Este método puede ayudar a responder preguntas clave, como cómo moderar positivamente la actividad de un gen, aprovechando los MRNAs que están presentes en las células y tejidos. Cómo compensar las deficiencias en la actividad, y cómo lograr una alta traducción de los mRNAs in vitro e in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que podemos examinar globalmente los genes objetivo de SINEUP en células vivas, mediante imágenes sin fijación ni recolección.
Así que las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestra terapia de casos con deficiencia de haploinsuferiguas, porque los SINEU pueden inducir un aumento doble en una proteína deficiente, como la frataxina en los casos de ataxia de Friedrich. Para comenzar, abra el navegador Zenbu y haga clic en la base de datos del proyecto Fantom de interés. Busque el gen objetivo y compruebe si hay sitio de inicio de transcripción, o TSS, y el nivel de expresión en las células y tejidos deseados.
Para determinar el SS, consulte el análisis de ejemplo de la proteína de la enfermedad de Parkinson siete, o PARK7 mRNA. Compruebe el TSS por región de pico de jaula. Para determinar los niveles de expresión de transcripción específicos de células y tejidos, seleccione la región de pico de jaula y haga clic en ampliar la región genómica para seleccionarla.
Compruebe la expresión PARK7 en el tipo de interés de celda y tejido, explorando la lista de expresiones de transcripción en la parte inferior de la página. A continuación, diseñe secuencias de dominio de enlace de varias longitudes diferentes correspondientes a 40 bases aguas arriba, y 32 bases aguas abajo de la primera metionina o AUG. Antes de la transfección con SINEUPs, células de semillas de interés en dos placas de 24 pozos recubiertos de poli-d-lisina, como se describe en el manuscrito.
Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2 del cinco por ciento para lograr una confluencia del 70 por ciento. Es muy importante distribuir las células por igual en los pozos, para ello agitar suavemente la placa 10 veces hacia adelante y hacia atrás después de sembrar las células dentro de un banco limpio, y repetir en la incubadora de CO2 del cinco por ciento. Después de la incubación, cambie el medio a 0,4 ml de medio fresco.
Para analizar SINEUP-GFP hacer varios tubos de 1,5 ml con 0,1 ml de solución mixta, con pEGFP-C2, SINEUP-GFP, reactivos de transfección y OptiMEM en cada tubo, y luego incubar el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Agregue 0,1 ml de esta solución mixta de cada tubo a un pozo separado de una placa de 24 pozos, y etiquete estos pozos con SINEUP-GFP uno, dos, tres, cuatro y cinco. Incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2 por cinco por ciento durante 24 horas.
Después de 24 horas, lave las células con 0,5 ml de PBS. Añadir 25 ml de 0.05 por ciento de peso por volumen de trippsina, e incubar en una incubadora de CO2 cinco por ciento durante cinco minutos. Añadir 275 ml de medio celular por pozo.
Para la extracción de proteínas, tome una de las dos placas, y cosechar 225uL o tres cuartas partes de las células de un pozo, y 75uL o una cuarta parte de las células para la extracción de ARN, cada uno en un tubo separado de 1.5 ml. Centrifugar a 6000xg durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante del tubo etiquetado por aislamiento proteico.
Añadir 60uL de solución de lysis a las células y mezclar por pipetear Mezclar a fondo girando a velocidad lenta durante una hora a cuatro grados Centígrados. Centrifugar el tubo a 14.000xg durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para recoger el sobrenadante de proteínas. Para determinar la concentración de proteínas, primero prepare de cinco a seis veces la dilución de la proteína de albúmina sérica bovina fresca estándar en agua ultrapura, con concentraciones que van desde 0,2 a 1,5 mg/ml de proteína.
Para preparar el reactivo de trabajo Una mezcla Dash añadir 20uL de reactivo S a un ml del reactivo A en un tubo de dos ml. Agregue cinco ml de agua como control negativo. Y luego, muestra estándar BSA o proteína en cada pozo.
Añadir 25uL de reactivo A Dash, y luego añadir cuidadosamente 200uL de reactivo B por pozo, evitando cualquier formación de burbujas. Cubra la placa con papel de aluminio para incubar a temperatura ambiente, durante cinco a ocho minutos. Mida la absorbancia de proteínas a 750 nm con un espectrofotómetro.
Prepare una curva estándar trazando las concentraciones de proteínas estándar de BSA en el eje X y su respectiva absorbancia en el eje Y. Aplique una ecuación de curva estándar para calcular la concentración de proteína de muestra. Para iniciar la separación de proteínas, agregue un volumen de 2x tinte de carga a cada volumen de la muestra de proteína.
Calienta a 90 grados centígrados durante cinco minutos e inmediatamente enfríe sobre hielo durante un minuto. Cargue de 10 a 20, una parte de muestras de proteínas en un 10 por ciento de gel de poliacrilamida SDS y separe entre 100 y 150 V. Transfiera la proteína del gel, a una membrana de nitrocelulosa de 0,5 micrómetros, mediante un instrumento de transferencia semisequeo.
Rellene con buffer de transferencia a 25V durante 30 minutos. Después de la transferencia, coloque la membrana en un recipiente y agregue la solución de bloqueo hasta que la membrana esté completamente empapada, e incubarlo a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Agregue el anticuerpo adecuado a la solución de bloqueo y vierta sobre la membrana.
Hibridar incubando la membrana durante 30 minutos a temperatura ambiente, mientras se agita. Después de la hibridación, lave la membrana añadiendo 1x tampón TBST durante cinco minutos a temperatura ambiente, y repita dos veces más. Realice la siguiente hibridación con un anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo sobre la membrana, a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras agita.
A continuación, lave la membrana añadiendo 1x tampón TBST durante cinco minutos a temperatura ambiente, y repita dos veces más. Transfiera la membrana a una caja llena con dos ml de mezcla de reactivos ECL mejorada de HRP. Cubra la caja con papel de aluminio e incubar durante uno o dos minutos a temperatura ambiente.
Retire cuidadosamente la membrana de la mezcla de reactivos ECL y expóndala con un instrumento de imágenes de luminiscencia. Para analizar el efecto de SINEUP-GFP en las células mediante imágenes, lave las células transectadas pEGFP-C2 y SINEUP-GFP de la segunda placa de 24 pozos con 0,5 ml de PBS por pozo. Para manchar el núcleo, agregue 2ug de Hoechst-33342 a cada pozo, e incubar las células a 37 grados centígrados, durante 20 minutos.
Utilice un citómetro de imagen micropocillos de alto rendimiento para medir las celdas manchadas de Hoechst, para contar el número total de celdas. Mida la intensidad de la fluorescencia verde para contar el número de células positivas de GFP. Para analizar el efecto de aislamiento proteico de los SINEUPs, utilice software de imágenes para determinar una intensidad integrada de GFP Caldúrelo como la suma de todas las intensidades de píxeles que muestran señales en objetos segmentados obtenidos para cada canal.
Después de una transfección exitosa con SINEUP-GFP, un SINEUP sintético que contiene un dominio de unión óptimo y un dominio de efector GFP, la traducción de ARNm se reguló sin cambiar la expresión de ARNm GFP. Un protocolo de análisis de imágenes semiautomático mejoró el tiempo de detección y aumentó el número de muestras que se examinan simultáneamente en comparación con un análisis de manchas occidentales convencionales. Aunque hubo una diferencia en la intensidad de la señal, de 2,6 veces en el análisis de manchas occidentales a 1,4 veces en el análisis de imágenes, se detectaron niveles significativamente más altos de fluorescencia de GFP en comparación con el control.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar identificar la secuencia correcta de los nRNA de destino para diseñar el dominio de enlace correcto. Los genes a menudo se transcriben de los promotores, y pueden utilizar diferentes sitios de iniciación de traducción. El navegador Zenbu es una herramienta muy útil para explorar dicha varianza de ARNm.
Sugerimos también diseñar diferentes SINEUPs con sitios de enlace variables. En conjunto, creemos que la rápida adaptación de los SINEUP a una multiplicidad de objetivos establecerá un nuevo campo consistente en una traducción positivamente regulada de los ARN existentes, que es recíproco y complementario al campo del siRNA. Una parte de la función que prevemos que esta tecnología será instrumental para producir mayores cantidades de proteínas in vitro, como biorreactores, así como in vivo para corregir naturalmente la dosis génica.
