Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de Candida sobre la virulencia de la tensión y las contribuciones de genes específicos a estos procesos. Las principales ventajas de esta técnica son que evita las preocupaciones con respecto al uso animal, es robusta, rápida, barata y proporciona un alto número de animales por experimento. En términos generales, los individuos que son nuevos en este método probablemente lucharán un poco porque tendrán alguna dificultad para evaluar la viabilidad del gusano antes del comienzo del experimento o podrían tener algunos problemas con la inyección inconsistente de los gusanos.
Pedir larvas de mayoristas y proveedores que no introducen hormonas, antibióticos u otros tratamientos a las larvas y que son capaces de enviar y entregar especímenes vivos. Cuando lleguen las larvas, revise cada recipiente para confirmar la salud y viabilidad de las larvas. Las larvas sanas estarán completamente sumergidas debajo de la ropa de cama, moviéndose y poseyendo una coloración amarilla y ligera con pocas larvas que contengan marcas negras o decoloraciones a lo largo del cuerpo.
Las larvas se pueden almacenar en sus recipientes en un espacio ventilado a temperatura ambiente durante un máximo de dos semanas. Para preparar las células de levadura para la infección por mellonella Galleria, haga crecer las cepas de C.albicans para ser inyectadas durante la noche en tres mililitros de caldo fresco de levadura-peptona-dextrosa por cepa en tubos de cultivo estándar en un tambor giratorio a velocidad media y 30 grados Celsius. A la mañana siguiente, recoger las células por centrifugación, y lavar la levadura tres veces en cinco mililitros de PBS fresco por centrifugación.
Después del último lavado, resuspender las células en un mililitro de PBS fresco y transferir la levadura a un tubo de microcentrífuga. Diluir en serie las células en PBS adicionales a una a 100, de uno a 1.000 y de uno a 100.000 concentraciones, y contar las células de las diluciones de uno a 100 y de uno a 1.000. Ajustar las células a una 2,5 veces 10 a las séptimas células por mililitro de concentración de PBS en un nuevo tubo de microcentrífuga, y confirmar la precisión de la dosis infecciosa mediante la enchacación del volumen adecuado de la dilución de uno a 100 000 para lograr 100 unidades formadoras de colonias en una placa de levadura-peptona-dextgarrosa para cada cultivo que se utilizará en la infección.
Para infectar las larvas con las células de Candida, primero esparza una pequeña cantidad de ropa de cama de gusano de cera en una placa Petri estéril vacía de 100 por 15 centímetros por réplica biológica, y esteriliza una jeringa de 10 microlitros equipada con una aguja de calibre 26 tres veces con 10 microlitros de 70% de etanol y tres veces con 10 microlitros de PBS por lavado. A continuación, vórtice la dilución de inoculación de C.albicans, y cargar 10 microlitros de células en la jeringa. Abra un recipiente de larvas de G.mellonella, y use un dedo para girar cuidadosamente la ropa de cama para descubrir larvas, seleccionando larvas amarillas de un tamaño similar que están en buen estado de salud con una falta de pigmentación negra en los cuerpos, utilizando los dedos medio e índice y el pulgar para recoger una larva de una manera similar a agarrar un lápiz.
Enrolle la larva sobre su espalda para que las piernas estén mirando hacia arriba, sosteniendo toda la longitud del cuerpo entre los dedos y el pulgar para que la larva sea incapaz de curvarse o alejarse de la inyección. Con la otra mano, gire la jeringa para que el bisel de la aguja esté mirando hacia arriba, e inserte lentamente toda la longitud del bisel en el cuerpo en la unión con la pierna izquierda más trasera, asegurando que la aguja penetre en el cuerpo y no simplemente empuje el cuerpo de la larva hacia adentro. El paso más crítico en este procedimiento es la inyección del gusano de cera de tal manera que el daño al cuerpo larvario se minimiza y se inocula el bolo completo.
A continuación, inyecte los 10 microlitros completos de Candida inoculum y extraiga la aguja. Co-casa hasta 10 larvas inyectadas del mismo cultivo de Candida en cada plato de Petri de 100 por 15 milímetros después de la inoculación, e incubar la larva a 37 grados centígrados durante ocho días. Revisa los platos cada 24 horas para controlar la muerte.
La mortalidad puede evaluarse inicialmente por pigmentación oscurecida, la formación de manchas o cuerpos negros y la falta de movimiento. Para confirmar la mortalidad, usa pinzas para rodar suavemente larvas moribundas sobre sus espaldas y pinchar ligeramente la parte inferior de la larva con las pinzas. Las larvas que comienzan a pupar en polillas se pueden incluir en el análisis, pero deben ser removidas si comienzan a mudarse.
No existe ninguna diferencia significativa en la cinética de la muerte por G.mellonella entre las larvas infectadas cero o 10 días después de la llegada. Los signos característicos de la enfermedad surgen en larvas de ambas edades que sucumben a la infección, comenzando con la decoloración que da paso a manchas negras antes de una pérdida total de motilidad y finalmente la muerte. La infección por C.albicans acelera este proceso de decoloración y morbilidad, pero no altera significativamente la cascada de marcadores fenotípicos que conducen a la muerte en comparación con las larvas no infectadas o inyectadas por PBS.
En particular, la infección de G.mellonella con homo-o heterocigotos tipo de apareamiento de cualquiera de las cepas C.albicans clínicamente aisladas probadas produce altas tasas de mortalidad en comparación con los animales inyectados por PBS, mientras que las inyecciones de cepas derivadas prototróficas atenúan el efecto letal en este modelo. Es importante recordar elegir larvas sanas y ser suave en el manejo de las larvas. Si se inocularán varias cepas, tenga cuidado de no dejar que las células de Candida se sienten en el PBS durante demasiado tiempo.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el perfil inmunológico y la localización de Candida dentro de las larvas para responder preguntas adicionales sobre las interacciones entre el huésped y el patógeno fúngico durante una infección. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran la patogénesis de Candida utilizando formatos de alto rendimiento. No olvide que trabajar con Candida albicans requiere cuidado y que las precauciones estándar, incluyendo el uso de equipos de protección personal, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
