Este protocolo permite al usuario estudiar el impacto de los procedimientos quirúrgicos invasivos utilizados en la clínica en los comportamientos de las células tumorales, como la migración, la invasión y la proliferación. Este método permite visualizar de forma exclusiva el mismo tumor antes y después de un procedimiento invasivo, proporcionando una visión que podría perderse en un enfoque no longitudinal. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del de la parte del de la de la parte del de los pies en un ratón adulto anestesiado, monte el ratón en un marco estereotáctico y asegure la cabeza con una abrazadera nasal y dos barras para los oídos.
Utilice una lámpara de calentamiento para preservar la temperatura corporal y aplique un ung ón en los ojos del animal. Usando tijeras afiladas, afeita el pelaje en el cráneo desde los ojos hasta la base del cráneo, y usa 70%etanol para esterilizar la piel expuesta. Cortar la piel de una manera circular, y utilizar un hisopo de algodón para raspar el periosteo expuesto.
Tratar el área quirúrgica con una gota de 1%lidocaína, y una concentración de 1:100 000 de epinefrina durante cinco minutos antes de eliminar el exceso de solución con un hisopo de algodón. Utilice pegamento de cianoacrilato para adherir los bordes de la piel al cráneo, y coloque el marco estereotáctico bajo un microscopio estéreo de disección con un aumento de 4x. A continuación, taladre cuidadosamente una ranura circular superficial, de cinco milímetros de diámetro, sobre el hueso parietal derecho.
Y aplique una gota de búfer de corteza a la ranura. Utilice fórceps delgados para levantar la solapa ósea para visualizar la superficie del cerebro, y utilice fórceps de punto curvos, cónicos y muy finos para eliminar la duramadre. Si se produce sangrado, utilice una esponja de gelatina absorbible para lograr la hemostasia.
Para la inyección de células tumorales, cargue alrededor de tres microlitros de las células en una jeringa hermética al gas de cinco microlitros equipada con una aguja de estilo de punto dos. Fije la aguja en el brazo manipulador estereotaxico y retire el tampón de la corteza del tejido expuesto. Coloque la punta de la jeringa en el centro de la craneotomía e inserte la aguja a una profundidad de 0,5 milímetros de la superficie del cráneo.
Luego, agregue una gota de tampón de corteza a la craneotomía y use un inyector de bomba de microsingor para entregar las células a una velocidad de 250 a 400 nanolitros por minuto. Para preparar la ventana de imágenes craneales, reemplace el tampón de la corteza con una gota de aceite de silicona en el sitio de craneotomía para evitar burbujas de aire debajo de la ventana. Selle el cerebro expuesto con un cubreobjetos de seis milímetros y aplique pegamento de cianoacrilato entre el cubreobjetos y el cráneo.
Luego usa pinzas finas para presionar suavemente el cubreobjetos contra el cráneo. En el punto de tiempo experimental adecuado, coloque el ratón boca arriba en un cuadro de imágenes y establezca el objetivo de agua 25x en la posición z más baja. Agregue una gran gota de agua al objetivo y transfiera la caja de imágenes a la cámara de clima oscuro de 37 grados Celsius del microscopio.
Lleve el objetivo a la cubierta de la ventana de imágenes craneales hasta que la gota de agua toque el cubreobjetos. Y usando el modo de epifluorescencia, observe el tumor a través del ocular para enfocar las células. Ajuste el láser a la longitud de onda correcta y seleccione el modo en vivo.
Después de seleccionar varias posiciones de interés para la creación de imágenes, registre sus coordenadas en el software. Defina una pila z para cada posición para adquirir el volumen máximo de células tumorales sin comprometer la resolución de las células tumorales, con el tamaño de paso entre las imágenes establecido en tres micrómetros. A continuación, adquirir imágenes del volumen tumoral en diferentes posiciones cada 20 minutos durante dos horas, añadiendo agua al objetivo antes de cada adquisición de imagen.
Después de adquirir la última imagen, transfiera el ratón a una almohadilla de calefacción con monitoreo hasta la recuperación completa. Un día después de la primera sesión de imágenes, asegure el ratón anestesiado en el marco estereotaxico como se ha demostrado, y use un hisopo de algodón empapado en acetona para limpiar los bordes del cubreobjetos hasta que el pegamento se ablande. Deslice una aguja de calibre 25 debajo del cubreobjetos y use fórceps de punto delgado para levantarlo e hidrate la craneotomía con tampón de corteza fresca.
Perfore el tumor a una profundidad de un milímetro con una aguja de calibre 25, deteniendo cualquier sangrado con una esponja de gelatina estéril, y sellar la superficie del cerebro con aceite de silicona fresco. A continuación, pegue un nuevo cubreobjetos de seis milímetros sobre la herida. Para el análisis de imágenes, abra el archivo LIF de lapso de tiempo en el programa de software del microscopio y seleccione la pestaña Procesar, Herramientas de proceso y Combinar.
Seleccione la primera imagen de la secuencia de tiempo y haga clic primero. Seleccione la segunda imagen de la secuencia de tiempo y haga clic en segundo lugar. En Combinar cotas, seleccione t para el tiempo y, a continuación, haga clic en Aplicar.
Se generará un nuevo archivo con dos puntos de tiempo. Después de realizar un seguimiento de cada serie de lapso de tiempo para tres pilas z consecutivas por separado, arrastre la carpeta que contiene las imágenes de lapso de tiempo a ImageJ. Seleccione la pestaña Plugins, Tracking y MtrackJ.
Para realizar un seguimiento de cada celda individual, seleccione Agregar y haga clic en cada celda en cada punto de tiempo. A continuación, haga clic en medir y guarde el archivo para extraer la medida de las pistas. La migración de células tumorales individuales se puede determinar mediante el seguimiento de la ruta de migración a lo largo del tiempo en diferentes planos xy de la pila z y se traza como un porcentaje de las células migratorias antes y después de la biopsia.
La tasa de proliferación de células tumorales se puede cuantificar en función de la condensación de Dendra2 con etiqueta H2B tras mitosis y trazarse como un porcentaje de las células divisorias antes y después de la biopsia. La comparación de la distribución de la velocidad de migración antes y después de la biopsia en el mismo tumor, revela que el número de células migratorias aumenta después de la intervención, con una disminución asociada en el número de células lentas a no migratorias. En promedio por tumor, se observa un aumento de 1,75 veces el porcentaje de células migratorias cuando se realiza una lesión similar a una biopsia, en comparación con los ratones no biopsiados de control.
Aunque el porcentaje de células tumorales migratorias eventualmente disminuye tanto en ratones con control como en biopsia, los ratones biopsiados todavía presentan una mayor capacidad migratoria que los ratones de control en general. El comportamiento proliferativo de células tumorales también demuestra un aumento de 1,52 veces en el número de eventos mitóticos tras la biopsia a lo largo del tiempo, en relación con ratones de control nobiados. Cabe destacar que no se observa ninguna inducción de la migración o proliferación de células tumorales después del reemplazo de ventanas de imágenes craneales sin biopsia, lo que indica que el aumento en la proliferación de células tumorales y las tasas de migración se desencadena específicamente por la lesión similar a la biopsia.
Es importante trabajar con alta precisión y habilidad quirúrgica durante los pasos de imagen craneal, implantación y reemplazo. Puede ser necesaria una práctica extensa.
