Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional para el General médico Ciencia (NIGMS) (5605100122001), un componente de los institutos nacionales de salud (NIH), así como la Universidad de Nebraska en Kearney (UNK) verano estudiante investigación programa (SSRP) y UNK Beca de pregrado (URF).

1. preparación de colorantes, Buffers y Gel de la agarosa
<ol><li>
Preparar las siguientes soluciones para la tinción de ADN o la digestión de ADN teñido.
	<ol>
<li>Preparar 1 x TE (Tris-HCl y etilendiaminotetracético ácido; Tampón EDTA) con 10 mM Tris-HCl y 1 mM EDTA en un cilindro graduado o un matraz aforado. Almacenar a temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
		<li>Hacer alícuotas de cada tinte: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabla 1). Pipetear 4 μL de colorante de 1 mM en un ámbar oscuro o negro tubo de 1,5 mL y añadir 36 μl de TE 1 x, mezclar con la pipeta; Esta concentración hace que una solución de tinte de 100 μm (total 40 μL). Completar este paso para cada colorante. Almacenar a 4 ° C. Nota: Evite exponer el tinte a la luz para evitar fotoblanqueo o degradación del colorante.</li>
		<li>Preparar el tampón 1 usando 10 mM Bis-Tris-propano-HCl 10 mM MgCl2y 100 μg/mL albúmina sérica bovina (BSA). Preparar el tampón 2 utilizando 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2y 100 μg/mL de BSA. Preparar el tampón 3 utilizando 50 mM acetato de potasio, 20 mM Tris acetato, acetato de magnesio de 10 m m y 100 μg/mL BSA. Cada enzima requiere uno de estos búferes específicos para funcionar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar las siguientes soluciones para la electroforesis del gel.
	<ol>
<li>Hacer 6 x carga del tinte azul, mediante la combinación de bromofenol 0.25% 0.25% xileno cyanol, 15% Ficoll en dH2O. almacén a temperatura ambiente.</li>
		<li>Para hacer una agarosa 0.7% gel, pesar 0,07 g de agarosa de temperatura (HGT) gelificación alta en un matraz Erlenmeyer, añadir 100 mL de buffer de x TAE 1 y coloque un vaso invertido sobre el matraz.<ol>
<li>Calentar la solución en una placa caliente hasta que las burbujas empiezan a formar en la parte inferior del matraz y flotador en la parte superior.</li>
			<li>Retirar la solución de la placa caliente, deje que la solución se enfríe hasta que el frasco puede ser tocado con la mano desnuda y luego Vierta el gel en un molde de gel de 24,5 x 21,8 cm con un peine de gel para crear pozos.</li>
			<li>Elimine las burbujas cerca del peine o en la superficie del gel por estallido con una punta de pipeta y permita que el gel se solidifique durante al menos 15 minutos. Esta puede almacenarse en un refrigerador (4 ° C) envuelto en plástico durante 1 semana prevenir el secado del gel o contaminación. Para obtener más información sobre cómo ejecutar un gel consulte Lee et al. 33 . Nota: Use un peine de gel con 30 pozos individuales. Cada uno debe ser 4,5 mm de ancho con una profundidad de 2 mm. La altura del pozo dependerá de la cantidad de gel en la caja.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar 1 buffer x TAE (Tris - acetato - EDTA) utilizando 40 mM Tris-HCl, ácido acético de 20 mM y 1 mM EDTA. Almacenar a temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de DNA manchada
<ol><li>
Lambda DNA (300-800 ng) con alícuotas diferentes de tintes de la mancha. Cada tinte (tabla 1) tendrá seis diferentes concentraciones probadas, para un total de 48 reacciones por enzima de la restricción. El siguiente proceso describe un conjunto para arriba para la 1 reacción (figura 1).
	<ol>
<li>Diluir lambda DNA usando TE de x 1 a 100 ng / μl. almacenar a 4 ° C. Hacer una solución con un volumen total de 300 μl.</li>
		<li>Mancha de lambda unmethylated DNA. Para cada banda de la recopilación, estimación de 75-100 ng/banda. Añadir cantidades apropiadas de colorantes para producir concentraciones de 1,9 μm μm 3,8, 19,4 μm, 32.2 μm, μm 48.3, 63.5 μm / 100 ng de ADN.</li>
		<li>Incubar durante una noche (15 h - 18 h) a 4 ° C.</li>
		<li>Dejar uno reacción de la mancha para actuar como un control25. Nota: Use unmethylated DNA por la reacción de digestión. Enzimas sensibles metilación no cortar regiones metiladas en el ADN y le dará un aspecto de una digestión incompleta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación del ensayo enzimático de la restricción
<ol><li>
Resumen de teñido DNA con una enzima de restricción para determinar si esa enzima puede digerir DNA prestained (figura 1).
	<ol>
<li>Al día siguiente, añadir 20 U del enzima de restricción, 3 μl del tampón apropiado (tabla 2) y agua destilado, esterilizado y filtrado para un total de 30 μl. Para cada reacción de la enzima, elegir el tampón con la más alta eficiencia de corte, que se puede encontrar en la web del fabricante.</li>
		<li>Lugar las reacciones en un baño de agua a la temperatura de la actividad enzimática óptima, listado en la tabla 2 para las 6 enzimas utilizadas en Maschmann et al., para 2-4 h (tabla 2)25.</li>
		<li>Detener la reacción agregando 2 μl de pH de EDTA de 0.5 M 8.0.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting tinción de DNA en un Gel de agarosa
<ol><li>Desmoldar los lados 24,5 x 21,8 cm gel (paso 1.2.2) y coloque el gel en la caja de la electroforesis de gel. Vierta 2,5 L de tampón de x TAE 1 en el cuadro. Retire cuidadosamente el peine del gel del gel, por lo que los pozos son accesibles33.</li>
	<li>Pipetear las reacciones de la enzima de la restricción en una película de plástico y combinar cada reacción con 6 x carga del tinte. Para cada solución de reacción, añadir 1 μl de 6 x carga colorante por 5 a 6 μl de solución de ADN (1 x). Luego pipetear las reacciones (que contiene el tinte de la carga, < 18 μL) en los pocillos.</li>
	<li>Mezclar 1 μl de escalera de 1 kb, 9 μl de TE 1 x y 2 μl de 6 x carga del tinte. Cargar la solución en los pozos que flanquean las otras soluciones.</li>
	<li>Cubrir el gel caja con tela o papel negro o azul oscuro. Conecte la caja del gel a una fuente de alimentación la fuente de alimentación a 30 V y ejecutar toda la noche (15-20 h). Apague las luces cuando el gel esté funcionando, para evitar fotorrotura de la DNA etiquetada.</li>
	<li>A la mañana siguiente apague la fuente de alimentación. Tomar el gel usando la bandeja y transferir a un envase con 45 bromuro de etidio μl y 1 L de tampón de x TAE 1. Almacenar el envase a temperatura ambiente en la oscuridad o cubierta en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Mancha de gel que por menos de 45 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: Utilizar bromuro de etidio con guantes y gafas de seguridad. Al limpiar el contenedor con solución de bromuro de etidio y tirar el gel, consulte sus pautas de disposición de los Estados para determinar cómo tratar con bromuro de etidio utilizado; Además, otras manchas pueden utilizarse en lugar de bromuro de etidio.</li>
</ol>5. la proyección de imagen del Gel de agarosa
<ol><li>Coloque el gel sobre un transiluminador de luz azul, que emite la máxima potencia de luz entre 400-500 nm. Tomar fotos con la cámara acoplada a la estación. PRECAUCIÓN: Asegúrese de que utilice la cubierta para el iluminador y ponerse gafas de protección antes de encender la fuente de luz. Nota: Este paso puede también completarse usando cualquier fuente de luz UV o el explorador de gel estándar.</li>
	<li>Ver las fotos de ImageJ arrastrando el archivo a la barra de estado de ImageJ y aparecerá la imagen.</li>
	<li>Determinar la tasa de digestión para el experimento comparando las bandas en el gel con el patrón esperado en silico gel. Para determinar la tasa de digestión, el número de bandas experimentales se divide por el número esperado de DNA bandas24,25. Si el patrón de bandas ADN digerido experimental tiene el patrón esperado, la tasa de digestión es 1. Si el patrón tiene fragmentos más de lo esperado, la tasa de digestión es mayor que 1. Si el patrón tiene menos fragmentos de lo esperado, la tasa de digestión es menor que uno.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para digerir el ADN etiquetado fluorescente (figura 1), se requieren una serie de pasos. En primer lugar, ADN se tiñe con un fluorocromo durante la noche. ADN puede incubarse con dímeros de Cianina por un período más corto de tiempo; sin embargo, Carlsson et al encontraron que ADN creado bandas doble para cada tamaño de ADN debido a la tinción incompleta20. Para remediar esto, el ADN puede mancharse durante la noche para evitar que bandas dobles. Este es un paso crítico en el protocolo. Si el tinte no se incuba durante un tiempo suficientemente largo, el ADN de tinte puede no estar en equilibrio y dará un patrón de bandas doble. Si esto ocurre, deje que la mezcla de ADN-tinte se equilibre durante un largo periodo de tiempo.
A continuación, una enzima de restricción es añade a la mezcla de ADN-tinte y digerida por 2-4 h a una temperatura específica para cada enzima. El ADN debe ser unmethylated enzimas sensibles de metilación. Si no es así, ADN metilado inhiben la enzima de la restricción de cortar ADN en regiones metiladas. Además, la reacción debe ser incubada en el buffer correcto y la temperatura para la enzima. Cada enzima tiene una lista de los amortiguadores y la actividad enzimática en cada búfer. Elegir el tampón con la actividad enzimática al 100%, si es posible. En cuanto a la temperatura, asegúrese de que se Incube en la temperatura correcta. Si no es así, puede causar la enzima pierde actividad a desnaturalizar si la temperatura es demasiado alta. EDTA se utiliza para detener la reacción. La empresa donde las enzimas fueron compradas tendrá una tabla con las temperaturas óptimas y condiciones de buffer para esa enzima. Si el control no da el número correcto de las bandas en los pesos moleculares correctos, revise para ver si la enzima está vencida, aumentar el tiempo de incubación, o comprobar para asegurarse de que la temperatura es correcta para esa enzima.
Una vez completada la reacción, se pueden cargar las muestras en un gel. En primer lugar, un gel se carga en el envase de gel y sumergido en buffer de x TAE 1. A continuación, el ADN digerido se mezcla con el tinte de carga y se carga la solución en los pozos del gel. La tapa se deslice más y los cables están conectados a la caja de gel. Un papel oscuro, que es grabado juntos, se coloca sobre la tapa que cubre la tapa y cuelgue de los lados. Otro paso fundamental es que las muestras estén protegidas de la luz en todo momento, especialmente mientras se está ejecutando el gel. La alimentación debe ser encendida y apagado las luces de la sala. Con el fin de evitar la fotorrotura de ADN, las muestras son protegidas de la luz todo el tiempo. Si no hay ningún papel oscuro, una tela oscura también puede utilizarse. Si el ADN no se mueve, asegúrese de que los cables estén conectados a la caja y pulsar el pulsador de marcha.
En la mañana, saque el gel de la caja de gel y cargar el gel en un recipiente que contiene bromuro de etidio. Bromuro de etidio nos permite ver las bandas de DNA en el transiluminador de luz azul (figura 2). Otros colorantes pueden usarse en lugar de bromuro de etidio. Una cámara puede montarse sobre el transiluminador de luz azul para capturar imágenes del gel. Dependiendo de la configuración, también se puede utilizar una estación de proyección de imagen.
Este método puede ser utilizado para cualquier tinte que intercala o manchas de ADN, no sólo la serie TOTO. Maschmann et al. modificar una técnica desarrollada por Meng et al. para determinar si fluorescencia ADN podría ser digerido con enzimas de restricción24,25. Esta es la única técnica utilizada para determinar si el ADN previamente manchada afecta enzimas de restricción. Este método se limita a las enzimas de restricción disponibles comercialmente, a menos que un científico tenga acceso a otras enzimas de restricción que no figuran comercialmente. Dependiendo del ADN, la enzima elegida debe tener bastantes bandas y un patrón de bandas de ADN discernible (> 3) para determinar si la molécula de ADN es largo. Además, el ADN debe ser unmethylated si se utilizan enzimas sensibles de metilación. Si el ADN es desnaturalizado, no utilice enzimas sensibles de metilación.
Este método es una manera fácil de usar para determinar si las enzimas de restricción pueden cortar moléculas de ADN en el sitio de reconocimiento teñido con un colorante intercalante sin necesidad de diseño de primers para un sitio determinado corte34. Las futuras aplicaciones de este método sería determinar si las moléculas de un experimento la etiqueta fluorescente completas usando una enzima de restricción y determinación del tamaño de las bandas de ADN de la digestión o para determinar los perfiles de metilación de ADN moléculas. Experimentos futuros también podrían determinar si saltearse las enzimas son afectadas por los colorantes de Cianina u otros tintes fluorescentes.

La serie TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3 y BOBO-3; Tabla 1) se utiliza en una amplia variedad de experimentos donde la visualización de ADN es necesario1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la familia de dímeros de Cianina es ampliamente utilizada debido a su alta afinidad por las moléculas de ADN18,19,20, rendimiento cuántico y sensibilidad. Colorantes de Cianina dímero tienen gran selectividad para la DNA trenzada doble y cuando se intercalan un aumento de 100 a 1000 veces mayor de fluorescencia21. Tintes de pyridinium (YOYO-1, TOTO-1, 3 YOYO y TOTO-3) tienen una menor longitud de onda emisión de su quinolium del tinte (BOBO-1, 1 POPO, BOBO-3 y POPO 3) contrapartes (tabla 1)22. También, la producción de quántum de dímeros de Cianina intercalada en el ADN es alta (0.2 - 0.6)22. Sin embargo, utilizando una enzima para determinar el perfil de metilación de ADN molécula2 o estiramiento23 de una molécula de ADN ya teñida con colorante fluorescente requiere de un método para determinar qué enzimas digieren DNA manchada. Cualquier tipo de colorante que se intercala en el ADN o cualquier enzima que da un patrón discernible del sustrato de ADN se puede utilizar para este método.
Meng et al. en primer lugar determina la tasa de digestión de prestained ADN mediante electroforesis en gel utilizando una variedad de diferentes tintes24. Maschmann et al. profundizó en más profunda para ver a la familia TOTO de tintes. Ambos determinan la tasa de digestión de DNA manchada para ver si ADN teñida con un colorante determinado podría ser digerido con una enzima de la restricción de25. Otros métodos de estudian efectos vinculantes de tintes intercalados con el ADN usando pinzas ópticas26 o27de NMR. Cualquiera de los métodos requiere de equipo especializado; Considerando que este método permite el equipo que más laboratorios de biología molecular para determinar si un tinte interfiere con una enzima de la restricción digestión.
Además, en otros métodos para medir la longitud de una molécula dada, mapeo óptico ha alargado sin manchas las moléculas de ADN sobre una superficie y digiere ADN para determinar la extensión y tamaño de los fragmentos. Intercalación de tinte se ha demostrado para aumentar la longitud del contorno de las moléculas de ADN fluorescente manchadas y dependiendo del colorante utilizado, los contorno son diferentes21. Este método ha sido utilizado en una variedad de genomas1,3,4,6,13,28,29,30, 31. sin embargo, si las moléculas previamente teñidas, dependiendo del tinte y la enzima, la enzima puede no poder cortar ADN teñida con un colorante determinado. Por lo tanto, este método determina si ADN teñida con un colorante determinado puede ser digerido con una enzima. Además, dependiendo de la concentración de la tintura y el tinte utilizado, la movilidad de la DNA bandas en un gel migrarán más lentamente que el ADN nativo debido a la corrección parcial de la espina dorsal de la DNA para el tinte insertar entre pares de bases32 .
Sin embargo, a veces estos tintes pueden parcialmente o inhiben totalmente la acción de ciertas enzimas de restricción7,24. Esto es probablemente debido a un cambio estructural en el ADN causado por la fijación del colorante fluorescente, que puede impedir que la enzima reconoce la secuencia específica. Entender cómo estos tintes afectan enzimas de restricción puede ayudar en experimentos donde se requiere el perfil de metilación o el tramo de ADN teñido.
En nuestro método, ADN fue teñido con un fluorocromo de interés y digerido con una enzima de restricción. Luego fue electrophoresed DNA en un gel, reflejado, y se midió la tasa de digestión de la enzima de la restricción. Las enzimas de restricción fueron elegidas basándose en el patrón de corte en un gel. Superposición de bandas de ADN causadas muchas y muy pocas bandas no dio una imagen completa de la molécula de ADN. Hay un punto dulce para poder determinar el perfil de la molécula de ADN digerido; por lo tanto, dependerá de la DNA usada y la enzima. Una ventaja de este método es su simplicidad; sólo requiere equipo usado en una electroforesis de gel y digestión de restricción.

<table><tbody><tr><td>Unmethylated lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td><td>Corrosive and irritant</td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Buffer 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>High gelling temperature agarose gel</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>Wear correct eyewear&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td></tr><tr><td>Cannon EOS Rebel T3I camera</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Basic Power Supply</td><td>Biorad</td><td>1645050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Xylene Cyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

Visualización del ADN para microscopía de fluorescencia utiliza una variedad de tintes tales como los colorantes de Cianina. Estos colorantes son utilizados debido a su alta afinidad y sensibilidad para el ADN. Para determinar si las moléculas de ADN son completas después de la terminación del experimento, se requiere un método para determinar si las moléculas de tinción son longitud total por digestión de DNA con enzimas de restricción. Sin embargo, DNA manchada puede inhibir las enzimas, por lo que es necesario un método para determinar qué enzimas se puede usar para el fluorocromo mancharon ADN. En este método, el ADN se tiñe con un tinte de Cianina durante la noche para permitir que el tinte y el ADN se equilibren. Siguiente, tiñe ADN es digerido con una enzima de restricción, cargan en un gel y al. Las bandas de digestión de ADN experimentales son comparadas a una digestión en silico para determinar la actividad de la enzima de la restricción. Si hay el mismo número de bandas, como era de esperar, la reacción es completa. Bandas más de lo esperado indica la digestión parcial y menos bandas indican digestión incompleta. La ventaja de este método es su simplicidad y utiliza equipos que un científico necesita de una enzima de la restricción análisis y electrophoresis del gel. Una limitación de este método es que las enzimas disponibles para la mayoría de los científicos son las enzimas comercialmente disponibles; sin embargo, podría utilizarse cualquier enzimas de restricción.

Con el fin de determinar que si un colorante intercalante afecta una enzima de restricción que digiere ADN, el orden correcto de pasos debe ser seguidos (figura 1). Una vez que el ADN es manchado y digerido con una enzima dada, una imagen del gel puede tomarse para determinar el número de fragmentos y su tamaño (figura 2). Para determinar la eficiencia de la enzima, el número total de bandas visibles esperados dividido por el número de bandas visibles. Eficiencia de la enzima igualó la unidad, si el número de bandas y visto. Si hay más bandas en el gel luego, el valor es mayor que uno e indica reacciones parcialmente digeridas. Si hay menos bandas luego, el valor es menor que uno, que indica la digestión incompleta. En la Figura 2a, carriles 3 y 4 Mostrar la movilidad de las bandas ha disminuido, haciendo que las bandas cambiar de puesto hacia los pozos. En los carriles 1 y 2, la cantidad de tinte no afecta la movilidad notablemente, por lo que las bandas coinciden con el control. En la Figura 2a, carriles 5 y 6 muestran bandas más que el control, por lo que indica la digestión parcial. Que significa, los tintes afectan la hendidura de la DNA en el sitio de reconocimiento para ese enzima. En la figura 2b, todos espera que se ven bandas para todas las concentraciones de colorante, por lo que el tinte no interfirió con la digestión del ADN. C Figura 2 pistas la movilidad cambia de puesto con asteriscos de colores.
Como tinte concentración aumenta para tintes con -1, la movilidad disminuye. Para determinar el tamaño aproximado de las bandas, un control es necesaria para saber donde se espera que las moléculas de ADN nativas en comparación con la DNA manchada (Figura 2a). Para tintes con -3, la movilidad no disminuyó en la medida en que los colorantes-1 hicieron, así fue más fácil determinar el tamaño del fragmento (figura 2b). La diferencia de movilidad es debido al tipo de colorante utilizado, como se ve en Maschmann et al. 25. La varianza de estos tintes es vista debido a las estructuras de los tintes. El vinculador entre la molécula aromática para tintes -3 fue mayor que -1. Los tintes pueden intercalar ligeramente diferente debido a la diferencia en el tamaño de vinculador, que puede explicar por qué el cambio de movilidad es menos de-3 tintes.
Si no hay ninguna DNA, o las bandas de ADN son muy débiles en el gel, aumentando la concentración de ADN se requiere. Sin embargo, si aumenta la concentración de ADN, luego la cantidad de tinte necesario también aumentará para mantener la concentración correcta de tinte al cociente de ADN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57141/57141fig1.jpg"> Figura 1 : Un esquema de los pasos necesarios cuando digerir fluorocromo etiquetadas las moléculas de ADN. ADN y YOYO-1 u otro tinte a la serie TOTO, se agrega a un tubo negro e incuba durante la noche (O/N; 15-20 h). Una enzima de restricción se añade a un tubo; se coloca en una incubadora a la temperatura preferida, para 2-4 h (tabla 2). Cargar las muestras en un gel de agarosa 0.7% inmerso con buffer de x TAE 1. Papel de color oscuro cubre que la caja del gel y las luces se dan vuelta apagado, mientras que el gel es funcionó durante la noche para evitar fotorrotura del tinte. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57141/57141fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57141/57141fig2.jpg"> Figura 2: Digestión de restricción de ADN intercalado con un tinte de dímeros de Cianina. (un) DNA de la Lambda se tiñe con diferentes concentraciones de YOYO-1 durante la noche (carril C: digerido lambda DNA sin tinte (control), carril 1: 1.9 ng, carril 2: 3,8 ng, carril 3: 19.4 ng, carril 4: 32.2 ng, carril 5: 48.3 ng, carril 6: 63.5 ng de tintura por cada 100 ng de ADN) y luego dige sted con EcoRI en 37 ° C durante 2-4 h. Todas las reacciones son electrophoresed (E = 0,85 V/cm) en un 0,7% de alta temperatura de gelificación gel de agarosa (HGT) hechos con 1 buffer de x TAE (1 x TAE; 40 mM Tris-HCl 20 mM ácido acético, 1 mM EDTA). Los geles teñidos con bromuro de etidio y reflejados con un transiluminador de luz azul juntada a una cámara. L carril es una escalera de 1 kb (tamaños, kb); Lane λ es longitud total lambda ADN; carril E es el patrón de banda esperado (tamaños, kb). (b) ADN de Lambda se tiñe con YOYO-3 (carril 1: 1.9 ng, carril 2: 3,8 ng, carril 3: 19.4 ng, carril 4: 32.2 ng, carril 5: 48.3 ng, carril 6: 63.5 ng de tintura por cada 100 ng de ADN) y digerido con HindIII a 37 ° C. (c) para ver cómo la movilidad cambiada de puesto como la concentración de YOYO-1 se incrementa, asteriscos de colores se encuentran al lado de cada banda para cada concentración de YOYO-1. Por ejemplo, la banda de 3,5 kb tiene un asterisco rojo al lado de cada banda en cada concentración de YOYO-1. Las bandas inesperadas en el carril 5 y 6 no tienen un asterisco junto a las bandas. Se modifica la figura Maschmann et al. 25. derechos de autor (2017) nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57141/57141fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nombre químico</td>
			<td>Nombre abreviado</td>
			<td>Ex / Em (nm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[(1-1-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl] bis [4-[(3-metil-2(3H)-benzothiazolylidene) metilo]]-, tetraiodide</td>
			<td>TOTO-1</td>
			<td>514/533</td>
		</tr>
<tr>
<td>1, 1 - bis (4,4,8,8-tetrametil-4,8-diazaundecamethylene) [4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) methylidene]-l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide}</td>
			<td>YOYO-1</td>
			<td>491/509</td>
		</tr>
<tr>
<td>2, 2 '-[1, 3-prop-anediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4-ylidenemethylid - Ino]] bis [3-metil]-, tetraiodide</td>
			<td>POPO-1</td>
			<td>434/456</td>
		</tr>
<tr>
<td>2, 2 '-[1, 3-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-3, 1-propanediyl-1(4H) - pyridinyl - 4 – 1, 1-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-nolinium}</td>
			<td>BOBO-1</td>
			<td>462/481</td>
		</tr>
<tr>
<td>2, 2 '-{bis [4,8-bis (dimethyliminio) undecane 1,11-benzoato] [quinolin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraio-dide</td>
			<td>TOTO 3</td>
			<td>642/660</td>
		</tr>
<tr>
<td>1, 1-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl]] bis [4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-, tetraiodide</td>
			<td>YOYO-3</td>
			<td>612/631</td>
		</tr>
<tr>
<td>2, 2 '-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4 - ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-, tetraiodide</td>
			<td>POPO-3</td>
			<td>534/570</td>
		</tr>
<tr>
<td>tetraiodide del 2,2'-{Propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)Propane-3,1-diylpyridin-1-YL-4-ylideneprop-1-en-1-YL-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-IUM)</td>
			<td>BOBO-3</td>
			<td>570/602</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Abreviado de nombres de familia TOTO de tintes con nombres de la IUPAC con emisión (Em) y excitación (Ex) maximima22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Enzima</td>
			<td>Sensible a la metilación</td>
			<td>Tampón de</td>
			<td>Temperatura del baño María</td>
		</tr>
<tr>
<td>BamHI</td>
			<td>No</td>
			<td>2</td>
			<td>37 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EcoRI</td>
			<td>Sí</td>
			<td>2</td>
			<td>37 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HindIII</td>
			<td>No</td>
			<td>2</td>
			<td>37 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PmlI</td>
			<td>Sí</td>
			<td>1</td>
			<td>37 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>ScaI</td>
			<td>No</td>
			<td>2</td>
			<td>37 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>SmaI</td>
			<td>Sí</td>
			<td>3</td>
			<td>25 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: En la tabla es un subconjunto de posibles enzimas que podrían ser utilizados en estos experimentos. Tres enzimas son sensibles la metilación y tres no son sensibles de metilación. Los búferes utilizados para las enzimas y temperaturas de incubación se enumeran para cada enzima.

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Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Las moléculas de ADN para microscopía de fluorescencia de la tinción permite ver durante un experimento científico. En el método presentado aquí, las moléculas de ADN son previamente teñidas con colorantes fluorescentes y digeridas con metilación y enzimas de restricción sensibles no metilación.

Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.7K vistas.  University of Nebraska - Kearney. Las moléculas de ADN para microscopía de fluorescencia de la tinción permite ver durante un experimento científico. En el método presentado aquí, las moléculas de ADN son previamente teñidas con colorantes fluorescentes y digeridas con metilación y enzimas de restricción sensibles no metilación.

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DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the formation of a colored precipitate. It works by soaking the acrylamide or agarose DNA gel in a solution of 1x (equivalent to 2.0 &#181;M) SYBR Green I (SG I) and 0.20 mM nitro blue tetrazolium that produces a purple precipitate of formazan when exposed to sunlight or specifically blue light. Also, DNA recovery tests were performed using an ampicillin resistant plasmid in an agarose gel stained with our method. A larger number of colonies was obtained with our method than with traditional staining using SG I with ultraviolet illumination. The described method is fast, specific, and non-toxic for DNA detection, allowing visualization of biomolecules to the "naked eye" without a transilluminator, and is inexpensive and appropriate for field use. For these reasons, our new DNA staining method has potential benefits to both research and industry.

This method allows selective staining and quantification of DNA in gels by soaking the gel in a SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium solution and then exposing it to sunlight or a blue light source. This produces a visible precipitate and requires almost no equipment, making it ideal for field use.

Método basado en la precipitación de formazán inducida por exposición a la luz azul de la tinción de ADN

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Investigación

Bioquímica

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

La detección de bacterias mediante ADNzimas fluorogénicos

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Inmunología e Infección

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

Hi-C en el núcleo en células de Drosophila

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Genética

Captura de la conformación cromosómica (3C) para la investigación y la docencia de pregrado

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Autor destacado: Obtener una A con las 3C: Captura de la conformación cromosómica para estudiantes universitarios  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Análisis de tiempo de permanencia de una sola molécula de la escisión de ADN mediada por endonucleasas de restricción

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

Basada en el ADN de especies de peces Protocolo de identificación

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Biología

<meta charset="utf8"></head><body>Estudio de las interacciones de TRF1/2 con el ADN telomérico mediante un ensayo de molécula única

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper function depends on tightly regulated processes of replication, elongation, and damage response. The shelterin complex, especially Telomere Repeat-binding Factor 1 (TRF1) and TRF2, plays a pivotal role in telomere protection and has emerged as a potential anti-cancer target for drug discovery. These proteins bind to the repetitive telomeric DNA motif TTAGGG, facilitating the formation of protective structures and recruitment of other telomeric proteins. Structural methods and advanced imaging techniques have provided insights into telomeric protein-DNA interactions, but probing the dynamic processes requires single-molecule approaches. Tools like magnetic tweezers, optical tweezers, and atomic force microscopy (AFM) have been employed to study telomeric protein-DNA interactions, revealing important details such as TRF2-dependent DNA distortion and telomerase catalysis. However, the preparation of single-molecule constructs with telomeric repetitive motifs continues to be a challenging task, potentially limiting the breadth of studies utilizing single-molecule mechanical methods. To address this, we developed a method to study interactions using full-length human telomeric DNA with magnetic tweezers. This protocol describes how to express and purify TRF2, prepare telomeric DNA, set up single-molecule mechanical assays, and analyze data. This detailed guide will benefit researchers in telomere biology and telomere-targeted drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Técnicas avanzadas de una sola molécula para investigar las interacciones teloméricas proteína-ADN

This protocol demonstrates using single-molecule magnetic tweezers to study interactions between telomeric DNA-binding proteins (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] and TRF2) and long telomeres extracted from human cells. It describes the preparatory steps for telomeres and telomeric repeat-binding factors, the execution of single-molecule experiments, and the data collection and analysis methods.

Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

Resumen

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Hi-C en el núcleo en células de Drosophila

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Análisis de tiempo de permanencia de una sola molécula de la escisión de ADN mediada por endonucleasas de restricción

Basada en el ADN de especies de peces Protocolo de identificación

Análisis de las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas de una sola molécula