Los autores fueron apoyados por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia KAKENHI Grant JP16K11200 y 17H 02223 y la subvención para la investigación de Kanazawa médica Universidad S2016-8 y C2017-3. Damos las gracias por su apoyo en la toma de las fotos Yuhichi Kuda.

Todos los procedimientos se realizan con arreglo a los principios rectores de la sociedad fisiológica de Japón y con la aprobación de la Animal cuidado Comité de Kanazawa Universidad médica.
1. construcción del vidrio Optrode titular
Nota: Para construir un soporte de optrode de vidrio, se utiliza un soporte de electrodo comercial (figura 1A).
<ol><li>Extraiga con cuidado el tubo de acero para control de la presión del barril del titular.</li>
	<li>Por perforación, ampliar el agujero del lado del asiento de pin en el cañón del titular. Hacer el agujero 3 mm de diámetro y 12 mm de profundidad.</li>
	<li>Poner un tubo de acero inoxidable (3 mm de diámetro, 0,5 mm de espesor y 8 mm de longitud; Figura 1A 2) en el agujero.</li>
	<li>Inserte el partido manga de acoplamiento para virolas de ⌀2.5 mm (figura 1A1) en el orificio de cerámica.</li>
	<li>Fijar el cilindro de la pinza portaelectrodos para una barbilla en forma de L con adhesivo epoxi.</li>
	<li>Hacer los agujeros (3 mm de diámetro) en la barbilla y adjuntarlo a un manipulador con tornillos.</li>
</ol>2. cabeza Post instalación
<ol><li>Preparar un post de cabeza a la medida de un separador de circuitos. Hacer el espaciador cilíndrico de circuitos en forma cuboidal con una fresa y cortar en 2 puestos de cabeza con una sierra (figura 1B). Aplanar la parte inferior del post principal con una fresa.</li>
	<li>Preparar el animal transgénico en el que un opsin de sensibles a la luz se expresa en un tipo de neurona específica para el estudio. En este trabajo, se utiliza el ratón transgénico (ChR2 VGAT ratones) en el cual las neuronas inhibitorias expresan channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .</li>
	<li>Anestesiar al animal con una mezcla de 0,3 mg/kg de medetomidina, 4,0 mg/kg de midazolam y 5,0 mg/kg de butorfanol por administración intraperitoneal. Para confirmar que el animal está completamente anestesiado, prueba sus reacciones para pellizcar la cola.</li>
	<li>Coloque el ratón en un marco estereotáctica en un cojín de calefacción. Limpiar el marco estereotáctica y la calefacción almohadilla con alcohol al 70% por adelantado. Colocar los dientes en el agujero de la barra de bocado y apriete ligeramente la abrazadera de la nariz. Fijar ambos lados de la cabeza por medio de barras de oído. Cuando la cabeza se fija correctamente por las barras de oído, apriete la abrazadera de la nariz. Aplicar una pomada oftálmica en los ojos.</li>
	<li>Afeitarse la piel cabeza con pequeñas tijeras y limpiar el cuero cabelludo con un algodón de gluconato de clorhexidina. Antes de la cirugía, esterilizar todos que los instrumentos quirúrgicos y una cabeza de correos con un autoclave (121 ° C, 15 min).</li>
	<li>Corte el cuero cabelludo a lo largo de la línea media con unas tijeras y empuje a un lado. Hacer la incisión de la parte posterior de la cabeza a los ojos (aproximadamente 20 milímetros). Retirar el periostio con un hisopo de algodón humedecido en alcohol al 70% y secar el cráneo.</li>
	<li>Coloque el poste principal en el manipulador. Coloque el post cabeza plana sobre el cráneo en el vértice con el manipulador.</li>
	<li>Mezcla el monómero (4 gotas), catalizador (1 gota) y polímero (1 cuchara pequeña) de cemento dental sobre un pequeño plato que se enfría en la nevera con antelación. Poner el cemento dental (por debajo de 1 g) en el frontal y el hueso parietal del cráneo para fijar el perno de cabeza en el cráneo.</li>
	<li>Después de que el cemento dental se convierte en duro, quitar el ratón en la estructura estereotáxicas. Pongo un ungüento antibiótico en la piel expuesta. Inyecte el antagonista de la medetomidina (0,3 mg/kg) y los antibióticos (oxitetraciclina; 20 mg/kg). Y controlar el mouse sobre el cojín del calor en una jaula hasta que despierta y volver a una jaula cubierta.</li>
	<li>Casa el animal en una jaula de vivienda individual con algún dispositivo de enriquecimiento. Cambiar el papel animal ropa de cama todos los días para mantener la jaula limpia y prevenir infecciones. Controle cuidadosamente si el animal muestra signos de malestar. Se aplica lidocaína a la herida si se sospecha de cualquier dolor. Administrar meloxicam o el carprofeno una vez cada 24 h durante 48 h después de la cabeza de tanto post cirugías instalación y craneotomía. La lidocaína local se puede dar además si el AINE no es adecuada.
</li>
</ol>3. aclimatación
<ol><li>(Mínimo) dos días después de la recuperación de la anestesia, aclimatar a los animales para el estado de cabeza fija en la cámara de grabación. Realizar las sesiones de aclimatación durante al menos 5 días.</li>
	<li>Durante las sesiones de aclimatación, coloque el animal en la sala de grabación con el post principal fijado a una mordaza a la medida. Durante la sesión, con el fin de limitar el movimiento, tapa el cuerpo con un tubo de medio de resina por encargo (figura 1), hecho con una impresora 3D. Nota: El día 1, la sesión de aclimatación debe ser 5 minutos de largo. Es entonces aumentado diariamente a 10, 20, 40 y 60 min para los días 2, 3, 4 y 5, respectivamente.</li>
	<li>Al final de cada sesión, dar al animal una recompensa de comida. Si el animal se esfuerza continuamente durante la aclimatación, detener la sesión.</li>
</ol>4. craneotomía
Nota: Después de la aclimatación, se realiza una craneotomía sobre la región del cerebro para la grabación. La craneotomía se realiza en el marco estereotáctica bajo anestesia, como con la cabeza post instalación. El procedimiento posterior a la operación es el mismo como la cabeza post instalación.
<ol><li>Antes de la craneotomía, limpiar el cráneo con un hisopo de algodón con clorhexidina gluconato y el 70% de alcohol.</li>
	<li>Raspar cuidadosamente el cráneo en el sitio de grabación con un taladro dental. Cuando el hueso se convierte en lo suficientemente delgado, cortar con la punta del bisturí y retírela.</li>
	<li>Poner cemento dental alrededor de la región expuesta a fin de fortalecer el cráneo.</li>
	<li>Cubra el área expuesta del cerebro con adhesivo de silicona después de que el cemento dental se convierte en duro. El procedimiento después de la cirugía es como se describe en el paso 2.8.</li>
</ol>5. grabación electrofisiológico
<ol><li>Permitir que el animal recuperar al menos 1 día después de la craneotomía antes de realizar la grabación electrofisiológica. Colocar el animal en la cámara de grabación de la misma manera que se ha hecho durante las sesiones de aclimatación cuando se inicie la grabación.</li>
	<li>Hacer pipetas de vidrio de Capillares de vidrio de borosilicato (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, largo 90,0 mm) tirado en un tirador de electrodo. El diámetro de su punta es 2 – 3 μm, y su resistencia es de 4 a 6 MΩ cuando están llenas de 10 mM PBS. La longitud del electrodo es de 40-50 mm. En algunas grabaciones, neurobiotin 2% se agrega a lo 10 mM PBS.</li>
	<li>Coloque la pipeta de cristal llenado al titular de la optrode por encargo.</li>
	<li>Poner el alambre de plata revestido de Ag-Cl (0,2 mm de diámetro) con la pipeta de cristal. Conecte el alambre de plata a un pin a través de un alambre eléctrico revestido fino. Conectar la clavija en el headstage del amplificador de grabación.</li>
	<li>Conecte el cable de fibra óptica parche (núcleo = 960 μm, revestimiento = 1.000 μm, NA = 0,63) con una virola de zirconia (OD = 2,5 mm) a la división de manga en el soporte de optrode de acoplamiento. Introduzca el cable de parche en la manga hasta la parte posterior de la pipeta de vidrio en contacto con la punta de la virola. Entrega de la cuerda de remiendo de la luz (longitud de onda = 465 nm) del LED. La luz LED es controlada por un controlador de LED de canal único.</li>
	<li>Remover el pegamento de silicona sobre la craneotomía. Poner caliente solución salina (38 ° C) en la superficie del cerebro periódicamente para evitar que la superficie del cerebro se seque durante la sesión de grabación. Si es necesario, retire la duramadre con pinzas afiladas.</li>
	<li>Insertar el electrodo de vidrio en el tejido cerebral con un manipulador. Monitorear la resistencia del electrodo cuando se inserta. Vuelva a colocar el electrodo cuando la resistencia es menor de lo esperado porque la punta del electrodo puede dañarse. En la profundidad de interés, buscar y aislar las puntas de la unidad de ajuste de la profundidad en pasos de 2 a 5 μm.</li>
	<li>Después de que la unidad está aislada, entregar la luz y observar la respuesta a los estímulos de luz.</li>
	<li>Registrar las actividades neuronales después de la identificación de los tipos de células. Realizar las grabaciones para 2-3 h. Si la grabación se realiza en días consecutivos (máxima de 2 días), cubrir la craneotomía con adhesivo de silicona. Cuando la grabación está terminada, y el animal es sacrificado, recuperar el post principal y ponerlo en acetona para lavar y reutilícelo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neural+circuits.">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li><li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons:+triumphs+and+challenges.">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).</li><li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties.">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li><li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain.">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757 (2016).</li><li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-assisted+patching:+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain.">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li><li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).</li><li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit:+effects+of+sodium+pentobarbital.">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li><li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+change+the+excitation/inhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus.">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li><li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse:+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects.">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li><li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus:+impact+of+aging+and+anesthesia.">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus.">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li><li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse:+electrophysiological+and+morphological+properties.">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice.">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li><li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo.">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li><li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo.">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li><li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation.">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li><li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons.">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Optogenetics se ha convertido en una herramienta poderosa en la neurociencia. Se ha utilizado para identificar tipos específicos neuronas en vivo así como manipular las actividades de vías neuronales específicas. La clarificación de las actividades neuronales de diferentes tipos neuronales promueve la comprensión del mecanismo de los circuitos neuronales. Aquí, hemos demostrado un método para proporcionar la luz en el sitio de grabación a través de un electrodo de vidrio en el IC de despiertas ratones VGAT ChR2.
Hay varios pasos críticos en el método descrito. En primer lugar, es un requisito para utilizar animales con una expresión suficiente y específica de opsins en las neuronas de destino. Para identificar las respuestas a la luz con las grabaciones extracelulares, es necesario que la activación de la opsina evoca los picos en las neuronas de destino. En algunas cepas transgénicas, es posible que el nivel de expresión del transgén en las neuronas es bajo en los animales jóvenes de14, y puede haber una edad mínima para el experimento. Además, puede ser necesario realizar algunos experimentos adicionales para confirmar si las respuestas a los estímulos de luz son específicas de los tipos de neurona de destino (por ejemplo, inmunohistoquímica). Cuando la neurona destino es excitatoria, sería necesario distinguir las respuestas evocadas directamente de las respuestas evocadas CCIS, que podrían hacerse por umbralización de la latencia de la respuesta. En segundo lugar, es fundamental para que el tejido cerebral es tan limpio como sea posible. Un mantenimiento de limpieza es especialmente necesario para evitar el sangrado durante la craneotomía y las grabaciones. Además, la superficie del cerebro debe ser prevenida de secado después de la craneotomía cubriendo la superficie con adhesivo de silicona.
Para entregar la luz eficientemente desde la punta del electrodo, es fundamental para reducir la pérdida en el trayecto óptico. En nuestra configuración de la optrode, la potencia de luz cae diez veces a través del soporte del electrodo: la potencia de luz es de 45 mW en el extremo de la cuerda de remiendo de fibra óptica, si bien es 3 – 5 mW en la punta de la pipeta de cristal. Como se muestra en los resultados, el tamaño de la punta y la longitud total no afectó la potencia de luz en la punta (figura 2). Estos resultados indicaron que la atenuación de la luz era bastante estable independientemente de la configuración de la pipeta de cristal. Esta atenuación de la luz no importa en la grabación de las neuronas de la IC en ratones VGAT ChR2 porque hemos comprobado que era posible grabar luz activados picos en el borde ventral (2 mm de profundidad) de la IC, aunque puede importar en otras configuraciones de grabación. Sería difícil reducir dramáticamente la atenuación de la luz, pero puede haber posibilidades de mejora. En primer lugar, puede ser efectivo utilizar cuarzo en lugar de un vidrio borosilicato como una pipeta de electrodo. Es conocido que el cuarzo ha luz mejor conductividad, por lo que puede reducir la pérdida de luz a través del electrodo15. Además, se informó que el pulimento del extremo de la pipeta reduce pérdida de luz en la superficie de contacto entre la pipeta y la cuerda de remiendo15. Si la mejora en la atenuación de la luz no es suficiente, sería efectivo usar un láser en vez de LED, aunque láser cuesta más de LED.
Una de las ventajas del electrodo de pipeta de vidrio es que es posible realizar procedimientos histológicos mediante la adición de trazadores o vectores para la solución de llenado. Los procedimientos histológicos añadirá una gran cantidad de información útil (la ubicación de la grabación), la morfología de la neurona registrada, etc.los datos electrofisiológicos. Además, se informó que es posible realizar estudios farmacológicos con el electrodo de cristal de bloqueo en la solución de llenado15. En contraste con estas ventajas, la limitación del electrodo de la pipeta de cristal es que no se puede grabar en varias unidades aisladas. Para la realización de varias grabaciones, es posible poner un alambre de tetrodo con la pipeta de vidrio en lugar de un solo alambre de Ag-Cl cubierto. En este caso, sería necesario utilizar una pipeta con un punta más grande (30-60 μm, el tamaño de la punta típica de un tetrodo) y dejar que el extremo de la tetrodo hacia fuera desde la punta de la pipeta.
Mientras que optrodes previamente divulgados a menudo compleja fabricación16,17, Magee y sus colegas han desarrollado un optrode usando pipetas de vidrio estándar como con el optrode hemos diseñado18. En su método, inserte una delgada fibra óptica dentro de la pipeta para entregar la luz. Para hacer la fibra fina suficiente para insertar el vástago de la pipeta, graba al agua fuerte de fibra de revestimiento de 125 μm con un núcleo de μm 9 a un diámetro de 8 – 10 μm en la punta. La ventaja de este método es que se aplicaría incluso para la pipeta doblada que se utiliza a menudo para iontoforesis. Sin embargo, puede ser difícil utilizar LED como fuente de luz porque LEDs comerciales estándar no lograr suficiente potencia de luz a través de una fibra de base de 9 μm.

El sistema nervioso central consta de varios tipos de neuronas, que tienen diferentes funciones. Cómo funcionan estos tipos de neuronas dentro del circuito neural es una de las preocupaciones principales de la neurociencia. Sin embargo, en muchas regiones del cerebro, ha sido imposible distinguir los tipos neuronales en grabaciones en vivo de actividades eléctricas porque no hay clara diferencia en la señal de punto eléctrico, con algunas excepciones. Los avances recientes en optogenetics han hecho un gran avance1,2. Uso de animales transgénicos que sensibles a la luz opsina (p. ej., channelrhodopsin-2) se expresa en tipos neuronales específicos, llegó a ser posible distinguir los tipos neuronales eficientemente en vivo grabaciones3, 4,5,6. En estos animales se excitan las neuronas con sensibles a la luz opsina dando estímulos de luz durante las grabaciones eléctricas, pero otras neuronas no son. Las neuronas de la opsina-positivo, por lo tanto, se distinguen fácilmente de otros tipos de neurona por sus respuestas a la luz.
En experimentos de optogenetics, es fundamental para entregar la luz en el sitio de grabación. Como un método no invasivo, la luz es dirigida a menudo de la superficie del cerebro. Sin embargo, porque la fuerza de la luz reduce ya que pasa a través de tejido fino del cerebro, es difícil estimular las regiones profundas del cerebro de la superficie del cerebro. Sobre todo, es difícil para la luz de estimulación llegar a las regiones profundas del cerebro cuando la transparencia óptica de la superficie del cerebro es baja, como sucede a menudo con grabaciones de animales despiertos. Experimentos electrofisiológicos a menudo se han realizado en animales anestesiados ya que el movimiento del cuerpo hace ruido en las grabaciones. Como está bien documentado, sin embargo, la anestesia es conocida por cambiar las respuestas neuronales7,8,9,10. Por lo tanto, es necesario utilizar animales despiertos para estudiar las respuestas neuronales sin el efecto artificial de la anestesia. A diferencia de los experimentos con animales anestesiados, las grabaciones electrofisiológicas se realizan después de la recuperación de la cirugía en los experimentos con animales despiertos. Durante el intervalo entre la cirugía y las grabaciones, el exudado del tejido a menudo se acumula en la superficie del cerebro y hace poco la transparencia óptica de la superficie del cerebro.
Aquí, describimos un método para registrar grabaciones de una sola unidad de un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida. En este método, la luz se proporciona mediante el electrodo de cristal de la grabación para que sea posible estimular confiablemente la neurona grabada con luz en regiones profundas del cerebro. Este sistema de optrode por encargo consiste en materiales accesibles y de bajo costo y es fácil de montar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:971px;" width="971">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:140px;">Molecular Device</td>
			<td style="width:393px;">1-HL-U</td>
			<td style="width:191px;">pipette holder for microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ceramic split mating sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>f2.5 mm ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Circuit board spacer</td>
			<td>Teishin Denki</td>
			<td>SPA-320</td>
			<td>f8.0 mm, 20.0 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stereotaxic frame for mice</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-6M-HT</td>
			<td>Stereotaxic instruments for mice</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NA</td>
			<td>Manual manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superbond</td>
			<td>Sun Medical</td>
			<td>M: 204610557</td>
			<td>Dental adhesive resin cement</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Form2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>NA</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kwik-Sil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Low toxicity silicone adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GD-1.5</td>
			<td>OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fiber-optic patch cord</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td>
			<td>Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Connectrized LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>LEDC-1B_FC</td>
			<td>Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA )</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LED driver</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>LEDRV_1CH_1000</td>
			<td>1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrode puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PB-7</td>
			<td>Dual-stage glass micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:140px;">Narishige</td>
			<td style="width:393px;">GD-1.5</td>
			<td style="width:191px;">Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GENTACIN</td>
			<td>MSD CO., Ltd</td>
			<td>185711173</td>
			<td>Antibiotic ointment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Terramycin&#174;-LA</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>G 333</td>
			<td>Oxytetracycline</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>#14548</td>
			<td>VGAT-ChR2 mice</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>2500-0157</td>
			<td>Microelectrode amplifier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetics identification of a neuronal type with a glass optrode in awake mice

Es una preocupación importante en Neurociencia cómo diferente tipos de neuronas funcionan en circuitos neurales. Los avances recientes en optogenetics han permitido la identificación del tipo neuronal en vivo experimentos electrofisiológicos en regiones amplias del cerebro. En experimentos de optogenetics, es fundamental para entregar la luz en el sitio de grabación. Sin embargo, a menudo es difícil entregar la luz del estímulo a las regiones profundas del cerebro de la superficie del cerebro. Sobre todo, es difícil para la luz de estimulación llegar a las regiones profundas del cerebro cuando la transparencia óptica de la superficie del cerebro es baja, como sucede a menudo con grabaciones de animales despiertos. Aquí, describimos un método para registrar respuestas de espiga a la luz de un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida. En este método, la luz se proporciona mediante el electrodo de cristal de la grabación para que sea posible estimular confiablemente la neurona grabada con luz en las regiones profundas del cerebro. Este sistema de optrode por encargo consiste en materiales accesibles y de bajo costo y es fácil de montar.

En la figura 2, se analizaron los efectos del tamaño de la punta y la longitud de las pipetas de vidrio en la potencia de luz en la punta de las pipetas (figura 2A-B). La potencia de luz fue medida por un medidor de potencia óptica a 1 mm de la punta. La longitud total se estableció en 50 ± 2 mm cuando el tamaño de la punta varía, mientras que el tamaño de la punta fue a 2.5 μm cuando la longitud total varió. El vástago de la pipeta de vidrio se estableció en 8 mm. La potencia de luz en la punta entre 3 – 5 mW (media ± SD; Figura 2A: 3,77 ± 0.29 mW, n = 20; Figura 2B: 4,24 ± 0.31 mW, n = 21). El tamaño de la punta (figura 2A) de las pipetas no se correlacionó con la potencia de luz (R 0.1555 de =). La longitud de la pipeta se correlacionó sólo ligeramente con la potencia de luz de una manera negativa (R =-0.2054). Estos resultados sugieren que la punta y la longitud de las pipetas raramente afectan a la energía ligera en la punta. También comprobamos si la cantidad de carga volumen de la solución (10 mM PBS) en las pipetas de cristal afecta a la potencia de luz (figura 2). El volumen de la solución se evaluó por la longitud de la solución en la pipeta. Los datos fueron registrados de 4 pipetas (punta tamaño: 0.25 μm, la longitud total: 50 ± 2 mm, la longitud de la caña: 8 mm). Se encontró que variando el volumen de la solución en la pipeta no afectó la potencia de luz (figura 2).
En la figura 3, muestran las respuestas de spike en el colliculus inferior (IC) de ratones de ChR2 VGAT despiertos (2 – 4 meses). La IC es un centro auditivo en el cerebro medio y consiste en glutamatérgicos y GABAérgicos neuronas12,13, los cuales responden al sonido3,4. En los ratones de IC de VGAT ChR2, las neuronas GABAérgicas específicamente expresan ChR24. En trabajos previos, se demostró que las neuronas GABAérgica y glutamatérgica excitadas o suprimidas, respectivamente, cuando se les dio estímulos luz3,4. En los ratones despiertos, encontramos dos tipos de neuronas (Figura 3A-B). Cuando el estímulo de luz se entrega a través del electrodo de vidrio, evoca respuestas de espiga en algunas neuronas (Figura 3A). En cambio, en otras neuronas, los estímulos de luz suprimen las respuestas punto evocadas por estímulos de sonido (figura 3B). Estos resultados demuestran que una optrode de vidrio puede registrar la actividad de la unidad bien aisladas y confiablemente, estimular las neuronas registradas por la luz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57781/57781fig1.jpg"> Figura 1: Accesorios de soporte y grabación de Optrode. Los paneles (A) y (B) Mostrar el soporte optrode. Panel (A) muestra la estructura de parte del titular de la optrode. (1) se trata de una fractura de cerámica de la manga de acoplamiento. (2) se trata de un tubo de acero inoxidable. (3) se trata de un barril del titular. (4) esta es una arandela de cono. (5) se trata de una tapa de policarbonato. Panel (B) muestra el soporte montado optrode. Panels (C) y (D) Mostrar el post a la medida de cabeza. Panel (C) muestra una vista lateral de la entrada principal. Panel (D) muestra una vista oblicua del post principal. Los dos puestos de cabeza (derecha) están hechos de un espaciador de circuitos (izquierdo). Paneles (E) (F) y (G) muestran el medio tubo de resina por encargo. Los paneles (E) y (F) Mostrar croquis del medio tubo de resina. Panel (E) muestra una vista frontal del medio tubo de resina. Panel (F) muestra una vista lateral del tubo la mitad de la resina. Panel (G) muestra una foto del medio tubo. Los números en los paneles (E) y (F) indique el dibujo las dimensiones en mm <a href="/files/ftp_upload/57781/57781fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57781/57781fig2.jpg"> Figura 2: El efecto de la configuración de las pipetas de vidrio en la potencia de luz en la punta. (A) la punta de tamaño fue trazada contra el poder de la luz. La longitud completa de la pipeta fue fijada a 50 ± 2 mm. La longitud de la caña fue fijada a 8 mm. (B) la longitud de la pipeta se enfrenta a la potencia de luz. El tamaño de la punta se estableció en 0.25 μm. La longitud de la caña fue fijada a 8 mm. (C) este panel muestra el efecto de la carga de volumen de la solución (10 mM PBS) en la potencia de luz. Los datos de 4 pipetas se indican mediante líneas y símbolos diferentes. <a href="/files/ftp_upload/57781/57781fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57781/57781fig3.jpg"> Figura 3 : Las respuestas evocadas de la luz en el IC de despiertas ratones VGAT ChR2. Estímulos (A) la luz (caja azul, 0.03 s) evoca respuestas de spike. Estímulos (B) la luz (caja azul, 0.03 s) suprime las respuestas punto por sonido (caja gris). Los 3 rastros superiores son la respuesta al sonido, y los 3 rastros inferiores son la respuesta al sonido y la luz fueron dados. <a href="/files/ftp_upload/57781/57781fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetics identificación de un tipo Neuronal con un vidrio Optrode en ratones despiertos

Este trabajo presenta un método para realizar un optogenetic de una sola unidad grabación fiable desde un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida.

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.7K vistas.  Kanazawa Medical University. Este trabajo presenta un método para realizar un optogenetic de una sola unidad grabación fiable desde un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida.

Video: Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Investigación

Neurociencias

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Un procedimiento para la implantación de matrices Organizados de Microhilos para grabaciones de una sola unidad en Awake, Comportarse Animales

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

Super-resolución de imagen de Neuronales vesículas de núcleo denso

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.