temperatura ambiente durante 10 segundos. Escurra la sección colocando el borde de la diapositiva sobre papel de tejido absorbente. Enjuague la sección en 100% etanol durante 30 segundos para eliminar cualquier exceso de mancha.
Sumerja las secciones óseas en un segundo tubo que contenga 100% de etanol durante 30 segundos y luego transfieralas al 100% de xileno durante 30 segundos. Coloque la película adhesiva en un portaobjetos de vidrio seco como soporte, teniendo cuidado de colocar la película lo más plana posible. Después de esto, coloque una diapositiva de marco de membrana PET en la película y presione brevemente un dedo enguantado en la membrana para fijarlo a la película.
Esta muestra se intercalará entre la membrana y la película adhesiva. La película adhesiva no debe plegarse ni arrugarse y no debe haber burbujas de aire entre la película y la membrana. Comience por usar descontaminante de superficie para limpiar el soporte de la tapa final de la etapa.
Cargue la diapositiva en el portaobjetos y las tapas en el soporte de la tapa. A continuación, ajuste el enfoque y adquiera una visión general de la diapositiva con el objetivo 1.25x. Cambie al objetivo 40x y ajuste el enfoque.
Mediante el resumen de diapositivas, elija el área de interés. A continuación, ajuste los parámetros del láser como se muestra aquí, asegurándose de optimizar estos parámetros para cada objetivo. Si el láser no corta la muestra, aumente la potencia del láser.
Seleccione osteoblastos, osteocitos y células de revestimiento óseo en huesos orantes o corticales femorales distales basados en criterios morfológicos. Dibuje una línea para el camino láser más lejos de las células objetivo para minimizar el daño por el láser UV. Si el láser no corta la muestra, aplique el láser más de una vez o inspeccione el objetivo en busca de manchas de cortes incompletos y utilice la opción de movimiento y corte para cortar el tejido en estos puntos.
Recoja cada tipo de celda en una tapa de tubo separada de 0,5 mililitros. En primer lugar, dispensar 50 microlitros del tampón de lelisis que contiene beta mercaptoetanol en la tapa del tubo de recogida. Licee la muestra pipteándola arriba y abajo en la tapa durante un minuto.
A continuación, gire hacia abajo el alate y agregue 00 microlitros del tampón de lelisis que contiene beta-mercaptoetanol al tubo. Para cada diapositiva, prepare un tubo de microcentrífuga etiquetado con 350 microlitros del tampón de lelisis que contenga-beta mercaptoetanol. Utilice las secciones restantes después de la LCM para extraer el ARN.
Separe cuidadosamente la película de la membrana y ane la muestra mediante la picadura lenta del tampón de lelisis en la sección varias veces. Luego, ponga las muestras de izado en hielo seco y guárdelas a menos 80 grados Centígrados. Cuando esté listo para continuar, descongele los lysates a temperatura ambiente.
Después de esto, transfiera los lysates de las células cosechadas por LCM en los tubos de recolección a los nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y extraiga el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este estudio, se desarrolla un protocolo LCM para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de expresión génica en células óseas de fémures de ratón. LCM se realiza utilizando un sistema LCM que utiliza la gravedad para la recolección de muestras.
El rendimiento y la integridad del ARN aislado se midieron mediante electroforesis microcapilar. La diferencia en la calidad y cantidad de ARN obtenida utilizando diferentes protocolos de leis se puede ver aquí en el gel representativo y electroferogramas. Cuando la muestra se plica mediante la tubería hacia arriba y hacia abajo en la tapa durante un minuto, es posible aislar aproximadamente 8,5 nanogramos de ARN de un milímetro cuadrado de tejido óseo microdiseccionado.
El valor RIN es 8.60. Alternativamente, LCM se realiza utilizando un sistema LCM que utiliza un pulso láser desenfocado, que catapulta el material en la tapa adhesiva colgante. Para los huesos congelados frescos, es posible aislar aproximadamente 1,6 nanogramos de ARN de un milímetro cuadrado de tejido óseo microdisección.
El valor RIN es uno. En conclusión, lo más importante a recordar en este procedimiento son aplicar el protocolo permanente de la manera correcta, evitar el secado completo de secciones en el complejo sándwich, utilizar un sistema de LCM adecuado, y no exceder los límites de tiempo para la cosecha de las células. Una vez que haya aislado el ARN de las células capturadas, puede utilizar el ARN para el perfilado de expresiones, por ejemplo, mediante la búsqueda de ARN.
Por último, nos gustaría recordarles que el xileno y el beta-mercaptoetanol son sustancias peligrosas que deben manipularse bajo una capucha. Además, tome las precauciones adecuadas al manipular nitrógeno líquido y también las cuchillas criotomas.
