Siguiendo este protocolo, el usuario podrá producir vectores AAV de alta pureza y rendimiento adecuados para aplicaciones in vitro o in vivo. Este protocolo se puede utilizar para producir y purificar una gama de serotipos AAV con diferencias en las configuraciones. La combinación de estos dos elementos puede ser útil para obtener el tipo de célula y la expresión específica del tejido.
La producción de algunos serotipos puede dar a un menor rendimiento. Se trata de una producción en la que hay serotipos cercanos y se debe evaluar de forma individual. Demostrando estos procedimientos estará Shelly Fripont, un técnico de nuestro laboratorio.
Después de cultivar las células HEK, mezcle 360 microgramos de plásmido auxiliar, 180 microgramos de plásmido que codifican el cácapsido vectorial y 180 microgramos de plásmido que contienen el transgén en 18 mililitros de cloruro de sodio milimolar de 150 milivolares para preparar la mezcla de ADN. Distribuya esta mezcla en tres tubos cónicos de 50 mililitros. En un nuevo tubo cónico, mezcle 840 microgramos de PEI y seis mililitros de cloruro de sodio de 150 milimolar para preparar la mezcla de PEI para seis platos de cultivo celular.
Luego, agregue seis mililitros de la mezcla PEI, gota a gota, a uno de los tubos cónicos que contienen la mezcla de ADN. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, retire seis platos de cultivo celular de la incubadora.
En una capucha de flujo laminar, aspira completamente el medio de cada plato. Enjuague los platos con cinco mililitros de DPBS precalentó para eliminar los restos del medio. Incline suavemente cada plato para asegurarse de que DPBS se distribuye uniformemente por toda la superficie.
A continuación, aspira suavemente el DPBS. Agregue 12 mililitros de DMEM uno a cada plato lentamente, con una pipeta colocada en el borde del plato. Mezclar la mezcla de PEI y ADN pipeteándola hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces.
Añadir dos mililitros de esta mezcla a cada uno de los seis platos de cultivo celular de una manera gota a gota, asegurándose de distribuir cuidadosamente sobre toda la superficie. Repita este proceso utilizando seis platos de cultivo celular a la vez hasta llegar a 18 platos de cultivo celular. Agitar suavemente los platos de cultivo celular para distribuir la mezcla de ADN PEI.
Incubar las células trans infectadas a 37 grados centígrados con un 95 por ciento de humedad y un cinco por ciento de dióxido de carbono durante cinco horas. Después de esto, añadir 12 mililitros adicionales de DMEM 10 a cada uno de los 18 platos sin quitar el medio preexistente. Continuar incubando las células trans infectadas en las mismas condiciones.
A las 72 horas después de la transfección, utilice un rascador celular para separar cuidadosamente las células de cada plato de cultivo. Recoger el medio y las células de dos platos de cultivo en un tubo cónico de 15 mililitros, mantenido en hielo. Centrifugar los tubos a 420 veces G y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos con la aceleración y desaceleración de la centrífuga ajustada al máximo.
Deseche cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo vertiéndolo suavemente en un recipiente de eliminación de residuos. Luego, coloque los tubos que contienen los pellets celulares sobre el hielo. Suspendemos cada pellet en dos mililitros de tampón de lelisis y mezclamos pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces.
Tire del AAV de tres tubos, juntos. Para comenzar, congele las células re-suspendidas colocándolas en un cubo que contenga hielo seco mezclado con etanol. Luego descongela las células colocándolas inmediatamente en un baño de agua a 37 grados centígrados.
Repita este ciclo de congelación y descongelación tres veces para anule las células y libere las partículas AAV. Después del tercer paso de descongelación, centrifugar a 1167 veces G y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes para limpiar los tubos cónicos de 50 mililitros.
Añadir nucleasa a cada tubo a una concentración final de 50 unidades por mililitro de sobrenadante. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos, mientras se arremolinan los tubos cada 10 minutos para asegurarse de que la nucleasa se mezcle a fondo con el sobrenadante. Centrifugar a 13490 veces G y a cuatro grados Celsius durante 20 minutos para aclarar el sobrenadante.
Después de esto, retire el émbolo de una jeringa de 10 mililitros, conecte un filtro de 0,45 micrómetros a la jeringa y colóquelo encima de un tubo cónico limpio de 50 mililitros. Llene cuidadosamente la jeringa con el sobrenadante clarificado. Utilice el émbolo para forzar el izado a través del filtro.
A continuación, prepare cada una de las fracciones de yodoxanol en cuatro tubos cónicos separados de 50 mililitros, como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Pipeteo ocho mililitros de 15 por ciento de yodoxanol en cada uno de los tres tubos de ultracentrífuga. Pipetear 5,5 mililitros de 25 por ciento de yodoxanol en un tubo cónico limpio de 50 mililitros.
Usando una pipeta Pasteur no graduada, capa cuidadosamente 5.5 mililitros de 25 por ciento de solución de yodoxanol por debajo de la solución de iodixanol al 15 por ciento. Agregue las soluciones del 40 por ciento y el 60 por ciento como se describe en el protocolo de texto. Las fracciones de iodixanol no deben mezclarse en capas.
Usando una pipeta Pasteur, capa el lisato crudo en la parte superior del gradiente de iodixanol del 15 por ciento, gota a gota, para evitar perturbar la interfaz entre el lisato crudo y la solución de iodixanol. Llene cada tubo de ultracentrifugación con tampón de lysis hasta que el menisco alcance la base del cuello del tubo, para asegurarse de que el tubo no se derrumbe bajo las fuerzas muy altas generadas durante la ultracentrifugación. Cierre los tubos con las tapas adecuadas.
Con una báscula digital, asegúrate de que los tres tubos de ultracentrifugación tengan el mismo peso. Ajustar el peso según sea necesario, añadiendo más tampón de lelisis en la parte superior del alisla bruta. Utilice un rotor de titanio de ángulo fijo para centrifugar los tubos a 301580 veces G y a 12 grados Celsius durante una hora y 40 minutos utilizando la máxima aceleración y desaceleración.
A continuación, coloque una aguja en una jeringa de cinco mililitros. Retire el espaciador de los tubos del rotor y recupere los tubos después de la centrifugación. Aspirar sólo la fracción de yodoxanol del 40 por ciento que contiene las partículas vectoriales.
O procesa la muestra o guárdala a cuatro grados centígrados. Aquí, se demuestra un protocolo que se puede utilizar para producir vectores AAV con una variedad de capsidos, configuraciones de genoma, tipos de promotores y cargas transgén. En este ejemplo, producimos y purificamos dos vectores AAV diferentes que expresan la proteína fluorescente verde a partir de un genoma autoconsuado.
Los dos vectores se distinguen por diferentes capsids:PHPB y AAV9. Fueron entregados, a través de la inyección de la vena de la cola, en adultos C57 negros seis ratones. Para evaluar los niveles de expresión transgénica tres semanas después de la inyección, las secciones se tiñen con anticuerpos primarios contra la GFP con la detección mediante anticuerpos secundarios conjugados con un tinte fluorescente.
Las mediciones de intensidad de fluorescencia muestran un aumento significativo en la expresión GFP cuando se utiliza el vector PHPB en relación con AAV9. Se observaron aumentos de la GFP en el cerebro, el cerebelo y en el tronco cerebral. La recopilación precisa del vector que contiene la fracción es crucial para este protocolo.
En caso de que esto no se haga correctamente, el rendimiento del vector, así como la pureza del vector se ven afectados negativamente. Al ser capaz de producir vectores AAV, pequeños laboratorios estarán en condiciones de aprovechar numerosas posibilidades experimentales para entregar genes en el sistema nervioso central. Este protocolo requiere el uso de una ultracentrífuga y es importante recibir un entrenamiento adecuado antes de manejar esto para evitar accidentes.
Además, los vectores AAV a menudo se clasifican como peligros biológicos y, por lo tanto, debe consultar las regulaciones locales antes de manipularlos y gestionarlos.
