Unterstützt wurden die Autoren von der Japan Society for Promotion of Science KAKENHI Grant JP16K11200 und 17 H 02223 und der Zuschuss für die Forschung von Kanazawa Medizinische Universität S2016-8 und C2017-3. Wir danken Yuhichi Kuda für seine Unterstützung bei der Aufnahme der Fotos.

Alle Verfahren sind im Einklang mit den Leitprinzipien der physiologischen Gesellschaft von Japan und mit Zustimmung der Animal Care Ausschuss von Kanazawa medizinischen Universität durchgeführt.
(1) Bau von Optrode Glashalter
Hinweis: Um ein Glashalter Optrode zu bauen, eine kommerzielle Elektrodenhalter verwendet (Abbildung 1A).
<ol><li>Ziehen Sie das Stahlrohr für Druckregelung vorsichtig aus dem Faß des Inhabers.</li>
	<li>Durch Bohren, das Loch des Pin-Sitz-Seite in den Lauf des Inhabers zu erweitern. Machen Sie das Loch 3 mm im Durchmesser und 12 mm in der Tiefe.</li>
	<li>Setzen Sie ein Edelstahl-Rohr (Durchmesser 3 mm, 0,5 mm dick und 8 mm Länge; Abbildung 1A ( 2) in das Loch.</li>
	<li>Legen Sie eine Keramik Paarung Hülse für ⌀2.5 mm Ferrulen (Abbildung 1A1) in das Loch aufgeteilt.</li>
	<li>Befestigen Sie den Lauf des elektrodenhalters zu einem L-förmigen Falz mit Epoxy-Kleber.</li>
	<li>Machen Sie die Löcher (3 mm im Durchmesser) in den Falz und an einem Manipulator mit Schrauben befestigen.</li>
</ol>2. Leiter Post Installation
<ol><li>Bereiten Sie einen speziell angefertigten Kopf Beitrag gemacht der eine Leiterplatte Abstandhalter vor. Machen Sie den säulenförmigen Leiterplatte Abstandhalter in Form eines quaderförmigen mit einer Fräse und schneiden Sie es in 2 Kopf stellen mit einer Säge (Abbildung 1 b). Glätten Sie die Unterseite der Kopf Post mit einer Fräse.</li>
	<li>Bereiten Sie die transgenen Tieres, in denen eine lichtempfindliche Opsin in ein bestimmtes Neuron-Typ für die Studie zum Ausdruck kommt. In dieser Arbeit wird die transgenen Maus (VGAT-ChR2 Mäuse) in der hemmenden Neuronen Channelrhodopsin-2 (ChR2)11 Ausdrücken verwendet.</li>
	<li>Betäuben Sie das Tier mit einer Mischung von 0,3 mg/kg Medetomidine, 4,0 mg/kg Midazolam und 5,0 mg/kg Butorphanol durch intraperitoneale Verwaltung. Um zu bestätigen, dass das Tier vollständig betäubt ist, testen Sie seine Reaktionen um die Rute einklemmen.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einem stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen. Sauberen pad der stereotaktischen Rahmen und die Heizung mit 70 % Alkohol im voraus. Stellen Sie die Zähne in das Loch von der Snack-Bar, und ziehen Sie die Nase Spannbacke leicht an. Befestigen Sie beide Seiten des Kopfes mit Ohr-Stangen. Wenn der Kopf richtig durch die Ohr-Balken befestigt ist, ziehen Sie die Nase Spannbacke an. Anwenden einer ophthalmologischen Salbe für die Augen.</li>
	<li>Rasieren Sie die Kopfhaut mit einer kleinen Schere und Reinigen der Kopfhaut mit einem Wattestäbchen von Chlorhexidin Gluconat. Sterilisieren Sie vor der Operation alles, was, die der chirurgischen Instrumente und einen Kopf mit Autoklav (121 ° C, 15 min Posten).</li>
	<li>Die Kopfhaut entlang der Mittellinie mit einer Schere schneiden und zur Seite schieben. Den Schnitt von der Rückseite des Kopfes, der Augen (ca. 20 mm) zu machen. Entfernen Sie das Periost mit einem Wattestäbchen in 70 % Alkohol getaucht und trocknen Sie den Schädel.</li>
	<li>Legen Sie die Kopf Post auf der Manipulator. Positionieren Sie den Kopf Pfosten flach auf den Schädel um die Bregma mit der Manipulator.</li>
	<li>Mischen Sie das Monomer (4 Tropfen), Katalysator (1 Tropfen) und Polymer (1 kleiner Löffel) dental Zement auf einen kleinen Teller, der vorher im Kühlschrank gekühlt wird. Dental Zement (unter 1 g) legte die frontalen und parietalen Knochen des Schädels, die Kopf Post an den Schädel zu beheben.</li>
	<li>Nach der zahnärztliche Zement hart wird, entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen. Setzen Sie eine antibiotische Salbe auf die Haut. Spritzen Sie Medetomidine Antagonist (0,3 mg/kg) und Antibiotika (Oxytetracycline; 20 mg/kg). Platzieren überwachen Sie die Maus auf das Wärmekissen in einem Käfig zu, bis er erwacht und schicken Sie es an einem Gehäuse-Käfig.</li>
	<li>Haus das Tier in einem einzelnen Gehäuse-Käfig mit einigen Bereicherung Gerät. Ändern der tierischen Papiers Betten täglich, um den Käfig sauber zu halten und eine Infektion verhindern. Überprüfen Sie sorgfältig, ob das Tier Anzeichen von Unwohlsein zeigt. Soweit Lidocain auf die Wunde Schmerzen vermutet wird. Verwalten Meloxicam oder Carprofen einmal alle 24 h für 48 h nach beide Leiter-Installation und Kraniotomie Operationen Post. Die lokale Lidocain zusätzlich gegeben werden kann, wenn die NSAR nicht ausreicht.
</li>
</ol>(3) Akklimatisierung
<ol><li>Akklimatisieren Sie (mindestens) zwei Tage nach der Erholung von der Narkose, die Tiere in den Kopf fixiert Zustand in der Aufnahme-Kammer. Führen Sie die Akklimatisierung Sitzungen für mindestens 5 Tage.</li>
	<li>Während der Akklimatisierung-Sessions legen Sie das Tier in der Aufnahme-Kammer mit dem Kopf Beitrag an einer speziell angefertigten Klemme befestigt. Während der Sitzung, um Bewegung zu begrenzen Abdeckung des Körpers mit einem maßgeschneiderten Harz Halbschlauch (Abbildung 1), machte mit einem 3D-Drucker. Hinweis: Am 1. Tag, sollte die Akklimatisierung Session 5 min lang sein. Es wird dann täglich um 10, 20, 40 und 60 min für Tage 2, 3, 4 und 5, bzw. erhöht.</li>
	<li>Am Ende jeder Sitzung belohnen Sie dem Tier essen. Wenn das Tier ständig während der Akklimatisierung kämpft, beenden Sie die Sitzung.</li>
</ol>4. Kraniotomie
Hinweis: Nach der Akklimatisierung ist eine Kraniotomie über die Gehirnregion für die Aufnahme gemacht. Die Kraniotomie erfolgt in der stereotaktischen Rahmen unter Narkose, da mit dem Kopf Installation Posten. Die Post-operative Verfahren ist das gleiche wie die Leiter Installation Post.
<ol><li>Reinigen Sie vor der Kraniotomie den Schädel mit einem Wattestäbchen mit Chlorhexidin Gluconat und 70 % Alkohol.</li>
	<li>Kratzen Sie sorgfältig den Schädel über die Aufnahme-Website mit einem Zahnbohrer. Sobald die Knochen dünn genug ist, schneiden Sie es mit der Spitze des Skalpells und entfernen Sie es.</li>
	<li>Dental Zement um der exponierten Region gelegt, um den Schädel zu stärken.</li>
	<li>Decken Sie die exponierte Hirnareal mit Silikonkleber, nachdem der dental Zement hart wird. Nach der Operation verläuft wie in Schritt 2.8 beschrieben.</li>
</ol>5. elektrophysiologische Aufnahme
<ol><li>Lassen Sie das Tier, für mindestens 1 Tag nach der Kraniotomie vor der Durchführung der elektrophysiologischen Aufnahme erholen. Legen Sie das Tier in der Aufnahme-Kammer, in der gleichen Weise, die es während der Akklimatisierung-Sessions gemacht wurde, wenn die Aufnahme beginnt.</li>
	<li>Glaspipetten aus Borosilikatglas Kapillaren zu machen (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm 90,0 mm lang) auf eine Elektrode Puller gezogen. Ihr Tipp-Durchmesser beträgt 2 – 3 µm, und ihr Widerstand ist 4 – 6 MΩ, wenn sie mit 10 mM PBS gefüllt sind. Die Länge der Elektrode ist 40-50 mm. In manchen Aufnahmen ergänzt, 2 % Neurobiotin 10 mM PBS.</li>
	<li>Die maßgeschneiderte Optrode Halter die gefüllten Glaspipette zuordnen.</li>
	<li>Die Glaspipette Ag-Cl beschichtet Silberdraht (0,2 mm im Durchmesser) umgesetzt. Verbinden Sie den Silberdraht mit ein Stift über eine dünne beschichtete Elektrokabel. Verbinden Sie die Pin mit der Headstage des Verstärkers Aufnahme.</li>
	<li>Die LWL-Patchkabel verbinden (Kern = 960 µm Verkleidung = 1.000 µm, NA = 0,63) mit einem Zirkonia zwinge (OD = 2,5 mm) nach der Paarung Hülse auf dem Optrode Halter Split. Drücken Sie die Patch-Kabel in die Hülse, bis die Spitze der zwinge am Ende die Glaspipette Kontakte. Die Patch-Kabel liefert das Licht (Wellenlänge = 465 nm) von LED. Das LED-Licht wird durch ein Einkanal-LED-Treiber gesteuert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Silikonkleber über die Kraniotomie. Put angewärmte Kochsalzlösung (38 ° C) auf der Oberfläche des Gehirns in regelmäßigen Abständen zu verhindern, dass die Gehirn Oberfläche Trocknen während der Aufnahme-Session. Falls erforderlich, entfernen Sie die Dura mit scharfen Pinzette.</li>
	<li>Legen Sie die Glaselektrode in das Hirngewebe mit einem Manipulator. Der elektrodenwiderstand zu überwachen, wenn sie eingefügt wird. Die Elektrode zu ersetzen, wenn der Widerstand niedriger ist als erwartet, da die Elektrodenspitze möglicherweise beschädigt. Suchen Sie in einer Tiefe von Interesse und isolieren Sie die Einheit Spikes durch die Tiefe in 2 bis 5 µm Schritten anpassen.</li>
	<li>Nachdem die Einheit isoliert ist, liefern Sie die LED-Leuchte und beobachten Sie die Reaktion auf die lichtreize.</li>
	<li>Notieren Sie die neuronalen Aktivitäten nach der Identifizierung der Zelltypen. Führen Sie die Aufnahmen für 2 – 3 h. Erfolgt die Aufnahme an aufeinander folgenden Tagen (maximal 2 Tage), decken Sie die Kraniotomie mit Silikonkleber. Wenn die Aufnahme beendet ist, und das Tier geopfert, die Kopf Post abrufen und steckte es in Aceton zu waschen und wiederverwenden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neural+circuits.">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li><li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons:+triumphs+and+challenges.">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).</li><li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. 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V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation.">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li><li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons.">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug in den Neurowissenschaften geworden. Es ist verwendet worden, für bestimmtes Neuron Typen in Vivo zu identifizieren sowie die Aktivitäten der spezifischen neuronalen Bahnen zu manipulieren. Die Klärung der neuronalen Aktivitäten der verschiedenen neuronalen Arten fördert das Verständnis des Mechanismus der neuronalen Schaltkreise. Hier haben wir eine Methode, um das Licht um die Aufnahme-Site durch eine Glaselektrode im IC von wach VGAT-ChR2 Mäusen zu liefern.
Es gibt mehrere wichtige Schritte in der beschriebenen Methode. Erstens ist es erforderlich, Tiere mit einem ausreichenden und spezifischen Ausdruck des Opsins in den Ziel-Neuronen zu nutzen. Um die Reaktionen auf Licht mit den extrazellulären Aufnahmen zu identifizieren, ist es notwendig, dass die Aktivierung der Opsin die Spikes in den Ziel-Neuronen evoziert. In einigen transgenen Stämmen ist es möglich, dass die Transgen-Expression in den Neuronen in jungen Tieren14niedrig, und möglicherweise gibt es ein Mindestalter für das Experiment. Darüber hinaus ist es möglicherweise erforderlich, um sicherzustellen, dass die Reaktionen auf die lichtreize spezifisch für die Zieltypen Neuron (z.B. Immunohistochemistry) sind weitere Experimente durchzuführen. Wenn das Ziel Neuron exzitatorischen ist, wäre es notwendig, die direkt evozierten Antworten aus den synaptisch evozierten Antworten zu unterscheiden, die durch Schwellwerte die Latenz der Antwort getan werden könnte. Zweitens ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Hirngewebe so sauber wie möglich ist. Eine Erhaltung der Sauberkeit ist vor allem erforderlich, um zu verhindern, dass eine Blutung während der Kraniotomie und die Aufnahmen. Außerdem sollte die Oberfläche des Gehirns Trocknung nach der Kraniotomie durch abdecken der Oberfläche dicht mit Silikonkleber gehindert werden.
Um das Licht effizient aus der Elektrodenspitze liefern, ist es wichtig, den Verlust in den optischen Pfad zu reduzieren. In unserer Konfiguration der Optrode sinkt die Lichtleistung verzehnfacht durch den Elektrodenhalter: die Lichtleistung beträgt 45 mW am Ende des LWL-Patchkabel, während es 3 bis 5 mW an der Spitze der Glaspipette ist. Wie in den Ergebnissen angezeigt, wurde der Werkzeugspitze ändern und die volle Länge die Lichtleistung an der Spitze (Abbildung 2) nicht berührt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die leichte Dämpfung unabhängig von der Konfiguration der Glaspipette relativ stabil war. Diese leichte Dämpfung spielte keine Rolle bei der Erfassung von IC Neuronen im VGAT-ChR2 Mäuse, weil wir bestätigt haben, dass man Licht aktivierte Spitzen in den ventralen Rand (2 mm Tiefe) des IC aufnehmen konnte, obwohl es, in anderen Aufnahme-Konfigurationen relevant ist. Es wäre schwer, die leichte Dämpfung drastisch zu reduzieren, aber möglicherweise gibt es Verbesserungsmöglichkeiten. Erstens ist es Quarz anstelle einer Borosilikatglas als eine Elektrode Pipette verwenden wirksam. Es ist bekannt, dass Quarz Leitfähigkeit, besseres Licht hat, so dass es den Lichtverlust durch die Elektrode15reduzieren kann. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Politur des Ende der Pipette Lichtverlust an der Kontaktfläche zwischen der Pipette und Patchkabel15reduziert. Wenn die Verbesserung in der leichten Dämpfung nicht genug ist, wäre es wirksame Verwendung eines Lasers anstelle von LED, obwohl Laser mehr kostet als geführt.
Einer der Vorteile der Glas-Pipette-Elektrode ist, dass man histologische Verfahren durchführen, indem die Abfüllung Tracer oder Vektoren hinzufügen kann. Die histologischen Verfahren werden die elektrophysiologischen Daten viel nützliche Informationen (die Lage der Aufnahme), die Morphologie der aufgezeichneten Neuron usw.hinzufügen. Darüber hinaus wurde berichtet, dass es möglich ist, führen Sie pharmakologische Untersuchungen mit der Glaselektrode mit Blocker in der Füllung Lösung15. Im Gegensatz zu diesen Vorteilen ist die Begrenzung der Pipette Glaselektrode, dass es aus mehreren isolierten Einheiten aufnehmen kann. Um mehrere Aufnahmen zu erreichen, kann es möglich, einen tuberkuloseinfektion Draht in die Glaspipette statt einen einzelnen Draht Ag-Cl beschichtet sein. In diesem Fall wäre es notwendig, verwenden Sie eine Pipette mit einer größeren Spitze (30-60 µm, der typische Werkzeugspitze Ändern einer Tetrode) und lassen sich zum Jahresende ab, von der Spitze der Pipette.
Während bisher gemeldeten Optrodes oft, komplexe Fertigung16,17 erforderlich, entwickelten Magee und seinen Kollegen ein Optrode standard glaspipetten mit, wie wir mit den Optrode18entwickelt. In ihrer Methode stecken sie eine dünne Glasfaser die Pipette, das Licht zu liefern. Um die Faser dünn genug, um den Schaft der Pipette legen machen, geätzt sie 125 µm Verkleidung Faser mit 9 µm Kern auf einen Durchmesser von 8 – 10 µm an der Spitze. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es auch für die gebogene Pipette gelten würde, die oft für Iontophorese verwendet wird. Allerdings wäre es schwer zu LED als Lichtquelle zu verwenden, da kommerzielle standard LEDs nicht ausreichender Lichtleistung über eine 9 µm Kern Faser erreichen würde.

Das zentrale Nervensystem besteht aus verschiedenen Arten von Neuronen, die unterschiedliche Funktionen haben. Wie diese verschiedenen Arten von Neuronen innerhalb der neuronalen Schaltung funktionieren, ist eines der wichtigsten Anliegen in den Neurowissenschaften. In vielen Regionen des Gehirns war es jedoch unmöglich, die neuronalen Typen in in-Vivo -Aufnahmen der elektrischen Aktivitäten zu unterscheiden, denn es keinen klaren Unterschied in der elektrischen Spike-Signal selbst, mit einigen Ausnahmen gibt. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben einen Durchbruch1,2. Mit transgenen Tieren in der lichtempfindlichen Opsin (z.B.Channelrhodopsin-2) in bestimmten neuronalen Arten ausgedrückt ist, wurde es möglich, die neuronalen Arten effizient in in Vivo Aufnahmen3, 4,5,6. Bei diesen Tieren die Neuronen mit lichtempfindlichen Opsin sind durch lichtreize während der elektrische Aufnahmen geben aufgeregt, aber anderen Neuronen sind nicht. Opsin-positiven Neuronen, zeichnen daher leicht von anderen Neuron durch ihre Reaktionen auf Licht.
Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Als nicht-invasive Methode richtet das Licht oft von Oberfläche des Gehirns. Jedoch weil das Licht Stärke verringert während es Hirngewebe durchläuft, ist es schwer, die tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns zu stimulieren. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Elektrophysiologische Experimente wurden oft an narkotisierten Tieren durchgeführt, weil die Bewegung des Körpers Lärm in den Aufnahmen verursacht. Wie gut dokumentiert ist, ist jedoch Anästhesie bekannt, um die neuronalen Antworten7,8,9,10zu ändern. Daher ist es notwendig, wach Tiere zu nutzen, um neuronale Reaktionen ohne künstliche Effekte der Narkose zu studieren. Im Gegensatz zu den Experimenten mit narkotisierten Tieren werden die elektrophysiologischen Aufnahmen nach der Erholung von der Operation in den Experimenten mit wach Tieren durchgeführt. Während der Zeit zwischen der Operation und die Aufnahmen Gewebe Exsudat oft sammelt sich auf der Oberfläche des Gehirns und macht die optische Transparenz von der Oberfläche des Gehirns gering.
Hier beschreiben wir eine Methode um Monoblock-Aufnahmen aus einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:971px;" width="971">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:140px;">Molecular Device</td>
			<td style="width:393px;">1-HL-U</td>
			<td style="width:191px;">pipette holder for microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ceramic split mating sleeve</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>f2.5 mm ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Circuit board spacer</td>
			<td>Teishin Denki</td>
			<td>SPA-320</td>
			<td>f8.0 mm, 20.0 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stereotaxic frame for mice</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-6M-HT</td>
			<td>Stereotaxic instruments for mice</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NA</td>
			<td>Manual manipulator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superbond</td>
			<td>Sun Medical</td>
			<td>M: 204610557</td>
			<td>Dental adhesive resin cement</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Form2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>NA</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kwik-Sil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Low toxicity silicone adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GD-1.5</td>
			<td>OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fiber-optic patch cord</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td>
			<td>Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Connectrized LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>LEDC-1B_FC</td>
			<td>Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA )</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LED driver</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>LEDRV_1CH_1000</td>
			<td>1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrode puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PB-7</td>
			<td>Dual-stage glass micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:140px;">Narishige</td>
			<td style="width:393px;">GD-1.5</td>
			<td style="width:191px;">Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GENTACIN</td>
			<td>MSD CO., Ltd</td>
			<td>185711173</td>
			<td>Antibiotic ointment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Terramycin&#174;-LA</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>G 333</td>
			<td>Oxytetracycline</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>#14548</td>
			<td>VGAT-ChR2 mice</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>2500-0157</td>
			<td>Microelectrode amplifier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetics identification of a neuronal type with a glass optrode in awake mice

Es ist ein wichtiges Anliegen in den Neurowissenschaften wie verschiedene Arten von Neuronen arbeiten auf neuronale Schaltkreise. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben die Identifizierung des neuronalen in in Vivo elektrophysiologischer Experimente in breiten Hirnregionen aktiviert. Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Jedoch ist es oft schwer zu Anregung Licht an den tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns liefern. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Hier beschreiben wir eine Methode um Spike Antworten auf das Licht von einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in den tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.

In Abbildung 2untersuchten wir die Auswirkungen der Werkzeugspitze ändern und die Länge der glaspipetten auf die Lichtleistung an der Spitze der Pipetten (Abbildung 2A-B). Die Lichtleistung wurde durch eine optische Leistungsmesser platziert 1 mm von der Spitze gemessen. Die volle Länge wurde auf 50 ± 2 mm eingestellt, wenn die Spitzengröße variiert während der Werkzeugspitze ändern bis 2,5 µm festgelegt wurde, wenn die volle Länge abwechslungsreich. Der Schaft der Glaspipette wurde auf 8 mm festgelegt. Die Lichtleistung an der Spitze reichte von 3 bis 5 mW (Mittelwert ± SD; Abbildung 2A: 3,77 ± 0,29 mW, n = 20; Abbildung 2 b: 4,24 ± 0,31 mW, n = 21). Der Werkzeugspitze ändern (Abbildung 2A) der Pipetten war kaum korreliert mit der Lichtleistung (R = 0.1555). Die Länge der Pipette war nur leicht mit der Lichtleistung in einer negativen Weise korreliert (R =-0.2054). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Spitze und die Länge der Pipetten selten die Lichtleistung an der Spitze beeinflussen. Wir haben uns auch wenn die Größe der Belastung der Volumen der Lösung (10 mM PBS) in die glaspipetten wirkt sich auf die Lichtleistung (Abbildung 2). Das Volumen der Lösung wurde anhand der Länge der Lösung in die Pipette. Die Daten wurden aus 4 Pipetten (Düsengröße: 0,25 µm, die volle Länge: 50 ± 2 mm, die Länge des Schaftes: 8 mm). Wir fanden, dass variiert das Volumen der Lösung in die Pipette keinen Einfluss auf die Lichtleistung (Abbildung 2).
In Abbildung 3zeigen wir die Spike-Antworten in der minderwertigen Colliculus (IC) wach VGAT-ChR2 Mäuse (2 – 4 Monate alt) aufgezeichnet. Der IC ist ein Hörzentrum im Mittelhirn und besteht aus glutamatergen und Gabaergen Neuronen12,13, beide reagieren auf Ton3,4. Bei den Mäusen IC VGAT-ChR2 express Gabaergen Neuronen speziell ChR24. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass die Gabaerge und glutamatergen Neuronen waren aufgeregt oder unterdrückt, bzw. Wenn sie lichtreize3,4gegeben wurden. In den Wachen-Mäusen fanden wir beide Arten von Neuronen (Abb. 3A-B). Wenn der Lichtreiz durch die Glaselektrode geliefert wird, erwähnt es Spike Reaktionen in einigen Neuronen (Abb. 3A). Im Gegensatz dazu unterdrückt die lichtreize in anderen Neuronen, die Spike-Reaktionen hervorgerufen durch Ton Reize (Abb. 3 b). Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Glas Optrode gut isolierte Einheit Aktivität aufzuzeichnen und zuverlässig die aufgezeichneten Neuronen durch Licht stimulieren kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57781/57781fig1.jpg"> Abbildung 1: Optrode Halter und Aufnahme Zubehör. Seitenteile (A) und (B) zeigen die Optrode Halter. (A) zeigt die Struktur des Inhabers Optrode. (1) Dies ist eine keramische Split Paarung Ärmel. (2) Dies ist ein Edelstahl-Rohr. (3) Dies ist ein Fass des Inhabers. (4) Dies ist ein Kegel-Unterlegscheibe. (5) Dies ist ein Polycarbonat-Abdeckung. (B) zeigt den montierten Optrode Halter. Panels (C) und (D) zeigen die speziell angefertigten Kopf Post. Feld (C) zeigt eine Seitenansicht der Kopf Post. (D) zeigt eine Schrägansicht der Kopf Post. Die beiden Kopf stellen (rechts) bestehen aus einer Leiterplatte Abstandhalter (links). Platten (E), (F) und (G) die maßgeschneiderte Harz Halbschlauch zeigen. Platten (E) und (F) zeigen den Harz Halbschlauch Maßzeichnungen. Platte (E) zeigt eine Vorderansicht der Harz eine halbe Tube. Panel (F) zeigt eine Seitenansicht der Harz eine halbe Tube. (G) zeigt ein Foto des halben Rohres. Die Zahlen in Platten (E) und (F), geben Sie die Zeichnung Abmessungen in mm. <a href="/files/ftp_upload/57781/57781fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57781/57781fig2.jpg"> Abbildung 2: Die Wirkung der Konfiguration der glaspipetten auf die Lichtleistung an der Spitze. (A) die Spitze der Größe wurde aufgetragen gegen die Lichtleistung. Die volle Länge der Pipette wurde gegründet um 50 ± 2 mm. Die Länge des Schaftes wurde bis 8 mm. (B) festgelegt, die die Länge der Pipette, gegen die Lichtleistung aufgetragen wurde. Die Spitzengröße wurde auf 0,25 µm festgelegt. Die Länge des Schaftes einstellen bis 8 mm. (C) das Panel zeigt die Auswirkung der Belastung Volumen der Lösung (10 mM PBS) auf die Lichtleistung. Die Daten aus 4 Pipetten werden durch verschiedene Symbole und Linien angezeigt. <a href="/files/ftp_upload/57781/57781fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57781/57781fig3.jpg"> Abbildung 3 : Die Licht-evozierten Antworten im IC wach VGAT-ChR2 Mäuse. (A) das Licht Reize (blaue Box, 0,03 s) Spike Reaktionen hervorgerufen. (B) das Licht Reize (blaue Box, 0,03 s) unterdrückt die Spike-Reaktionen hervorgerufen durch Ton (graues Feld). Die oberen 3 Spuren sind die Antwort auf Klang, und die unteren 3 Spuren sind die Antwort, wenn Ton und Licht erhielten. <a href="/files/ftp_upload/57781/57781fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse

Diese Arbeit stellt eine Methode, um eine optogenetische Monoblock-Aufnahme zuverlässig aus einem wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode durchführen.

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.7K Aufrufe.  Kanazawa Medical University. Diese Arbeit stellt eine Methode, um eine optogenetische Monoblock-Aufnahme zuverlässig aus einem wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode durchführen.

Serie: Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Ein Verfahren für die Implantation von Mikrodrähte Organisierte Arrays für Einzel-Einheit Recordings in Awake, Behaving Tiere

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Die extrazelluläre Aufnahme neuronaler Aktivität in Kombination mit Microiontophoretic Anwendung von neuroaktiven Substanzen in Awake Mäuse

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.