Este protocolo puede responder cómo varios circuitos en el cerebro regulan la neurogénesis adulta y específicamente cómo estimular o inhibir los circuitos neuronales afectan la proliferación de células madre neurales adultas. La ventaja de esta técnica es que es capaz de apuntar específicamente a los circuitos neuronales deseados, así como reducir la cantidad de estrés introducido a los animales. Este método puede proporcionar información sobre cómo diferentes circuitos cerebrales regulan la neurogénesis adulta, en particular, cómo los tipos de células específicas que liberan ciertos neurotransmisores regulan la proliferación de células madre neurales adultas.
Para comenzar este procedimiento, coloque las secciones de tejido en PBS y monte de cinco a ocho secciones en una diapositiva cargada positivamente en orden de serie de anterior a posterior. Deje que las secciones del tejido se sequen a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos y se adhieran completamente a los portaobjetos. A continuación, prepare el búfer de citrato en un contenedor.
Caliente el tampón de citrato en un horno microondas durante cinco minutos hasta que la solución esté hirviendo. Mientras tanto, coloque las secciones montadas en un portaobjetos de vidrio. Después de cinco minutos, coloque cuidadosamente el portaobjetos con las secciones en una caja de pipetas.
Ajuste la potencia del horno microondas al 50% y el tiempo de cocción a siete minutos. Inicie un temporizador durante siete minutos y supervise la solución. Detenga el horno microondas cuando la solución comience a hervir y continúe el microondas después de que se detenga la ebullición.
Deténgase después de que se agote el temporizador, incluso si el tiempo de cocción en el microondas no ha terminado. El objetivo de este paso es mantener el agua justo por debajo de la temperatura de ebullición sin dejar que el agua hierva demasiado. Demasiada ebullición eliminará las secciones de tejido de la diapositiva.
A continuación, transfiera la caja caliente con tampón de citrato y se desliza el tejido a un cubo de hielo para enfriarse. Cubra la caja y espere unos 30 minutos o hasta que la solución esté fría al tacto, antes de proceder a la tinción analógica de timidina. Para manchar las secciones del tejido con el análogo de la tiromidina, retire las secciones tisulares del tampón de citrato.
Deje que las secciones de tejido se sequen y se adhieran completamente a las diapositivas, antes de dibujar un borde con una pluma hidrófoba. A continuación, permeabilizar las secciones con búfer de permeabilización durante 20 a 30 minutos. Lave las secciones dos veces con TBS-triton durante cinco minutos cada vez.
A continuación, prepare una solución de reacción Edu. Incubar las secciones de la solución de reacción Edu durante 30 minutos a una hora. Posteriormente, lávelos tres veces en TBS-tritón durante cinco minutos cada vez.
Cubra los portaobjetos en papel de aluminio o colóquelos en una cámara protegida contra la luz para protegerlas de la luz después de este paso. En esta etapa, compruebe si la reacción Edu funciona mediante un microscopio fluorescente. Se deben observar células edu-etiquetadas si la reacción funciona.
Ahora, bloquea las secciones de tejido montada usando un tampón de bloqueo levantado en el mismo animal que el anticuerpo secundario durante 30 minutos a una hora. Luego, lávelos dos veces en TBS-triton durante cinco minutos cada vez. Durante el paso de bloqueo, prepare la solución primaria de anticuerpos mezclando el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo.
Posteriormente, agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos primarios por diapositiva para asegurarse de que las secciones del tejido estén completamente sumergidas, e incubarlas durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, lave las secciones del tejido tres veces en TBS-tritón durante cinco minutos cada una para eliminar el exceso de anticuerpo primario. A continuación, incubar las secciones tisulares en anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo preparados en solución tampón de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente.
Lave las secciones del tejido tres veces en TBS-tritón durante cinco minutos cada una para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios. A continuación, aplique la solución DAPI de 300 micromolares de uno a 100 en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, lave las secciones de tejido tres veces en PBS durante cinco minutos cada una para eliminar el exceso de DAPI, y retire el círculo de la pluma PAP alrededor del tejido usando un hisopo de algodón.
Deje secar las secciones, antes de aplicar el soporte de montaje y cubrirlas con cubreobjetos. Con el software de imágenes, abra la imagen de cada sección de dentate gyrus como una imagen compuesta con los canales combinados en colores distintos para visualizar fácilmente la colocación. A continuación, mida el área de derivación de giro en cada sección utilizando la herramienta de selección de polígonos y registre todas las secciones de cada ratón.
Esta será el área de giro dentuado utilizada para calcular la densidad. Usando el contador de celdas del plugin de software que se encuentra en Plugins, Analyze, Cell Counter, Cell Counter, registra el número de células en el giro dentado que tienen colocación de anticuerpo primario y timidina analógica Edu de la imagen compuesta. Además, registre el número total de celdas Edu-positivas y nestin-positivas con un proceso radial.
En el caso de nestin, es muy importante prestar atención a la morfología de las células. Si cuantifica las células madre neurales, asegúrese de que solo se cuantifiquen las células con un proceso radial. Introduzca los recuentos de celdas en un software de hoja de cálculo para compilar todos los datos para su análisis más adelante.
Por ejemplo, para obtener la densidad de células madre, divida la suma de las células nestin-positivas y Edu-positivas por la suma del volumen de giro dentuado en cada animal. Calcule el volumen de cada sección multiplicando el área con incrementos totales del paso Z, suponiendo que cada paso sea un micrómetro. En este protocolo, los pasos totales deben ser cercanos a 40 ya que el tejido se secciona a 40 micrómetros.
Posteriormente, calcular el número total de células proliferantes, porcentaje de células madre neurales proliferantes, y células proliferantes totales después de estimular las células de musgo contralateral. Mediante el uso de un edu análogo de timidina y recuperación de antígenos para la tinción de nestina, las células madre neurales proliferantes fueron etiquetadas con éxito. Además, al omitir el paso de recuperación de antígenos, se etiquetó el progenitor neural Tbr2 positivo y la neuroblastina y la neuroblastina positiva DCX y las neuronas inmaduras.
Este es un ejemplo del área cuantificada y utilizada para calcular la densidad celular, y aquí hay un ejemplo del tejido montado en una diapositiva. Los experimentos correctos y subcuestas se muestran para la comparación. Por último, hay varias cuantificaciones diferentes que se pueden obtener de un experimento exitoso.
Las cuantificaciones incluyen la densidad de las células madre neurales proliferantes, el porcentaje de células madre neuronales que proliferan, las células proliferantes totales y el grupo total de células madre. Tras la estimulación contralateral de las células musgosas, se observó una disminución en la proliferación de células madre neurales. El paso más importante en este procedimiento es controlar la ebullición del tejido en el horno microondas.
Las secciones de tejido se dañarán si están hirviendo durante demasiado tiempo. Después de seguir este procedimiento, uno podría inyectar diferentes vectores virales para apuntar al mismo circuito. Por ejemplo, si uno estuviera estimulando un circuito neural, uno podría inhibirlo usando un virus DREADD inhibitorio.
Las técnicas presentadas en este protocolo no son novedosas. Sin embargo, la fuerza de este protocolo es que cubre exhaustivamente todos los pasos necesarios para responder preguntas sobre cómo el circuito afecta a la neurogénesis adulta.
