Esta investigación fue apoyada por la nacional Science Foundation de China (21474057 y 21604076).

PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Utilice prácticas de seguridad apropiadas cuando se realizan experimentos de química, incluyendo el uso de una campana y equipo de protección personal (gafas, guantes, bata de laboratorio, etc.). El protocolo requiere célula estándar de manejo de técnicas (esterilización, recuperación de la célula, célula pases, congelación de células, tinción de células, etc.).
 1. preparación de hidrogeles <ol><li>síntesis de benzaldehído terminaron di-functionalized polietilenglicol (PEG DF) <ol><li>previa desecación de PEG polímero <ol><li>peso 4,00 g PEG (4.000 MW, 1.00 mmol), Transvasar a un matraz de fondo redondo (250 mL) y añadir tolueno (100 mL). 
			Nota: Otras clavijas con distintos pesos moleculares puede trabajar para la formación del hidrogel pero conducirá a rigidez diferentes.</li>
			<li>Calentar la solución por una pistola de calor (o una placa alrededor de 40 ° C) suavemente para ayudar a disolver los polímeros. Después de disuelven todos los polímeros, utilizar un evaporador para eliminar todos los solventes. Repita este proceso seco y disolver dos veces para hacer la espiga seca polímeros. 
			PRECAUCIÓN: Esto debe realizarse en una campana de humos con extremo cuidado. Tolueno es inflamable.</li>
		</ol></li> <li>Reacción de terminación benzaldehído de PEG <ol><li>añadir un agitador magnético y tetrahidrofurano (THF, 100 mL) al matraz y disolver con un agitador de PEG. Añadir 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6.0 mmol) y 4-dimethylaminopyridine (0,07 g, 0,6 mmol) secuencialmente a las soluciones para todos los sólidos se disuelven completamente.</li>
			<li>Agregar N, N &#39;-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 1,25 g, 6.0 mmol) para la solución y añadir un tubo de secado que se llena con anhidro CaCl 2 al matraz. Mantener la reacción con agitación a temperatura ambiente (~ 20 ° C) para alrededor de 12 h.</li>
		</ol></li> <li>Proceso de la post-reacción <ol><li>filtrar los blancos sólidos generados en la solución de vacío después de que termine la reacción. Verter la solución en éter dietílico frío (500 mL), bajo agitación para precipitar los sólidos blancos. Reunir todos los sólidos blanco, filtro y secar los sólidos en una campana de humos.</li>
			<li>Disolver los sólidos blancos en THF otra vez, filtrar cualquier sólidos insolubles blanco, verter la solución en el éter dietílico frío fresco para precipitar los sólidos blancos y secarlo. Repita este proceso dos o tres veces y luego colocar los blancos sólidos en un horno de secado al vacío (20 ° C, 0.1 mbar) para secarlas totalmente. Recoger el polvo blanco como el producto final: benzaldehído terminada DF PEG.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Preparación de hidrogeles <ol><li>pesar diferentes cantidades de DF PEG (0,11 g, 0.028 mmol; 0,22 g, 0.055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) en un tubo (10 mL), añadir agua desionizada (5,0 mL) y utilizar un vórtice o un agitador magnético para ayudar a disolver el polímero.</li>
		<li>Glicol quitosano (0,495 g, 6.18 x 10 -3 mmol) en agua desionizada (15,0 mL) en un tubo (50 mL) se disuelven y utilice un vortex durante unos minutos para homogeneizar la solución de quitosano (3% en peso).</li>
		<li>Añadir la solución de quitosano de glicol (0,2 mL, 3% en peso) y soluciones de PEG DF (0,2 mL) secuencialmente en un tubo (2.0 mL). Use un vortex para mezclar las soluciones homogéneamente para los hidrogeles forma en varios minutos. Siga las proporciones en la tabla 1 para hidrogeles de fuerzas mecánicas diferentes. 
		Nota: Utilice el método de inversión del tubo para determinar si el hidrogel ha formado ya.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de reología <ol><li>llevar a cabo análisis de reología en un reómetro rotacional con una placa de acero paralelo (diámetro: 20 mm). Para la prueba de congelación, Difunda la solución de quitosano de glicol (0,2 mL, 3% en peso) en una placa inferior. Luego, añadir disoluciones acuosas de PEG DF (0.2 mL, 2% en peso) uniformemente gota a gota sobre la superficie de la solución de quitosano y mezclar rápidamente con una pipeta. Más bajo abajo de la placa superior y comenzar a test</li>
		<li>De hidrogel &#39; prueba de rigidez de s, cortar un hidrogel en un círculo (diámetro: 20 mm) y medir el módulo de almacenamiento (G &#39;) valores versus análisis de frecuencia en la tensión del 1%. G típico &#39; valores en s rad 6,3 &#8722; 1 se enumeran en la tabla 1. 
		Nota: Llevar a cabo los análisis reológicos de hidrogel 0.5 h después de la formación del hidrogel para estabilización de vínculo dinámico del hidrogel.</li>
		<li>Para el hidrogel &#39; s uno mismo-healable propiedad prueba, corta un hidrogel para piezas y juntar las piezas para self-heal a una pieza integral. Luego cortar el hidrogel para hacer un círculo (diámetro: 20 mm) y el Reómetro para llevar a cabo el análisis de la reología.</li>
	</ol></li></ol> 2. 3D cultivo celular en hidrogeles <ol><li>preparación de soluciones de gelificación de hidrogel <ol><li>pesar DF PEG (0,44 g, 0.11 mmol) en un tubo estéril (4,0 mL), añadir en medios de cultivo celular (RPMI-1640, 2.0 mL) y utilice un vortex o agitador para ayudar a disolver el polímero para obtener la solución de polímero (20% de peso). Cargar la solución en una jeringa (10,0 mL) y luego la esterilización haciéndola pasar por un filtro de retención de bacterias micrones (0,22 μm).</li>
		<li>Pesar del glicol quitosano (0,165 g, 2.06 x 10 -3 mmol) en un tubo estéril (15,0 mL), añadir en medios de cultivo celular (RPMI-1640, 4,0 mL) y agitar para ayudar a disolver el polímero para obtener la solución de quitosano de glicol (4,0% en peso). Cargar la solución en una jeringa (10,0 mL) y filtrarla con un filtro de 0,22 μm bacterias retentiva.</li>
	</ol></li> <li>Cultivo de célula en hidrogeles PRECAUCIÓN: realizar todos los procedimientos relacionados en una campana de cultivo de tejidos de la célula. Se espera que los conocimientos básicos de la técnica estéril.
	<ol><li>Preparación de la suspensión celular <ol><li>cultura elución de L929 células en RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, penicilina 5% (10 mL) en una Petri dish (diámetro 10 cm) e incubar a 37 ° C, 5% CO 2. Cambiar el medio cada día antes de su uso.</li>
			<li>Cosechar las células de la elución de L929 con PBS con tripsina (0,025% de w/v) y EDTA (0.01% w/v), luego centrifugar (70 x g, 5 min) y resuspender las células en el Medio RPMI-1640 (1,0 mL). Realizar el recuento celular mediante operación estándar del tablero de conteo de sangre. Resuspenda las células para regular la concentración de células a ~ 3.75 x 10 6 células/mL.</li>
		</ol></li> <li>Encapsulación celular en hidrogeles <ol><li>mezclar las suspensiones celulares de elución de L929 (0,4 mL, 3.75 x 10 6 células mL -1) con solución de quitosano de glicol (0,4 mL) en un tubo (4,0 mL) en el vórtex. Pipetear la solución de quitosano de elución de L929 glicol (0,8 mL) en el centro de un plato de Petri confocal (diámetro 2,0 cm). Pipetear las soluciones PEG DF (0,2 mL) en el mismo plato y pipetee suavemente para mezclar la solución e inducir la formación de hidrogel. 
			Nota: Evaluar la formación del hidrogel inclinando la caja Petri.</li>
			<li>Para el cultivo de celular directo, añadir cantidades adicionales de medio de cultivo RPMI-1640 (1,0 mL) sobre el hidrogel. Poner los célula encajado los hidrogeles (1,0 mL, 1,5 wt % glicol quitosano, 4,0% en DF PEG, 1,5 × 10 6 células mL -1) en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) y cambiar el medio cada día. Preparar para la proyección de imagen de la célula en día 1, 3, 5 y 7 después de la encapsulación de la célula.</li>
		</ol></li> <li>Para el cultivo posterior de celular 3D en hidrogeles después de la inyección, preparar celular cargado hidrogel (1,0 mL, consulte el paso 2.2.2) en una jeringa (10,0 mL, aguja de 48 G). Después de las formas de hidrogel, inyecte lentamente el hidrogel en una placa de Petri para la proyección de imagen confocal. Añadir una cantidad adicional de medios de cultivo (1,0 mL) sobre el hidrogel y cambiarlo todos los días. Poner el plato Petri en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) y prepararse para luego la proyección de imagen. 
		PRECAUCIÓN: Por favor verificar y seguir el protocolo de operación de seguridad de una jeringa de.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de la viabilidad celular <ol><li>observación Confocal <ol>
			<li>Enjuague los hidrogeles con PBS (1,0 mL) dos veces. Mancha de los hidrogeles con fluoresceína diacetato (FDA, 0.5 mL, 0.05 mg/mL) y soluciones de (PI, 0.08 mg/mL y 0,5 mL) de yoduro de propidio durante 15 min. Después de la tinción, quite todos los solventes.</li>
			<li>Observar los hidrogeles utilizando un microscopio confocal en longitudes de onda de excitación de 488 nm y 543 nm para visualizar en vivo y muerto de las células, respectivamente. Tomar z-pilas a través de cada profundidad de 2 μm de los hidrogeles para validar una distribución uniforme de las células a lo largo de. 
			Nota: FDA tiñe células vivas mientras las células muertas de las manchas de la PI.</li>
		</ol></li> <li>Degradar el hidrogel (1,0 mL) con ácido acético (HAc, 3% v, 1,0 mL) por 5 min y pipeta en un tubo (4,0 mL). Recoge las células de la centrífuga (70 x g, 5 min) y resuspender las células en el medio de cultivo RPMI-1640 celular (1,0 mL). Realizar la célula cuenta con un tablero de conteo de sangre.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+biomedical+applications.">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).</li><li>Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+cell-compatible+hydrogels+for+biomedical+applications.">Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications.</a> Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-mediated+Formation+and+Patterning+of+Hydrogels+for+Cell+Culture+Applications.">Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications.</a> J. Vis. Exp. (115), (2016).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).</li><li>Breslin, S., O&#8217;Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilely+prepared+inexpensive+and+biocompatible+self-healing+hydrogel:+a+new+injectable+cell+therapy+carrier.">Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier.</a> Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).</li><li>Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+multiresponsive+and+dynamic+chitosan-based+hydrogels+for+controlled+release+of+bioactive+molecules.">Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).</li><li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+injectable+hydrogel+formed+by+in+situ+cross-linking+of+glycol+chitosan+and+multi-benzaldehyde+functionalized+PEG+analogues+for+cartilage+tissue+engineering.">An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).</li><li>Ding, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+and+self-crosslinked+polysaccharide+hydrogel+with+autonomous+self-healing+ability.">A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability.</a> Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+gels+based+on+constitutional+dynamic+chemistry+and+their+potential+applications.">Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulus-regulated+3D-cell+proliferation+in+an+injectable+self-healing+hydrogel.">Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel.</a> Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).</li><li>Tseng, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Injectable,+Self&#8208;Healing+Hydrogel+to+Repair+the+Central+Nervous+System.">An Injectable, Self&#8208;Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System.</a> Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).</li><li>Yu, L., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogels+as+unique+biomedical+materials.">Injectable hydrogels as unique biomedical materials.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+Tumor+Chemotherapy+Effect+by+Using+an+Injectable+Self-healing+Hydrogel+as+Drug+Carrier.">Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier.</a> Polym. Chem. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+magnetic+self-healing+hydrogel.">A magnetic self-healing hydrogel.</a> Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+an+injectable,+self-healable+and+dual+responsive+hydrogel+for+drug+delivery+and+3D+cell+cultivation.">Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation.</a> Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).</li><li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate.">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).</li><li>Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+viscoelastic+behavior+of+subcutaneous+adipose+tissue.">Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue.</a> Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells.">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li><li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells.">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El hidrogel en este protocolo (figura 1) tiene dos componentes principales: el quitosano de glicol polímero natural y una sintética benzaldehído terminaron gelator polímero DF PEG, que son ambos materiales biocompatibles. Síntesis de DF PEG se presentan mediante una reacción de modificación de un solo paso. PEG de peso molecular 4.000 fue elegida en el presente Protocolo en preocupaciones de solubilidad, eficacia de la modificación, así como rigidez de hidrogel. Una serie de hidrogeles con diferentes fuerzas mecánicas se prepararon con diferentes contenidos de sólidos y proporciones de glicol quitosano y DF PEG. Hidrogeles homogéneos se formaron rápidamente en minutos mezclando soluciones de gelación bajo temperatura ambiente, aunque la velocidad de gelificación también podría desacelerarse por soluciones diluidas. Prueba de reología fue empleada para evaluar las fuerzas mecánicas de diferentes hidrogeles. Los módulos de almacenamiento (G') de los hidrogeles fueron encontrados aproximadamente difieran de 900 Pa (suave), 2.100 Pa (medio) a 4.700 Pa (tieso) (tabla 1 y figura 2A). Esto contribuyó a la mayor densidad de reticulación mediante la adición de más gelators de polímero en la red de hidrogel, dando por resultado más arriba módulo de almacenamiento (mayor rigidez). La propiedad auto-healable se confirma también por la recuperación del módulo de hidrogel (figura 2B). Se sabe que diferencia de rigidez de ECM para diversos tejidos, así el hidrogel podría ofrecer señales mecánicas ajustables y satisfacer requerimientos de investigación por diversas relaciones entre glicol quitosano y DF PEG polímero gelators18.
Células de elución de L929, una línea de células de fibroblasto de ratón típico con rigidez del tejido en vivo ambiente de ~ 5.600 pa19, fue utilizado como un modelo de célula para ser integrado en el hidrogel. Después de la encapsulación de la célula en hidrogeles, se puede fácilmente observar que las células en los hidrogeles mostraron viabilidad muy alta (&#62; 99%) durante el proceso de cultivo, confirmando la excelente biocompatibilidad de la hidrogel quitosano-basado. Un notable incremento de la densidad celular en el hidrogel implícita que este hidrogel podría apoyar la proliferación de las células de la elución de L929 incluso sin factores de crecimiento adicional agregado (Figura 3A). Después de 7 días en cultivo en el hidrogel, el número de células aumenta 300% (figura 3B). Se ha informado que las células cultivadas en andamios podían distinguir siguiendo señales mecánicas20,21, que podría implicar más investigaciones utilizando este método de cultivo de hidrogel 3D.
Implantación de las células con hidrogeles inyectables ha ganado incomparables ventajas para mejorar grandemente la eficiencia de la entrega y la viabilidad de las células implantadas14. Dentro de una red dinámica de imina de reticulado, el hidrogel podría self-heal después de la inyección. La propiedad self-healable permite el hidrogel sea inyectable, que implica posibles aplicaciones de los hidrogeles como inyectable múltiples portadoras. Para evaluar este hidrogel como portador de celular inyectable, se realizó un experimento imitan a inyección y posterior cultivo. El hidrogel embebida de la célula fue cargada en una jeringa y exprimido hacia fuera a través de una aguja de 48 G en una placa Petri, seguido de un 7 día post cultivo proceso con tarifa de viabilidad y la proliferación de célula estudiado.
Como se muestra en la Figura 4A, los pedazos de hidrogel aplastado podrían self-heal para reformar un hydrogel integrado sobre 1 h después de la inyección, que es útil en la entrega de la célula. Para las células en el hidrogel, en comparación con la imagen tomó justo después de encapsulación (Figura 4A, inserto izquierdo), la densidad celular aumentada dramáticamente después de 7 días (Figura 4A, insertar media). En la visión ampliada, una más detallada celulares-fissional proceso en el que se encuentran algunas células que se dividirán en dos (Figura 4A, derecha insertar), directamente confirmada por proliferación celular 3D en el hidrogel. Figura 4B muestra las imágenes confocales de los ensayos de muerto vivo de la célula después de la inyección y el experimento de la cultura. La densidad de las células inyectadas aumentado obviamente con una viabilidad celular alta (&#62; 99%), demostrando la proliferación acertado de la célula en el hidrogel 3D después de la inyección. Para saber que si la inyección afectó la tasa de proliferación celular, comparación de análisis de las estadísticas cuantitativos de las tasas de proliferación celular en los hidrogeles con o sin inyección fue realizado (figura 4). La tasa de proliferación celular después de la inyección, aunque disminuyó ligeramente, permaneció en un nivel alto (~ 75%) y el número de celular aumentó 145% relativamente después de 7 días en cultivo en el hidrogel, lo que indica que la fuerza de corte durante la inyección tiene un observable limitada influencia negativa sobre la proliferación celular.
Describe un procedimiento típico de esta aplicación de hidrogel pero los investigadores pueden modificar el protocolo para adaptarse a los requisitos específicos de investigación. Gelators de polímero tienen influencias significativas sobre el hidrogel y son fácilmente modificables. Por ejemplo, la rigidez de este hidrogel podría ser fácilmente manipulada por diferentes proporciones de glicol quitosano y DF PEG gelator. Mientras tanto, el uso DF PEG de otros pesos moleculares también podría cumplir con este objetivo. Utilizamos PEG 4K en este protocolo, pero PEG 2K a 10K también puede funcionar. Cuando se utilizan otras clavijas, es importante controlar el tiempo de gelificación y rigidez específicamente. Otros gelators polímero funcional también pueden funcionar si los investigadores tienen habilidades de síntesis para preparar polímeros terminada en benzaldehído funcionales específicos17.
Este protocolo tiene varias limitaciones. En primer lugar, debido a la dinámica de la estructura, la rigidez de este hidrogel es limitada en comparación con un hidrogel reticulado de enlace covalente. Uno puede encontrar fallas para preparar hidrogeles con demasiado de un diseño de módulo. En segundo lugar, este hidrogel es bio-degradable, lo que limita el cultivo de células a largo plazo en el hidrogel. En tercer lugar, el hidrogel ofrece un ambiente de cultivo 3D reticulado que tiene preocupaciones de difusión. Hasta la fecha, la mayoría de los bio-análisis se basa en cultura 2D. La estructura 3D pueda interferir con la célula más relacionados con en vivo estudios.
Cuando se utiliza este protocolo, hay varios pasos importantes a seguir. En primer lugar, durante la síntesis de la gelator polímero DF PEG, la deshidratación es muy importante. En segundo lugar, al realizar procedimientos relacionados con la célula, operación estéril es fundamental. En tercer lugar, el tiempo de tinción debe ser bien controlado en hidrogeles para obtener imágenes confocales agradables.
En Resumen, el protocolo introdujo una fácil preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano, que se aplican como una plataforma para el cultivo celular 3D y podrían ofrecer señales mecánicas ajustables para diversas investigaciones. Ya se ha aplicado en áreas con respecto a la administración de fármacos, terapia celular y quimioterapia del tumor, que no sólo es un testimonio de su desempeño, pero también aumenta su potencial para ap biomédicaplicaturas.

Los hidrogeles son materiales de polímero reticulado con grandes cantidades de agua y propiedades mecánicas, suaves, y se han utilizado en muchas aplicaciones biomédicas1,2. Los hidrogeles pueden ofrecer un ambiente suave y húmedo, que es muy similar al entorno fisiológico de las células en vivo. Por lo tanto, los hidrogeles se han convertido en uno de los más populares andamios para celular 3D cultura3,4. Comparado con el cultivo celular 2D de Petri, cultivo celular 3D ha avanzado rápidamente para ofrecer que una matriz extracelular (ECM) mímico el microambiente de las células en contacto con y ensamblar para propósitos de proliferación y diferenciación5. Además, los hidrogeles que contienen polímeros naturales podrían ofrecer ambientes bio-compatibles y promover para que las células proliferan y diferencian3. Hidrogeles derivados de polímeros sintéticos se prefieren para sus componentes simples y claras, que excluye influencias complejas como las proteínas de origen animal o virus. Entre todos los candidatos de hidrogel para el cultivo celular 3D, siempre se prefieren los hidrogeles que fácilmente están preparados y tienen una propiedad constante. La facilidad para ajustar propiedades de hidrogel para adaptarse a requisitos de la investigación es importante como bien6.
Aquí presentamos una fácil preparación de un hidrogel de glicol basados en quitosano utilizando química dinámica imina, que se convierte en una plataforma versátil de hidrogel para celular 3D cultura7. En este método, bien conocido de bio-compatibles de glicol quitosano se utilizan para establecer los marcos de las redes de hidrogel. Sus grupos aminos se reaccionaron con un polietilenglicol benzaldehído terminada como el gelator de polímero para formar la imina dinámica bonos como crosslinkages de hidrogeles8. Bonos de imina dinámica pueden formar y descomponer reversible y sensiblemente al entorno, dotando los hidrogeles con reticulado mecánicamente ajustable redes9,10,11. Debido a su contenido alto de agua, materiales bio-compatibles y fuerzas mecánicas ajustables, el hidrogel se aplica con éxito como un andamio para la elución de L929 células en 3D de la célula cultura12,13. El protocolo aquí detalles de los procedimientos, incluyendo la síntesis del polímero gelator hidrogel preparación, incrustación de célula y cultivo celular 3D.
El hidrogel también muestra varias otras características debido a su crosslinkages imina dinámico, incluyendo su múltiples sensibles a varios estímulos de bio (ácido/pH, piridoxal derivado de la vitamina B6, la papaína de la proteína, etc.), indicando que podría ser el hidrogel inducida que se descomponen bajo condiciones fisiológicas8. El hidrogel es también uno mismo-healable e inyectables, que significa el hidrogel podría ser administrado a través de un método de inyección invasiva mínima y obtener una ventaja en drogas y celulares entregas14,15. Mediante la adición de aditivos funcionales o gelators del polímero específico prediseñado, el hidrogel es compatible para obtener propiedades específicas como magnético, temperatura, pH de receptivo, etc.16,17, que podría satisfacer un amplia gama de necesidades de investigación. Esas propiedades revelan capacidad potencial de hidrogel que un inyectable múltiples portadores de drogas y células en investigación bio-médica en vitro y en vivo y aplicaciones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1151">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">Glycol chitosan</td>
			<td style="width:360px;">Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:131px;">39280-86-9</td>
			<td style="width:385px;">90% degree of deacetylation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Carboxybenzaldehyde</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>619-66-9</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N, N&#39;-dicyclohexylcarbodiimide</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>538-75-0</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride anhydrous</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-dimethylamiopryidine</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>1122-58</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyethyleneglycol</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>5254-43-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>109-99-9</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Toluene</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>108-88-3</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl ether</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>60-29-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anhydrous CaCl2</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>596-09-8</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium iodide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25535-16-4</td>
			<td>94%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI-1640 culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td>0.01 M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin streptomycin solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td></td>
			<td>AR-G2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>710-3channel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L929 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Evaporator</td>
			<td>EYELA</td>
			<td></td>
			<td>N-1100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">48 guage needle</td>
			<td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td>48-guage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM3000 B</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope software</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat gun</td>
			<td>Confu</td>
			<td></td>
			<td>KF-5843&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of chitosan-based injectable hydrogels and its application in 3d cell culture

El protocolo presenta un método fácil, eficaz y versátil para preparar Hidrogeles basados en chitosán usando química dinámica imina. El hidrogel se prepara mezclando soluciones de glicol quitosano con un gelator de polímero sintetizado benzaldehído terminado y eficientemente se obtienen hidrogeles en varios minutos a temperatura ambiente. Por relaciones diferentes entre glicol quitosano, gelator de polímero y el contenido de agua, se obtienen hidrogeles versátiles con tiempos de congelación diferentes y rigidez. Cuando está dañada, el hidrogel puede recuperar sus apariciones y el módulo, debido a la reversibilidad de los bonos de imina dinámicos como crosslinkages. Esta propiedad la healable permite el hidrogel que inyectable puesto que puede ser auto curado de piezas exprimidas a un hidrogel a granel integral después del proceso de inyección. El hidrogel es también múltiple sensible a muchos estímulos bioactivos debido a Estados de equilibrio diferentes de los bonos de imina dinámico. Este hidrogel fue confirmado como bio-compatibles y células de fibroblasto de ratón de elución de L929 fueron integrados siguientes procedimientos estándar y fácilmente se evaluó la proliferación celular por un proceso de cultivo celular 3D. El hidrogel puede ofrecer una plataforma ajustable para diferentes investigaciones donde es beneficiado un imitador fisiológico de un entorno 3D para las células. Junto con sus propiedades múltiples de respuesta, uno mismo-healable e inyectables, los hidrogeles pueden aplicarse potencialmente como portadores de múltiples drogas y células en futuras aplicaciones de bio-médica.

Una presentación esquemática de este protocolo en la preparación del hidrogel y su uso como cultivo celular 3D se ofrece en la figura 1. Información de contenidos y relaciones con diversas fuerzas mecánicas el hidrogel se resume en la tabla 1. El hidrogel de uno mismo-healable y propiedad de reología presenta rigidez de hidrogel por módulo de almacenamiento versus frecuencia de prueba en la figura 2. Las imágenes confocales celular y número de células con días de la cultura en los hidrogeles se presenta en la figura 3, confirmando la viabilidad celular y la proliferación celular mediante cultivo celular 3D. Figura 4 presenta la microscopia, imágenes confocales y análisis de las tasas de proliferación celular de células incrustadas en los hidrogeles que sufrieron la inyección y la cultura. Celular alta viabilidad y proliferación celular indican que las células encajadas el hidrogel no sufrieron ningún daño destructivo y podrían recuperar la cultura, indicando la inyectabilidad de hidrogel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig1.jpg"> 
Figura 1 : Preparación del hidrogel y su uso como cultivo celular 3D. (A) hidrogel preparación; (B) célula de preparación de la suspensión; (C) cultivo de celular 3D en hidrogeles con o sin inyección. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig2.jpg"> 
Figura 2: Hidrogel rigidez. Módulo de almacenamiento G' versus frecuencia de (A) original y (B) auto curados hidrogeles. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig3.jpg"> 
Figura 3 : Cultivo de celular 3D en el hidrogel. (A) 3D imágenes confocales de elución de L929 células incrustadas en resistencia tiesa del hidrogel (verde: vivir las células; Rojo: células muertas); (B) célula contando resultados de elución de L929 células incrustadas en el hidrogel después de encapsulación celular denota tiempo. Barra de escala = 300 μm. datos presentados como media ± SD. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig4.jpg"> 
Figura 4 : Célula 3D post-cultura en hidrogel después de la inyección. (A) A la imagen esquemática de inyección y de la cultura de un hidrogel de célula de carga. Insertar: Imágenes de microscopía de células incrustan en los hidrogeles antes de la inyección (izquierda) y después posterior al cultivo celular por 7 días (centro y derecha). Barra de escala = 100 μm; Imágenes confocales (B) de las células de la elución de L929 incrustado en un hidrogel de fuerza dura y cultivadas después después de la inyección (verde: vivir las células; Rojo: células muertas), barra de escala = 300 μm; (C) A comparación de la tasa de proliferación de las células cultivadas en hidrogeles con o sin inyección después de la encapsulación. Datos presentados como media ± SD (adaptado de referencia12; Copyright © 2017 Elsevier). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rigidez de hidrogel</td>
			<td>Suave</td>
			<td>Medio</td>
			<td>Tieso</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicol quitosano (mg)</td>
			<td>6.6</td>
			<td>6.6</td>
			<td>6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DF PEG (mg)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>8.8</td>
			<td>17.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contenido de polímero gelator (wt %)</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua desionizada (mL)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelaion tiempo (min)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>5</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G' (Pa)*</td>
			<td>900</td>
			<td>2100</td>
			<td>4700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* probado bajo frecuencia 6,3 rad s-1, cepa 1% utilizando una placa paralela (diámetro 20 mm) en un reómetro rotacional.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Información de hidrogeles preparados con diferentes fuerzas mecánicas.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture at JoVE.com

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Aquí describimos una fácil preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano utilizando química dinámica imina. Se presentan métodos para ajustar la fuerza mecánica de hidrogel y su aplicación en cultivos celulares 3D.

Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

preparation-chitosan-based-injectable-hydrogels-its-application-3d

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

18.9K vistas.  Tsinghua University. Aquí describimos una fácil preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano utilizando química dinámica imina. Se presentan métodos para ajustar la fuerza mecánica de hidrogel y su aplicación en cultivos celulares 3D.

Video: Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

The development of fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically encoded and synthetic fluorophores with sensing abilities allowed the visualization of biologically relevant species with high spatial and temporal resolution. Synthetic dyes are of particular interest thanks to their high tunability and the wide range of measureable analytes. However, these molecules suffer several limitations related to small molecule behavior (poor solubility, difficulties in targeting, often no ratiometric imaging allowed). In this work we introduce the development of dendrimer-based sensors and present a procedure for pH measurement in vitro, in living cells and in vivo. We choose dendrimers as ideal platform for our sensors for their many desirable properties (monodispersity, tunable properties, multivalency) that made them a widely used scaffold for several biomedical devices. The conjugation of fluorescent pH indicators to the dendrimer scaffold led to an enhancement of their sensing performances. In particular dendrimers exhibit reduced cell leakage, improved intracellular targeting and allow ratiometric measurements. These novel sensors were successfully employed to measure pH in living HeLa cells and in vivo in mouse brain.

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluorescence sensors are powerful tools in life science. Here we describe a methodology to synthesize and use dendrimer-based fluorescent sensors to measure pH in living cells and in vivo. The dendritic scaffold enhances the properties of conjugated fluorescent dyes leading to improved sensing properties.

Síntesis, Entrega y Celular<em&gt; En vivo</em&gt; Aplicación de sensores de pH basadas en dendrímeros

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

Investigación

Química

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

Preparación y Uso de Carbenos carbonilo decorados en la activación de fósforo blanco

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) complex and protocols for the preparation of its novel non-radioactive, i.e., natural Ga(III) as well as radioactive 68Ga complex. The ligand as well as the Ga(III) complex were characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, mass spectrometry and elemental analysis. 68Ga was obtained by a standard elution method from a 68Ge/68Ga generator. Experiments to evaluate the 68Ga-labeling efficiency of EOB-DTPA at pH 3.8&#8211;4.0 were performed. Established analysis techniques radio TLC (thin layer chromatography) and radio HPLC (high performance liquid chromatography) were used to determine the radiochemical purity of the tracer. As a first investigation of the 68Ga tracers&#39; lipophilicity the n-octanol/water distribution coefficient of 68Ga species present in a pH 7.4 solution was determined by an extraction method. In vitro stability measurements of the tracer in various media at physiological pH were performed, revealing different rates of decomposition.

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

A procedure for the isolation of EOB-DTPA and subsequent complexation with natural Ga(III) and 68Ga is presented herein, as well as a thorough analysis of all compounds and investigations on labeling efficiency, in vitro stability and the n-octanol/water distribution coefficient of the radiolabeled complex.

Las investigaciones en el complejo Ga (III) de EOB-DTPA y su<sup&gt; 68</sup&gt; Ga radiomarcados analógica

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We present methods for depositing and passively manipulating C60 molecules on rippled graphene that advance the pursuit of realizing applications involving 1D C60/graphene hybrid structures. The techniques applied in this exposition are geared towards high vacuum systems with preparation areas capable of supporting molecular deposition as well as thermal annealing of the samples. We focus on C60 deposition at low pressure using a homemade Knudsen cell connected to a scanning tunneling microscopy (STM) system. The number of molecules deposited is regulated by controlling the temperature of the Knudsen cell and the deposition time. One-dimensional (1D) C60 chain structures with widths of two to three molecules can be prepared via tuning of the experimental conditions. The surface mobility of the C60 molecules increases with annealing temperature allowing them to move within the periodic potential of the rippled graphene. Using this mechanism, it is possible to control the transition of 1D C60 chain structures to a hexagonal close packed quasi-1D stripe structure.

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Here we present a protocol for the fabrication of C60/graphene hybrid nanostructures by physical thermal evaporation. Particularly, the proper manipulation of deposition and annealing conditions allow the control over the creation of 1D and quasi 1D C60 structures on rippled graphene.

Preparación y caracterización de nanoestructuras de C60/Graphene híbrido

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a simple protocol for the multifunctional surface modification of NDs by using mussel-inspired polydopamine (PDA) coating. In addition, the functional layer of PDA on NDs could serve as a reducing agent to synthesize and stabilize metal nanoparticles. Dopamine (DA) can self-polymerize and spontaneously form PDA layers on ND surfaces if the NDs and dopamine are simply mixed together. The thickness of a PDA layer is controlled by varying the concentration of DA. A typical result shows that a thickness of ~5 to ~15 nm of the PDA layer can be reached by adding 50 to 100 &#181;g/mL of DA to 100 nm ND suspensions. Furthermore, the PDA-NDs are used as a substrate to reduce metal ions, such as Ag[(NH3)2]+, to silver nanoparticles (AgNPs). The sizes of the AgNPs rely on the initial concentrations of Ag[(NH3)2]+. Along with an increase in the concentration of Ag[(NH3)2]+, the number of NPs increases, as well as the diameters of the NPs. In summary, this study not only presents a facile method for modifying the surfaces of NDs with PDA, but also demonstrates the enhanced functionality of NDs by anchoring various species of interest (such as AgNPs) for advanced applications.

A facile protocol is presented to functionalize the surfaces of nanodiamonds with polydopamine.

Modificación de superficie bio-inspirado de la Polydopamine de nano-diamantes y su reducción de nanopartículas de plata

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Photogeneration of N-Heterocyclic Carbenes: Application in Photoinduced Ring-Opening Metathesis Polymerization

We report a method to generate the N-heterocyclic carbene (NHC) 1,3-dimesitylimidazol-2-ylidene (IMes) under UV-irradiation at 365 nm to characterize IMes and determine the corresponding photochemical mechanism. Then, we describe a protocol to perform ring-opening metathesis polymerization (ROMP) in solution and in miniemulsion using this NHC-photogenerating system. To photogenerate IMes, a system comprising 2-isopropylthioxanthone (ITX) as the sensitizer and 1,3-dimesitylimidazolium tetraphenylborate (IMesH+BPh4-) as the protected form of NHC is employed. IMesH+BPh4- can be obtained in a single step by anion exchange between 1,3-dimesitylimidazolium chloride and sodium tetraphenylborate. A real-time steady-state photolysis setup is described, which hints that the photochemical reaction proceeds in two consecutive steps: 1) ITX triplet is photo-reduced by the borate anion and 2) subsequent proton transfer takes place from the imidazolium cation to produce the expected NHC IMes. Two separate characterization protocols are implemented. Firstly, CS2 is added to the reaction media to evidence the photogeneration of NHC through formation of the IMes-CS2 adduct. Secondly, the amount of NHC released in situ is quantified using acid-base titration. The use of this NHC photo-generating system for the ROMP of norbornene is also discussed. In solution, a photopolymerization experiment is conducted by mixing ITX, IMesH+BPh4-, [RuCl2(p-cymene)]2 and norbornene in CH2Cl2, then irradiating the solution in a UV reactor. In a dispersed medium, a monomer miniemulsion is first formed then irradiated inside an annular reactor to produce a stable poly(norbornene) latex.

We describe a protocol to photogenerate N-heterocyclic carbenes (NHCs) by UV irradiation of a 2-isopropylthioxanthone/imidazolium tetraphenylborate salt system. Methods to characterize the photoreleased NHC and elucidate the photochemical mechanism are proposed. The protocols for ring-opening metathesis photopolymerization in solution and miniemulsion illustrate the potential of this 2-component NHC photogenerating system.

Photogeneration de carbenos N-heterocíclicos: aplicación en fotoinducida anillo-abertura polimerización de metátesis

We report a method to generate the N-heterocyclic carbene (NHC) 1,3-dimesitylimidazol-2-ylidene (IMes) under UV-irradiation at 365 nm to characterize IMes ...

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, when used together, can indicate the presence of gunshot residue (GSR) by producing a fluorescence signal in the presence of three key analytes (antimony, lead, and organic components of GSR). The protocol describes the synthesis of the biosensors using Escherichia coli (E. coli), and the analytical chemistry methods used to evaluate the selectivity and sensitivity of the sensors. The functioning of the system is demonstrated by using GSR collected from the inside of a spent cartridge casing. Once prepared, the biosensors can be stored until needed and can be used as a test for these key analytes. A positive response from all three analytes provides a presumptive positive test for GSR, while each individual device has applications for detecting the analytes in other samples (e.g., a detector for lead contamination in drinking water). The main limitation of the system is the time required for a positive signal; future work may involve studying different organisms to optimize the response time.

A protocol is presented using synthetic biology techniques to synthesize a set of bacterial biosensors for the analysis of gunshot residue, and to test the functioning of the devices for their intended use using fluorescence spectroscopy.

Preparación y aplicación de un nuevo biosensor bacteriano para la detección presuntiva de residuos de Disparos

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

The fabrication and preparation of graphene-supported microwell liquid cells (GSMLCs) for in situ electron microscopy is presented in a stepwise protocol. The versatility of the GSMLCs is demonstrated in the context of a study about etching and growth dynamics of gold nanostructures from a HAuCl4 precursor solution. GSMLCs combine the advantages of conventional silicon- and graphene-based liquid cells by offering reproducible well depths together with facile cell manufacturing and handling of the specimen under investigation. The GSMLCs are fabricated on a single silicon substrate which drastically reduces the complexity of the manufacturing process compared to two-wafer-based liquid cell designs. Here, no bonding or alignment process steps are required. Furthermore, the enclosed liquid volume can be tailored to the respective experimental requirements by simply adjusting the thickness of a silicon nitride layer. This enables a significant reduction of window bulging in the electron microscope vacuum. Finally, a state-of-the-art quantitative evaluation of single particle tracking and dendrite formation in liquid cell experiments using only open source software is presented.

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

A protocol for preparation of graphene-supported microwell liquid cells for in situ electron microscopy of gold nanocrystals from HAuCl4 precursor solution is presented. Furthermore, an analysis routine is presented to quantify observed etching and growth dynamics.

Preparación de células líquidas de micropozo compatibles con grafeno para microscopía electrónica de transmisión in situ

The fabrication and preparation of graphene-supported microwell liquid cells (GSMLCs) for in situ electron microscopy is presented in a stepwise protocol. ...