El protocolo descrito aquí proporciona a los investigadores un método para estudiar a los neutrófilos orales dentro de un modelo animal inducido por ligaduras de la enfermedad periodontal de una manera análoga a los participantes humanos. La principal ventaja de esta técnica se destaca por el aumento del volumen de tejidos gingivares inflamados disponibles para su posterior análisis, lo que reduce el uso de animales. Nuestra capacidad para recuperar las ligaduras recubiertas de biopelículas alrededor de los dientes permite la simulación de un tratamiento eficaz de una enfermedad periodontal localizada.
El uso de este modelo podría aplicarse en el estudio de los efectos sistémicos de la periodontitis en un modelo animal, debido al aumento de las áreas de los tejidos gingivares inflamados. Se recomienda en gran medida la familiarización con el uso de instrumentos microquirúrgicos y microscopios de disección, así como la atar los nudos del cirujano antes de manipular sujetos animales vivos. La demostración visual de esta técnica es fundamental para reducir la longitud de la curva de aprendizaje necesaria para lograr una colocación de ligadura competente.
Demostrando el procedimiento estará Jeff Chadwig, un estudiante graduado de mi laboratorio. Comience colocando el ratón en una plataforma quirúrgica calentada. Después de asegurarse de que el ratón está correctamente anestesiado, estabilice el maxilar y la mandíbula en posición abierta utilizando bandas elásticas.
Prope el cuello con un rollo de algodón para mantener el maxilar en una posición horizontal y cubrir el cuerpo y la cola para mitigar la pérdida de calor. Coloque el microscopio quirúrgico en el aumento y la iluminación deseados sobre la cavidad oral. Utilice fórceps de astilla para instalar una sutura de seda trenzada estéril de 50 o más pequeña alrededor de los molares maxilares M1 y M2 dentro del sulcus gingival.
Coloque la cola distal de la sutura en el lado palatal de la dentición e inserte el segmento proximal entre el contacto de M2 y M3. A continuación, envuélvalo alrededor de la superficie bucal de M2 e insértelo entre el contacto de M1 y M2. Asegúrese de que ambos extremos de la sutura se tiran firmemente para conducirlo hasta el sulcus gingival. Envuelva el segmento de sutura proximal alrededor de M1 por debajo de su altura de contorno e insértelo entre el contacto de M1 y M2. Tire de la cola proximal de la sutura firmemente para eliminar toda holgura. Ate los extremos de la sutura con el nudo de un cirujano y recorte las colas de la forma más ordenada posible.
Coloque el nudo en la abrazadera gingival entre M1 y M2 en el lado palatal de la dentición maxilar. Es fundamental que el nudo utilizado para asegurar la ligadura esté seguro y en posición donde no irritará al animal ni interferirá con la masticación. Después de la instalación de la ligadura, retire el ratón del aparato quirúrgico y colóquelo en una jaula limpia bajo una lámpara de calor, asegurándose de monitorearlo hasta que esté completamente recuperado.
Esterilice los instrumentos quirúrgicos en el esterilizador de perlas de vidrio caliente entre cada sujeto animal. Alberge individualmente cada ratón con el enriquecimiento ambiental adecuado y permita el acceso ad libitum al agua filtrada y puré de comida estándar en un ambiente controlado por temperatura y humedad durante siete a 11 días. Cuando esté listo para recoger muestras, utilice una pipeta para enjuagar la cavidad oral con 100 microlitros de PBS de cuatro grados esterilizados sin calcio y magnesio durante 10 segundos.
Repita el enjuague dos veces más, colocando cada enjuague en el mismo tubo de ensayo estéril cónico de 15 mililitros para cada animal. Ejecute el contenido de cada tubo de 15 mililitros a través de un filtro de malla de nylon de 40 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros, y transfiera el filtrado a un nuevo tubo de ensayo de 15 mililitros. Añadir 33,3 microlitros de 16%paraformaldehído para facilitar la fijación de la muestra.
Vórtice las muestras inmediatamente e incubarlas sobre hielo durante 15 minutos. El paraformaldehído es el reactivo más peligroso empleado en el protocolo y debe ser manipulado con el equipo de protección personal recomendado aconsejado por el fabricante. Después de la incubación, llene el tubo a 15 mililitros con PBS y luego centrifugarlo a 1000xg y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante, volver a suspender el pellet en un mililitro de tampón FACS a cuatro grados centígrados y contar las células en un hemocitoómetro o contador de células automatizado. Repita la centrifugación y aspire el sobrenadante. Luego, vuelva a suspender el pellet celular en un volumen apropiado de búfer FACS para una concentración final de 500.000 a 1 millón de células por cada 50 microlitros de búfer FACS y transfiera las células al tubo FACS.
Agregue un microlitro de suero de rata y dos microlitros de anticuerpo IGG antiratón a 50 microlitros de la muestra. Vórtice la muestra inmediatamente y bloquearla sobre hielo durante 20 minutos. A continuación, añada los anticuerpos adecuados a cada muestra.
Vórtice e incubar sobre hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, lave las muestras con un mililitro de tampón FACS, vórtice brevemente y centrífuga durante cinco minutos a 1000xg y cuatro grados centígrados. Vierta el sobrenadante y bloquee suavemente la abertura del tubo FACS.
Repita el lavado dos veces y, a continuación, vuelva a suspender las muestras en 250 microlitros de búfer FACS para su almacenamiento. Cubra los tubos con película de parafina, envuélvalos en papel de aluminio y guárdelos a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para analizar. La citometría de flujo se utilizó para analizar los neutrófilos recuperados de un enjuague oral de un ratón ingenuo, así como un enjuague oral y ligadura recuperada de un ratón con periodontitis inducida por ligadura.
Para evaluar la pérdida ósea alveolar, se midieron los niveles óseos alveolares desde la cresta ósea alveolar hasta la unión de cementoenamel para ratones sanos y ligados. Luego, se calcularon las diferencias de medición. Aunque no se revisa aquí, también se puede llevar a cabo una evaluación histopatológica, inmunohistoquímica y morfométrica del periodontium y el hueso alveolar dependiendo de la cuestión de la investigación.
Este modelo se utiliza actualmente en mi laboratorio para estudiar los efectos del sistema inmunitario innato oral en la salud y enfermedad sistémicas.
