El DRIT es significativo porque proporciona una prueba de diagnóstico de rabia que se puede realizar en laboratorios descentralizados en el campo o en áreas sin acceso rutinario a la microscopía electrónica. La principal ventaja del DRIT es que utiliza sólo una simple microscopía de luz y los resultados se pueden obtener en aproximadamente una hora. El DRIT proporciona una poderosa herramienta económica para el diagnóstico de la rabia que puede ser utilizada por laboratorios y biólogos de campo para mejorar los programas de vigilancia, prevención y control de la rabia a nivel mundial.
Para los animales recién recogidos o descongelados a temperatura ambiente, coloque el animal supino en una superficie plana con la columna cervical ligeramente girada hacia el examinador. Palpa para identificar la articulación atlanto-occipital en el aspecto lateral de la columna cervical. Usando una cuchilla de bisturí, haz una incisión a nivel de la articulación atlanto-occipital en el aspecto ventral cortando a través de todas las capas de músculo y tejido blando incluyendo la tráquea y el esófago.
Continúe hasta aproximar el aspecto anterior de las vértebras cervicales de la columna cervical. A continuación, mueva la cabeza del animal en una extensión de rango final hasta que el tallo cerebral sea visible. Usa una cuchilla de bisturí para eliminar todo el tronco cerebral visible y el tejido del sistema nervioso central para la muestra.
Coloque las muestras de tronco encefálica en un recipiente irrompible y etiquete en consecuencia. En primer lugar, establezca platos de tinción que sean lo suficientemente profundos como para permitir la inmersión completa de un portaobjetos. Llene el plato uno con 10% de formalina tamponada de fosfato.
Llene los platos dos, cuatro y cinco con TPBS. Llene el plato tres con 3%peróxido de hidrógeno. Luego llene los platos seis, ocho, nueve y 10 con agua destilada o desionizada.
Llene el plato siete con la formulación de hematoxilina número dos de Gill diluida en una proporción de 1:1 con agua destilada. Para preparar la solución de material de amino-etil-carbazole, utilizando una pipeta de vidrio, coloque cinco mililitros de N, N-dimetilformamida en un recipiente de vidrio. Añadir 120 miligramos de comprimido de 3-amino-9-etilcarbazol al recipiente de vidrio y agitar hasta que se disuelva por completo.
Para preparar la dilución de trabajo AEC, añada siete mililitros de tampón de acetato a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Utilice una pipeta de vidrio para añadir 0,5 mililitros de solución de material AEC al tubo centrífugo. Añadir 0,75 mililitros de 3% de solución de peróxido de hidrógeno.
Utilice una jeringa de 10 mililitros con un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros para filtrar la solución. Para comenzar, utilice un marcador de tinta permanente impermeable a prueba de manchas para etiquetar diapositivas de microscopio de vidrio con un número único para cada espécimen. Use una cuchilla de bisturí para extraer el tronco encefálica del recipiente y colóquelo en una toalla de papel.
Use una segunda toalla de papel para borrar suavemente cualquier exceso de líquido, sangre o piel para revelar solo el tejido del tronco encefálica. Si es necesario, secise el tejido del tronco encefálica para revelar una sección transversal. Toque suavemente la diapositiva del microscopio a varios puntos del tronco encefálico sin movimiento lateral para permitir que varias áreas del tronco encefálico se transfieran a la diapositiva asegurándose de que solo una o dos capas de células se transfieren del tejido cerebral a la diapositiva.
Deje que los portaobjetos se sequen al aire durante aproximadamente cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, sumerja los portaobjetos en el 10% de formalina tamponada en el plato uno durante 10 minutos. Retire los portaobjetos de la formalina y enjuáguelos en la solución TPBS en el plato dos.
Sumerja los portaobjetos enjuagados en la solución de peróxido de hidrógeno contenida en el plato tres durante 10 minutos. Después de esto, retire los portaobjetos del peróxido de hidrógeno y enjuáguelos en el TPBS fresco contenido en el plato cuatro. Después de eliminar cualquier exceso de peróxido de hidrógeno, coloque los portaobjetos en el TPBS fresco contenido en el plato cinco.
Tome los portaobjetos de uno en uno del plato cinco, agite y borre cualquier amortiguador sobrante y coloque el portaobjetos en una toalla de papel humedecida en el banco de laboratorio. Cuando se hayan transferido todas las diapositivas, utilice un gotero o pipeta para dejar caer suficiente anticuerpo primario contra el virus antirrábico en cada diapositiva para cubrir el tejido del SNC. Cubra los portaobjetos con placas de pozo u otra cubierta simple para crear una cámara de humedad e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente en la cámara durante 10 minutos.
Después de esto, retire los portaobjetos de la cámara de humedad, agite y borre cualquier exceso de conjugado y enjuague los portaobjetos en el TPBS en el plato cinco. Trabajando con una diapositiva a la vez, retire una diapositiva del TPBS y use un gotero o pipeta para dejar caer suficiente complejo de Streptavidin peroxidasa para cubrir el tejido del SNC. Una vez cubiertos todos los portaobjetos, incubarlos en la cámara de humedad durante 10 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, retire los portaobjetos de la cámara de humedad, agite y borre cualquier exceso de complejo y enjuague los portaobjetos en el TPBS contenidos en el plato cinco. Trabajando con una diapositiva a la vez, retire una diapositiva del TPBS y use una pipeta para dejar caer suficiente solución de trabajo AEC para cubrir el tejido del SNC. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Después de esto, enjuague los portaobjetos en el agua destilada contenida en el plato seis y colóquelos en una contramancha de hematoxilina de Gill en el plato siete durante dos minutos. Enjuague inmediatamente los portaobjetos en el agua destilada en el plato ocho. Repita esto dos veces con el agua dulce en platos nueve y 10 para cada lavado.
Trabajando una diapositiva a la vez, retire un tobogán del agua y agite y borre cualquier exceso de agua. Utilice un medio de montaje soluble en agua para fijar un cubreobjetos en el portaobjetos. A continuación, utilice un microscopio de luz con un objetivo 20X para ver las diapositivas.
Los resultados positivos del DRIT muestran inclusiones virales intracitoplasámicas rojas que pueden variar en forma y tamaño dentro del citoplasma de los cuerpos celulares azulados. Las inclusiones parecen suaves con márgenes muy brillantes y una zona central menos intensamente teñida. La distribución del antígeno se clasifica de más cuatro a más uno con más cuatro que representan la distribución del antígeno compuesta por una abundancia de inclusiones grandes y pequeñas que varían en tamaño y forma y presentes en cada campo de visión dentro de la impresión táctil del tejido del SNC.
Se asigna una distribución de más tres cuando hay inclusiones en una variedad de tamaños en la mayoría de los campos de vista, pero no en todos. Si las inclusiones se encuentran en entre el 10 y el 50% de los campos del microscopio, se asigna una distribución más de dos antígenos, mientras que una más una se asigna cuando las inclusiones se encuentran en menos del 10% de los campos. La mayoría de los tejidos del SNC con el virus de la rabia presentes exhiben inclusiones virales típicas calificadas como más tres o más cuatro intensidad y distribución de antígenos.
Si los resultados indican más uno o más dos en intensidad o distribución de antígenos, la muestra se declara indeterminada y se justifica la repetición de pruebas. Una muestra de prueba con DRIT se considera negativa para los antígenos del virus de la rabia después de que la diapositiva que contiene el tejido del SNC se escanee con un aumento de 200X o superior y no se detecten inclusiones típicas de virus. Las muestras negativas exhiben cuerpos celulares azulados con poca o ninguna tinción específica conocida.
Cada persona que realice pruebas diagnósticas de rabia debe recibir vacunas antirrábicas pre-exposición estándar y someterse a una evaluación regular de anticuerpos serológicos. Las personas no inmunizadas no deben entrar en áreas donde se está llevando a cabo dicho trabajo. Además de las precauciones tomadas al trabajar con virus de la rabia vivo, varios de los reactivos utilizados en la prueba son peligrosos.
Consulte las fichas de datos de seguridad de cada reactivo.
