Los autores desean agradecer a Yuliya Naumchuk (Loyola University de Chicago) y Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) de excelente soporte técnico y videográfico. Programa de investigación del Dr. Kaja es apoyado por el Dr. John P. y Teresa E. Mulcahy dotado Cátedra de Oftalmología en la Universidad Chicago de Loyola.

Todos los animales fueron tratados con arreglo a la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica e investigación de la visión y la Directiva 86/609/CEE para los experimentos en animales, usando protocolos aprobados y supervisados por la Junta Directiva de experimento Animal de Finlandia.
1. inducida por láser ratón CNV modelo 5
<ol><li>Inspeccione los ojos del animal macroscópico para cualquier anormalidad.</li>
	<li>Peso del ratón.</li>
	<li>Calcular y preparar una cantidad adecuada de anestesia a utilizar, basado en el peso del animal, por ejemplo, una mezcla de medetomidina (1 mg/kg), ketamina (75 mg/kg) y agua destilada (solución de NaCl 0.9%) en una relación de 1:1.5:2.5 o ketamina (40-75 mg/kg), xilacina (5 mg/kg) y agua destilada (solución de NaCl 0.9%) en una proporción de 1: 2. 5:1; para un ratón de 20 g, inyectar 0,1 mL de mezcla.</li>
	<li>Inyectar el anestésico por vía intraperitoneal.</li>
	<li>Coloque el ratón en la jaula y esperar hasta que el animal está anestesiado. Confirmar que el ratón correctamente está anestesiado por la falta de un reflejo pedal.</li>
	<li>Garantizar el uso de equipo de protección personal de seguridad láser.</li>
	<li>Encienda una lámpara de hendidura y un láser de diodo de 532 nm.</li>
	<li>Quitar el ratón de la jaula y el lugar de la almohada.</li>
	<li>Aplique una gota de tropicamida para la dilatación pupilar. Espere 3-5 min para la dilatación pupilar completa (3 mm).</li>
	<li>Coloque el ratón en el escenario de la lámpara de hendidura.</li>
	<li>Coloque una gota de gel líquido oftálmica en un cubreobjetos applanate la córnea.</li>
	<li>Oriente el ojo de ratón con la cabeza del nervio óptico en el centro.</li>
	<li>Ajustar la potencia del láser a 100 mW, la duración a 100 ms y el tamaño del spot a 50 μm.</li>
	<li>El rayo láser se centran en el epitelio retiniano del pigmento (RPE).</li>
	<li>Hacer tres disparos de láser en un ojo evitando los vasos sanguíneos retinianos en el 4, 8 y 12:00 posiciones alrededor del nervio óptico, respectivamente. Inspeccione el fondo del ojo después de todo laser tiros por ausencia de hemorragias retinianas. El ojo contralateral sirve como un control no con láser.</li>
	<li>Deseche el ratón cubreobjetos y lugar nuevo en la almohada.</li>
	<li>Aplique una gota de PEG gel gotas en ambos ojos.</li>
</ol>2. SD-OCT 6,7
<ol><li>Coloque el ratón en la etapa de alineación roedor e inmovilizar la cabeza.</li>
	<li>Alinear la lente del sistema SD-OCT (p. ej., Bioptigen/Leica Envisu R2200) hacia el ojo en vivo imagen utilizando controladores de fase X y Y.</li>
	<li>Realizar análisis de la SD-OCT para verificar roturas de la membrana de Bruch: una vez que la SD-OCT escanea el ojo entero, mueva manualmente la línea de referencia en los sitios lasered. Roturas de la membrana de Bruch deben ser claramente visibles en áreas lasered (ver figura 1).</li>
</ol>3. fluoresceína angiografía 7,8,9
<ol><li>Quite el ratón con el titular y coloque en el sistema de FA (p. ej., Heidelberg Spectralis HRA2).</li>
	<li>Enfoque en laser quemar zonas del fondo del ojo a modo de reflectancia en el infrarrojo con la cabeza del nervio óptico en el centro de la ventana de visualización.</li>
	<li>Inyectar 0.1 mL de sal de sodio de la fluoresceína de 5% para un ratón de 20 g por vía subcutánea o intraperitoneal.</li>
	<li>Se centran en el nivel de la coroides.</li>
	<li>Tomar una imagen desde el nivel de enfoque coroides.</li>
	<li>Volver a centrar a nivel retiniano y tomar una imagen.</li>
	<li>Esperar 30 s y repetir los pasos 3.4-3.6.</li>
	<li>Retire el ratón del soporte y colocar en la almohada.</li>
	<li>Invertir anestesia α2-antagonista de medetomidina, atipamezole (0.5 mg/kg, i.p.) o esperar para la recuperación de animales de la anestesia.</li>
	<li>Repita en vivo SD-OCT y FA imágenes en animales anestesiados en el seguimiento días 5, 10 y 14.</li>
</ol>4. CNV clasificación
<ol><li>Grado el daño de la membrana de Bruch de imágenes de OCT y coroides FA inmediatamente después lasering en el día 0 como siguiendo: 0 - no fue dañada la membrana de Bruch 1 - éxito daño de la membrana de Bruch</li>
	<li>Grado de la presencia de CNV de lasered puntos que tenía fugas como se observa al comparar la dinámica de la señal de fluoresceína en una serie de imágenes retinianas de FA como siguiendo: 0 - apariencia normal de la retina coloración débil 0.5 - de fuga 1.0 - zonas con fugas de CNV Nota: Utilice la imagen de OCT para la confirmación adicional de la NVC o en FA cuestionable que sugeriría la presencia de líquido intrarretiniana en imágenes de OCT CNV clasificación.</li>
</ol>5. mediciones del espesor retina
<ol><li>Utilizar un software de segmentación automatizada para mediciones del espesor retiniano. Asegúrese de que el grosor retiniano total se considera, como el espesor de todas las capas de la capa de fibras nerviosas a RPE (sitios de medida saludable), o a una línea imaginaria que conecta RPE alrededor del sitio del daño (lasered sitios) (vea la figura 7).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+experimental+choroidal+neovascularization+in+the+rat.">A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat.</a> Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).</li><li>Tobe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+neovascularization+in+mice+with+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+photoreceptors.">Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).</li><li>Seo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+inhibition+of+retinal+and+choroidal+neovascularization+by+oral+administration+of+a+kinase+inhibitor.">Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor.</a> Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization.">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> J Vis Exp. (106), e53502 (2015).</li><li>Giani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+evaluation+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography.">In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice.">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PloS One. 10, e0132643 (2015).</li><li>Sheets, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotectin+D1+attenuates+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+mouse.">Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse.</a> Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).</li><li>Hoerster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+and+ex-vivo+characterization+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+variability+in+mice.">In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).</li><li>Sulaiman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Optical+Coherence+Tomography+Quantification+Method+for+Choroidal+Neovascularization.">A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).</li></ol>

El autor Symantas Ragauskas, pH.d. es un empleado (investigador) y accionista de Experimentica Ltd. que ofrece contratar los servicios de investigación que emplean el modelo preclínico de la CNV en este artículo.
El autor Eva Kielczewski es un empleado (Ingeniero de aplicaciones de investigación, OCT) de Leica Microsystems que produce sistemas de SD-OCT utilizados en este artículo.
El autor Joseph Vance es un empleado (OCT NA Director de ventas) de Leica Microsystems que produce sistemas de SD-OCT utilizados en este artículo. Joseph Vance es también Presidente y director general de respectivos, LLC.
El autor Simon Kaja, pH.d. es Consultor Director científico y accionista de Experimentica Ltd., una contrato preclínico organización de investigación que ofrece contratar los servicios de investigación, incluyendo el modelo preclínico de CNV utilizado en este artículo. Simon Kaja, pH.d. es también CEO de K & P Scientific LLC, una empresa, consultora del Ciencias de la vida y sirve como el Dr. John P. y Teresa E. Mulcahy dotado profesor de Oftalmología en la Universidad Chicago de Loyola, escuela de Stritch de la medicina. Los términos de este acuerdo han sido revisados y aprobadas por la Loyola University Chicago conformidad con su política de conflicto de intereses.
El autor Giedrius Kalesnykas, pH.d. es un empleado (CEO) y accionista de Experimentica Ltd. que ofrece contratar los servicios de investigación que emplean el modelo preclínico de la CNV en este artículo.

La proyección de imagen multimodal ofrece valiosas herramientas para la evaluación de patología CNV. Aquí presentamos un protocolo de imagen consisten en FA, SD-OCT y segmentación automática para la evaluación rápida, reproducible y confiable de la patología de la CNV. Una rotura de la membrana de Bruch después de la administración de láser fue confirmada. Además, el uso de la SD-OCT en esta etapa también permitió la visualización inmediata de posibles hemorragias intrarretinianas y subretinales, que pueden confundir la interpretación de los resultados. Fugas de retinales se clasificaron basado en la señal de la fluoresceína de imágenes de FA. El uso de la SD-OCT proporciona una descripción más detallada de la patología de la CNV. Por otra parte, análisis longitudinal de la SD-OCT en varios puntos del tiempo durante todo el período de seguimiento puso de relieve las diferencias temporales en la patología que seguiría siendo difícil de alcanzar si confiando en FA solo.
Grosor retiniano total se midió mediante segmentación automatizada. Espesor retiniano en sitios que CNV fue inducida se midió manualmente. La evaluación histológica de flatmount coroides se verifica, y el área de neovascularización se mide utilizando el software de análisis de imagen imagen J.
La adecuada transparencia del eje visual es fundamental para el desempeño exitoso del protocolo presentado. Sequedad de la córnea y la formación de cataratas son los principales factores implicados en la solución de problemas. Por lo tanto, una vez que el ratón obtiene anestesiado, los ojos deben estar constantemente hidratados con lágrimas artificiales o gel para mantener la correcta hidratación de la córnea. El protocolo propuesto debe realizarse preferentemente dentro de 10 minutos de la inducción de la anestesia. Tiempo de anestesia prolongado puede causar la formación de cataratas y prevenir en vivo la proyección de imagen.
El protocolo descrito se limita a la observación de clasificación de la progresión de la CNV basada en fugas vasculares a nivel de la retina. Evaluación cuantitativa de la pérdida retiniana puede añadirse Heidelberg Spectralis software, que permite la delimitación de la zona de la fuga y proporciona datos cuantitativos en la región de interés. Además, Sulaiman y sus colegas (2015) recientemente propusieron el cálculo del volumen de la CNV en vivo adquirido OCT imágenes utilizando el método elipsoide10. El modelo de elipsoide probablemente introduce sesgo hacia la sobreestimación del volumen de las lesiones como CNV en la mayoría de los casos tiene una forma irregular. Sin embargo, la alta correlación entre mediciones de volumen de análisis confocal de muestras histológicas y cuantificación propuesta elipsoidal de las imágenes de OCT proporciona evidencia que el método es una herramienta valiosa para la evaluación cuantitativa del volumen CNV10 .
Para concluir, que creemos que la combinación actual de diferentes en vivo modalidades, junto con la segmentación automatizada y el análisis histológico, la proyección de imagen proporciona reproducible y fiable evaluación de la patología de la CNV en estudios preclínicos. El método podría ser especialmente útil para la prueba de estudios de intervención terapéutica de concepto.

La primera tentativa acertada para imitar la patología de la NVC humano en roedores se demostró hace casi tres décadas con un láser de criptón de ratas Long-Evans1. Después de eso, se utilizó un láser de criptón para romper la membrana de Bruch en la cepa de ratón más popular, C57BL/6J2,3,4. La tasa de éxito de la inducción de la CNV se verificó con FA y tintes histológicos. Un rápido desarrollo de modalidades de imágenes no invasivas, tales como OCT, fomentó el crecimiento del campo de modelos preclínicos de roedores. La capacidad para monitorear cambios morfológicos en la retina en varios puntos del tiempo en el mismo ojo significativamente contribuye a la reducción del uso de animales y aumenta la eficacia en estudios experimentales. La evaluación histológica de las lesiones de NVC es bastante sencilla y requiere etiquetado de crecimiento vascular anormal alrededor del sitio de administración de láser, adquisición de imágenes y estimación de superficie/volumen mediante un software de análisis de imagen. En cambio, las modalidades en vivo imágenes introducen más complejos análisis de patología de la CNV y su interpretación.
Aquí presentamos un método sencillo y relativamente rápido para la inducción de grado, la progresión y la regresión de la CNV con FA, SD-OCT, y el método de la segmentación automatizada en el ratón inducida por láser CNV modelo.

<table><tbody><tr><td>Medetomidine (commercial name Domitor)</td><td>Orion</td><td>Vnr 01 56 02</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr 51 14 85</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>0,9% NaCl</td><td>B Braun</td><td>357 0340</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Xylazine (commercial name Rompun vet)</td><td>Bayer</td><td>vnr 14 89 99</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Santen</td><td>Vnr 04 12 36</td><td>Mydriatic agent</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Alcon</td><td>Vnr 44 54 81</td><td>Lubricant</td></tr><tr><td>Systane</td><td>Alcon</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>Lubricant</td></tr><tr><td>5% Fluorescein sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6377-100G</td><td>Fluoresent agent</td></tr><tr><td>Atipamezole (commercial name Antisedan)</td><td>Orion</td><td>Vnr 47 19 53</td><td>Anesthesia</td></tr></tbody></table>

in vivo multimodal imaging and analysis of mouse laser-induced choroidal neovascularization model

Inducida por láser del neovascularization coroides (CNV) es un modelo bien establecido para imitar la forma húmeda de la degeneración macular senil (DMS). En este protocolo, nuestro objetivo es guiar al lector no sólo a través de las consideraciones técnicas de generación de las lesiones inducidas por láser para desencadenar procesos de neovascular, sino más bien centrarse en la poderosa información que puede obtenerse de multimodal longitudinal en vivo proyección de imagen durante el periodo de seguimiento.
El ratón inducida por láser modelo de la CNV se generó por una administración de láser de diodo. Multimodal en vivo las técnicas de imagen fueron utilizadas para controlar la inducción de la CNV, progresión y regresión. Primero, se realizó tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) inmediatamente después de la lasering para verificar una rotura de la membrana de Bruch. Posterior en vivo la proyección de imagen usando la angiografía de la fluoresceína (FA) confirmaron éxito daño de la membrana de Bruch de la serie imágenes adquiridas a nivel de coroides. Seguimiento longitudinal de la CNV proliferación y regresión en los días 5, 10 y 14 después de la lasering fue realizado usando la SD-OCT y FA. Se presentan simple y confiable de fugas leasions CNV de imágenes de FA. Segmentación automática para la medición del grosor retiniano total, combinado con aplicación manual calibre para la medición del espesor retiniano en los sitios de la CNV, permiten la evaluación objetiva de la presencia de edema. Finalmente, la verificación histológica de la CNV se realiza utilizando proteína GS IB4 manchas en la coroides flatmounts. La tinción es thresholded, y se calcula el área de proteína-positivas con ImageJ.
Este protocolo es especialmente útil en estudios de terapéutica que requieren alta-rendimiento-como proyección de la patología de la CNV como rápido, permite multimodal y clasificación fiable de CNV patología y retinianas, edema. Además, la SD-OCT de alta resolución permite la grabación de otras características patológicas, como la acumulación de líquido subretinal o intrarretiniana. Sin embargo, este método no proporciona una posibilidad para automatizar análisis de volumen CNV de imágenes SD-OCT, que deberá llevarse a cabo manualmente.

Una burbuja o subretinal sangrado inmediatamente después lasering no siempre es visible. Por lo tanto, la SD-OCT es particularmente importante para verificar el daño de la membrana de Bruch. La figura 1 muestra un ejemplo de proyección de imagen de OCT en diferentes momentos después de la administración de láser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig1.jpg"> Figura 1 : OCT en cara vista del fondo de ojo (imagen VIP) muestra tres áreas lasered en círculos blancos, verdes y rojos. OCT B-scan imágenes fueron tomadas antes de la lasering (línea de base), inmediatamente después de la lasering para verificar una rotura de la membrana de Bruch (0 días, las flechas apuntan hacia el sitio de daño) y 5, 10 y 14 días después de la administración de láser. Como puede verse en el área en blanco (primera fila de imágenes), no desarrollaron la CNV en los puntos de tiempo posteriores. El área en verde y rojo convirtió CNV, que fue detectado el día seguimiento 5. Sin embargo, en el 10 y 14 días los puntos de tiempo, estas lesiones CNV regresaron. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56173/56173fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figuras 2 y 3 muestran la proyección de imagen serial con FA, que confirmó el éxito daño de la membrana de Bruch en todos los tres puntos en el día 0, en un hombre ratón C57BL/6jRj de 10 semanas de edad.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig2.jpg"> Figura 2 : La proyección de imagen serial FA tomada cada 20 s (imágenes 1 a la 18) a nivel de coroides inmediatamente después de la administración de láser. Flechas blancas en la imagen 1 punto a sitios lasered, que presentan fuga de fluoresceína en los puntos de tiempo posteriores (flechas blancas en la imagen 18). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56173/56173fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig3.jpg"> Figura 3 : La proyección de imagen serial FA tomada cada 20 s (imágenes 1 a la 18) inmediatamente después de la administración de láser a nivel retiniano. Área de NVC que tiene fugas de fluoresceína y una clasificación de 1 (CNV agujereado) es señalado por la flecha blanca en la imagen 18. Nota una intensidad cada vez mayor, así como el área de fluoresceína positiva, durante el timecourse de FA (flecha blanca en imágenes de 8 y 11) la proyección de imagen. Dos espacios en blanco en la imagen 18 se clasificaron como teniendo una débil señal de FA (0,5 grados). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56173/56173fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Además de la clasificación de la patología de la CNV, SD-OCT es útil para revelar información adicional en el sitio de la lesión, por ejemplo, presencia de fluido subretinal, el edema y la regresión de la CNV. La figura 4 muestra las principales señas de identidad patológicas de CNV inducida por láser en ratones.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig4.jpg"> Figura 4 : Patología espectral dominio óptico coherencia tomografía de imagen de CNV. SD-OCT proporciona una patología detallada de CNV dentro del tejido de la retina, como puede verse en estas imágenes representativas en cicatrización de tejidos, formación de CNV y acumulación de líquido. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56173/56173fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El edema macular es una de las principales señas de identidad patológicas de forma húmeda AMD en los seres humanos. En el modelo inducida por láser de la NVC, grueso retiniano puede evaluarse utilizando segmentación automatizada. Medición manual de sitios lasered es necesaria para medir el espesor retiniano en el sitio de la CNV. La figura 5 muestra un ejemplo de un informe generado después de la segmentación automatizada.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig5.jpg"> Figura 5 : Cuantificación del grueso retiniano. Grosor retiniano medido por segmentación automatizada <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56173/56173fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El uso de la segmentación automatizada es una forma rápida de proporcionar una visión general del grueso retiniano (tabla 1). Figuras 6A y 6B muestran ejemplos representativos de la segmentación automatizada de una saludable zona retiniana y de la zona retiniana con patología de la CNV, respectivamente. A pesar de menores inexactitudes encontradas en la distinción de capas retinianas individuales, generales, el software reconoce confiablemente el espesor total de la retineano en ratones pigmentados.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig6.jpg"> Figura 6 : Automatizado de segmentación de las capas retinianas. Segmentación automatizada del área retiniana sano (A) y área retiniana que contiene NVC (asterisco en imagen B). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56173/56173fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para evaluar el espesor retiniano en lasered áreas, cada área lasered se midió manualmente como sigue: el grosor retiniano total era considerado como el espesor de todas las capas de la capa de fibras nerviosas a la línea imaginaria que une RPE alrededor del sitio de daños (figura 7 y tabla 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Zona</td>
			<td>Día 5</td>
			<td>Día 10</td>
			<td>Día 14</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grosor retiniano total, μm</td>
			<td>218±7.8</td>
			<td>220±7.2</td>
			<td>221±9.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Área lasered 1</td>
			<td>200</td>
			<td>204</td>
			<td>214</td>
		</tr>
<tr>
<td>Área lasered 2</td>
			<td>226</td>
			<td>217</td>
			<td>220</td>
		</tr>
<tr>
<td>Área lasered 3</td>
			<td>222</td>
			<td>223</td>
			<td>227</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Los datos se presentan como mean±SD</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Grosor retiniano total y grueso retiniano en los sitios CNV durante un seguimiento de 14 días según lo determinado por la segmentación automatizada utilizando el software de inVivoDiver (v. 3.0.8).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig7.jpg"> Figura 7 : Medición manual del grueso retiniano en el área lasered con patología CNV. Línea amarilla indica el grosor retiniano total de capa de fibras nerviosas a una capa imaginaria de RPE (línea negra) en el sitio de la administración de láser. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56173/56173fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Histológico, las lesiones de NVC fueron confirmadas con proteína GS IB4 etiquetado (figura 8A). Software de análisis de imagen Image J se utilizó para calcular el área de lesión NVC (figura 8B).
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig8.jpg"> Figura 8 : Análisis histológico. Tinción histológica de lesión NVC del flatmount coroides (en verde, A) se puede cuantificar mediante umbralización en imagen J (B). La barra de escala para A es de 50 μm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56173/56173fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

En Vivo La proyección de imagen multimodal y análisis del modelo de neovascularización coroidea inducida por láser Mouse

Presentamos la utilidad de la proyección de imagen longitudinal en vivo en el seguimiento de los cambios morfológicos del neovascularization coroides laser-inducida en ratones.

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

9.0K vistas.  Experimentica Ltd.. Presentamos la utilidad de la proyección de imagen longitudinal en vivo en el seguimiento de los cambios morfológicos del neovascularization coroides laser-inducida en ratones.

Video: In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Un modelo de ratón inducida por láser de la hipertensión ocular crónica a Caracterizar los defectos visibles

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Medicina

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, difficulties in observing posterior choroidal melanoma in vivo limit tumor location and growth evaluation in real-time. The approach described here optimizes techniques for establishing choroidal melanoma in mice via a multi-step sub-choroidal B16LS9 cell injection procedure. To enable precision in injecting into the small dimensions of the mouse uvea, the complete procedure is performed under a microscope. First, a conjunctival peritomy is formed in the dorsal-temporal area of the eye. Then, a tract into the sub-choroidal space is created by inserting a needle through the exposed sclera. This is followed by the insertion of a blunt needle into the tract and the injection of melanoma cells into the choroid. Immediately after injection, noninvasive optical coherence tomography (OCT) imaging is utilized to determine tumor location and progress. Retinal detachment is evaluated as a predictor of tumor site and size. The presented method enables the reproducible induction of choroid-localized melanoma in mice and the live imaging of tumor growth evaluation. As such, it provides a valuable tool for studying intraocular tumors.

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

The present protocol describes the implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid utilizing optical coherence tomography.

Implantación y evaluación del melanoma en la coroides murina mediante tomografía de coherencia óptica

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Investigación sobre el cáncer

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. Multiphoton microscopy (MPM) has become one of the most popular imaging modalities for biomedical study at cellular levels in vivo, advantages include high resolution, deep tissue penetration and minimal phototoxicity. We have designed an MPM imaging platform with a customized mouse eye holder and a stereotaxic stage for imaging ocular surface in vivo. Dual fluorescent protein reporter mouse enables visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers, and capillaries within the ocular surface. In addition to multiphoton fluorescence signals, acquiring second harmonic generation (SHG) simultaneously allows for the characterization of collagenous stromal architecture. This platform can be employed for intravital imaging with accurate positioning across the entire ocular surface, including cornea and conjunctiva.

Presented here is a multiphoton microscopic platform for live mouse ocular surface imaging. Fluorescent transgenic mouse enables the visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers and capillaries within the ocular surface. Non-linear second harmonic generation signals derived from collagenous structures provide label-free imaging for stromal architectures.

Una plataforma de microscopía multifoto personalizada para imágenes en vivo de cornea de ratón y conjuntiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Bioingeniería

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

En Vivo Proyección de imagen de ratones de reportero Cx3cr1gfp/gfp con tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. Innate immune cells, specifically mononuclear phagocytes, express overlapping cell surface markers, which makes identifying these populations a challenge. Multi-parameter flow cytometry allows for the simultaneous, quantitative analysis of multiple cell surface markers in order to differentiate monocytes, macrophages, microglia, and dendritic cells in mouse eyes. This protocol describes the enucleation of whole mouse eyes, ocular dissection, digestion into a single cell suspension, and staining of the single cell suspension for myeloid cell markers. Additionally, we explain the proper methods for determining voltages using single color controls and for delineating positive gates using fluorescence minus one controls. The major limitation of multi-parameter flow cytometry is the absence of tissue architecture. This limitation can be overcome by multi-parameter flow cytometry of individual ocular compartments or complimentary immunofluorescence staining. However, immunofluorescence is limited by its lack of quantitative analysis and reduced number of fluorophores on most microscopes. We describe the use of multi-parametric flow cytometry to provide highly quantitative analysis of mononuclear phagocytes in laser-induced choroidal neovascularization. Additionally, multi-parameter flow cytometry can be used for the identification of macrophage subsets, fate mapping, and cell sorting for transcriptomic or proteomic studies.

This protocol provides a method to digest whole eyes into a single cell suspension for the purpose of multi-parameter flow cytometric analysis in order to identify specific ocular mononuclear phagocytic populations, including monocytes, microglia, macrophages, and dendritic cells.

Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Inmunología e Infección

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Neurociencias

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Image-Guided Optical Coherence Tomography to Assess Structural Changes in Rodent Retinas

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural changes. These diseases affecting the fundus always exhibit typical abnormalities in certain cell types in the retina, including photoreceptor cells, retinal ganglion cells, cells in the retinal blood vessels, and cells in the choroidal vascular cells. Noninvasive, highly efficient, and adaptable imaging techniques are required for both clinical practice and basic research. Image-guided optical coherence tomography (OCT) satisfies these requirements because it combines fundus photography and high-resolution OCT, providing an accurate diagnosis of tiny lesions as well as important changes in the retinal architecture. This study details the procedures of data collection and data analysis for image-guided OCT and demonstrates its application in rodent models of choroidal neovascularization (CNV), optic nerve crush (ONC), light-induced retinal degeneration, and experimental autoimmune uveitis (EAU). This technique helps researchers in the eye field to identify rodent retinal structural changes conveniently, reliably, and tractably.

The protocol presented here details the procedures of data collection and data analysis for image-guided optical coherence tomography (OCT) and demonstrates its application in multiple rodent models of ocular diseases.

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural ...