Este método puede responder preguntas clave en el campo de la mecanobiología, como cómo se transmiten y detectan las fuerzas dentro de las células, así como entre las células y su entorno. La principal ventaja de esta técnica es que permite el acceso a la información de la escala molecular sobre cómo las proteínas responden a las fuerzas mecánicas dentro del contexto nativo de la célula viva. Aunque este método se ha aplicado específicamente para estudiar la proteína de adhesión focal vinculina, también se puede aplicar a otras proteínas mecánicamente sensibles, como talin, cadherinas o nesprin.
La demostración visual de este método es crítica, ya que la configuración de imágenes adecuada es difícil pero necesaria para el éxito del análisis. Comience este procedimiento con la expresión estable de la construcción del sensor de tensión en el tipo de celda deseado, como se detalla en el protocolo de texto. Para preparar sustratos para la siembra celular, adquiera cuatro platos con fondo de vidrio de 35 milímetros.
Trabajando en una capucha de cultivo celular, en un tubo cónico de 15 mililitros, hacen cuatro mililitros de 10 microgramos por mililitro de fibronectina en solución salina estéril con fosfato amortiguado, o PBS. Invierta suavemente el tubo una vez para mezclar y deje reposar la solución durante cinco minutos en la capucha de cultivo celular. A continuación, pipetee un mililitro de solución de fibronectina en cada plato con fondo de vidrio.
Deje la solución de fibronectina en los platos durante una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, aspirar la solución de fibronectina y enjuagar una vez con PBS. Deje un mililitro de PBS en los platos hasta que las células estén listas para la siembra.
Después de contar las células, sembrar 30.000 células en cada plato de vidrio recubierto de fibronectina con el medio completo adecuado para un volumen final de 1,5 mililitros. Permita que las células se propaguen durante cuatro horas después de la siembra. A las dos horas de propagación, aspirar los medios de crecimiento y enjuagar una vez con medios de imagen.
Deje 1,5 mililitros de los medios de imagen. Caliente el microscopio como se describe en el protocolo de texto antes de comenzar la calibración. Para calibrar el láser FRAP, abra primero la ventana de configuración del láser.
Establezca el ajuste iluminación en los ajustes de iluminación FRAP adecuados para la exposición láser a la muestra. A continuación, establezca el ajuste Iluminación en los ajustes de iluminación adecuados para la toma de imágenes solo del fluoróforo del aceptador. Seleccione el objetivo que desea calibrar en Configuración del sistema de coordenadas.
Desactive Haga clic manualmente en los puntos de calibración y marque Mostrar imágenes durante la calibración. Establezca el tiempo de morada en 10.000 microsegundos y el número de pulsos en 100. Ahora coloque la diapositiva de calibración, hecha de bromuro de etidio sellado entre una corredera de vidrio y un resbalón de cubierta, en el adaptador de escenario con el lado de la cubierta hacia abajo.
Utilice los ajustes de iluminación del aceptador para centrarse en la superficie de la diapositiva, identificable como el plano focal con la señal más brillante. Pequeños defectos en el recubrimiento serán visibles para ayudar en el enfoque. Mueva la diapositiva a un área con fluorescencia uniforme a través del plano de imágenes.
Haga clic en Crear configuración para la primera calibración o Configuración de actualización para calibraciones posteriores. El software inicializará el proceso de calibración, blanqueando y detectando automáticamente la posición del punto blanqueado. Asegurar una calibración exitosa mediante la evaluación de la imagen final, que será una cuadrícula de tres por tres de puntos blanqueados que deben distribuirse uniformemente y en foco.
Guarde la imagen de calibración para futuras referencias. Retire la corredera de calibración y guárdela de forma segura. La calibración debe realizarse antes de comenzar cada experimento, pero no es necesario realizar entre muestras.
Prepare la configuración de la microscopía para imágenes de células vivas, preferiblemente con una etapa y un objetivo calentados, así como un control de dióxido de carbono. Dejar equilibrar durante 20 minutos. Ahora coloque una de las muestras generadas de células que expresen el sensor de tensión en el soporte del microscopio para obtener imágenes.
Deje que las células se equilibren durante 10 minutos. Para garantizar la salud de las células con imagen, mantenga la temperatura a 37 grados centígrados en la cámara de imágenes. Utilice una bomba peristáltica para pasar dióxido de carbono humidificado de 5% sobre las muestras a 15 mililitros por minuto para mantener el pH.
Abra la herramienta Adquisición multidimensional, o MDA, y configurela con parámetros de imagen FRET, incluidos los diferentes conjuntos de filtros. Guarde este MDA en la carpeta experimental con el nombre de MDA_FRET_date. Configure otro MDA con los parámetros de imagen FRAP, incluidos los diferentes conjuntos de filtros, los ajustes de Timelapse y el diario para pulsar el láser después de la adquisición previa a la lejía.
Guarde este MDA en la carpeta experimental con el nombre de MDA_FRAP_date. En la barra de herramientas de la parte superior de la pantalla, seleccione Diario, Iniciar grabación. Abra la ventana MDA, cargue el estado MDA_FRET_date y pulse Adquirir.
A continuación, cargue el estado MDA_FRAP_date y pulse Adquirir. Al final de la adquisición, en la barra de herramientas de la parte superior de la pantalla, seleccione Diario, Detener grabación. Guarde este diario en la carpeta experimental con el nombre de FRETFRAP_date y agréguelo a una barra de herramientas para facilitar el acceso.
Cierre la ventana MDA. Navegue por la muestra utilizando la adquisición de imágenes en Adquirir, Adquirir con un tiempo de exposición mínimo y filtro de densidad neutra para identificar las celdas de interés. Establezca el enfoque automático continuo navegando a Dispositivos, Enfoque.
Concéntrese manualmente en la muestra hasta llegar al plano de imagen correcto. Haga clic en Establecer enfoque continuo y espere a que el sistema se ajuste. Una vez que el sistema se ajusta, haga clic en Iniciar enfoque continuo.
A continuación, busque una celda que exprese el sensor de tensión con una localización clara a una estructura de interés y ajuste una imagen. Dibuje una región rectangular de interés, o ROI, para resaltar dónde blanquear. Almacene esta ubicación de ROI.
Ahora inicialice el diario de FRETFRAP_date, que comenzará la adquisición de imágenes FRET, seguido de la inicialización del timelapse FRAP. Repita estos pasos hasta que se adquieran de 10 a 15 conjuntos de imágenes. A continuación, analice los datos FRET-FRAP como se detalla en el protocolo de texto.
Aquí se muestran resultados representativos para la imagen FRET del sensor de tensión de vinculina, después de la segmentación y enmascaramiento para aislar las adherencias focales. La variación espacial de la carga de vinculina se puede ver a través de la célula. La toma de imágenes y el análisis FRAP pueden verse afectados por la estabilidad de la adhesión focal.
Una adhesión focal que se transloca rápidamente durante el período de diagnóstico por imágenes puede ser difícil de rastrear con precisión. A menudo esto se indica mediante una curva FRAP que contiene discontinuidades y en no interpretable. Para una vinculina de tipo silvestre, existe una correlación inversa entre la carga de proteínas y la tasa de rotación, lo que indica que la vinculina se estabiliza por la fuerza.
La introducción de una mutación en la vinculina para realizar su unión al talin da lugar a una reversión de la correlación, lo que indica que la vinculina que es incapaz de unir talin es desestabilizada por la fuerza. Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar las muestras correctamente, asegurarse de que las células están expresando el sensor a niveles endógenos y elegir cuidadosamente los parámetros de imagen. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunofluorescencia, la medición de la dinámica de la escala celular o las células desafiantes con diversos inhibidores con el fin de responder a preguntas adicionales como cómo la proteína de interés interactúa con otros componentes subcelulares para coordinar la respuesta a la fuerza.
