Los implantes de cartílago representan un método traslacional de fácil acceso para interrogar la remodelación del tejido en la matriz del cartílago. El método puede proporcionar una visión temprana de cómo los nuevos tratamientos potenciales afectan la estructura articular. La principal ventaja de esta técnica es que el cartílago permanece en un entorno 3D nativo, que permite perfilar la interacción entre las células y la matriz circundante utilizando biomarcadores.
El principio en el método no es exclusivo del cartílago. Las plantas se pueden extraer de otros tejidos como un óvulo, hígado y pulmón e interrogarse utilizando biomarcadores derivados de matrices. Demostrando el procedimiento estará Amalie Engstrom, una estudiante de posgrado de nuestro laboratorio.
Realice todo el proceso de abastecimiento de tejido fuera de una campana de flujo laminar en un entorno aséptico. De un matadero local, obtener una articulación de rodilla femoral tibial bovina fresca entera de terneros entre 1,5 y dos años de edad. Luego, disecciona suavemente la rodilla de la pantorrilla primero eliminando el exceso de carne, descubriendo los cónditos, menisco, tendones y membrana sinovial.
Cortar los tendones y la membrana sinovial permitiendo que la articulación se desmembra. Retire el menisco para exponer los cónlabios femorales. Utilice un punzón de biopsia de tres milímetros para aislar los explantes del área de carga de los cóndilos femorales y liberarlos de la superficie auricular cortando con un bisturí paralelo y lo más cerca posible del hueso subcondral.
Almacene y mezcle inmediatamente los explantes en un medio de cultivo de GLutimax DMEM F12 que contenga 1%penicilina y estreptomicina en un tubo de 50 mililitros o una placa Petri. Para comenzar el cultivo de tejido, transfiera los explantes a una placa estéril de 96 pozos en una campana de flujo laminar colocando todas las réplicas dentro de cada grupo diagonalmente para minimizar la variación inducida por la evaporación. Añadir PBS a los pozos exteriores de la placa de cultivo para evitar aún más la evaporación del sobrenadante.
A continuación, lave los explants tres veces en medio de cultivo o PBS. Cultivo de los explantes en 200 microlitros de medio de cultivo por pozo hasta el inicio del experimento durante hasta 10 semanas en una incubadora a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Si se aplica algún tratamiento, prepárelos a la concentración deseada en los pozos explantes por dilución en el medio de cultivo antes de cambiar el medio.
Cambie el medio de cultivo cada dos o tres días en una campana de flujo laminar. Retire suavemente el sobrenadante de cada pozo y transfiéralo a una nueva placa de 96 pozos para su almacenamiento. Añadir inmediatamente 200 microlitros de medio de cultivo fresco o tratamiento a cada pozo.
No deje que los explantes se sequen durante el cambio medio y asegúrese de que todos los explantes estén completamente sumergidos en el nuevo medio. Selle la nueva placa con cinta adhesiva y guárdela en menos 20 grados Celsius para el análisis de biomarcadores de la rotación de tejidos y la expresión de proteínas. Para comenzar una prueba de resazurin, haga una solución de medio de cultivo que contenga 10%resazurin.
Cosecha el sobrenadante como se describió anteriormente y sumerge los explantes en la solución de 10%resazurin a 37 grados Celsius durante tres horas o hasta que los sobrenadantes se vuelvan púrpuras. A continuación, transfiera la solución de resazurin condicionada y de control de fondo a una placa de microtiter negro y mida la fluorescencia con una excitación de 540 nanómetros y una emisión de 590 nanómetros. Después de esto, sumergir los explantes en medio de lavado durante cinco a 10 minutos para permitir que la resazurin se difunda por completo y añadir nuevo medio de cultivo o tratamientos si se utiliza.
Continuar midiendo la actividad metabólica una vez por semana como una medida indirecta de la viabilidad celular. En este estudio, los explantes de profundidad completa bovina son aislados, cultivados y tratados. Los explantes se dividen en cuatro grupos para el tratamiento, incluidos los tratados con Oncostatina M y el factor alfa de necrosis tumoral, los tratados con Oncostatina M y el factor de necrosis tumoral alfa con GM 6001, los tratados con el factor de crecimiento de insulina uno y un control sin tratamiento.
La actividad metabólica es relativamente estable a lo largo de las tres semanas para los cuatro grupos. Hubo una tendencia para IGF-1 para aumentar y O más grupos T para disminuir en comparación con el control. O más T se aplica a pozos de cultivo tres veces a la semana para investigar O más la degradación del cartílago mediado T.
O más T se ve para aumentar la degradación del colágeno tipo dos del día siete a 21 y la degradación agraquina de los días tres a 14 en comparación con el grupo de control. La adición de GM 6001 en combinación con O más T bloquea la versión del C2M mediado O más T, pero solo tiene un efecto limitado en AGN X1 con niveles similares al grupo O más T en el día 10. Insulina como factor de crecimiento uno se aplica tres veces por semana a los explantes de profundidad completa bovino para investigar cómo módulos de estimulación anabólica la rotación de ECM de cartílago.
El efecto de IGF-1 en los explantes de cartílago se observó principalmente en las mediciones de tipo dos formación de colágeno como se esperaba para los estímulos anabólicos. Cuando se trata con IGF-1, los niveles pro-C2 disminuyen menos que los observados en el grupo de control, lo que indica que IGF-1 estimula la formación de colágeno tipo dos desde el día siete. Los explantes pueden deteriorarse con el tiempo y, por lo tanto, el pipeteo cuidadoso es crítico en todos los pasos de tratamiento y lavado con el fin de no perder o destruir los explantes en los diferentes pasos de intercambio de medios.
Los resultados generados con este modelo no deben ser independientes, sino que deben estar respaldados por datos generados en tejidos humanos, así como celulares y en modelos más recientes para validar aún más los hallazgos. Para arrojar luz sobre el mecanismo subyacente en el tejido y no sólo los resultados, es posible analizar más a fondo tanto los tejidos como los sobrenadantes utilizando otras técnicas de biología molecular, como el análisis de expresión de genes y proteínas, o la inmunohistoquímica, u otras técnicas permanentes de biología molecular.
