Este trabajo fue financiado por una subvención APART de la Academia Austriaca de Ciencias (CTH), la Agencia de tecnología de la República Checa del proyecto no. TA04010877 (CTH, VH y JGS), y la Fundación de la ciencia Checa (GACR) no proyecto 01246S GA16 (a JGS). Agradecemos a W. Tecumseh Fitch su sugerencia de usar crema fijadora de la dentadura y Ing. Liska de P. del servicio de bosque del ejército Checo por su ayuda en la adquisición de las laringes de ciervos suprimido.

El animal muestras analizadas en este trabajo fueron tratadas conforme a los requisitos de la norma éticos de la Universidad Palacky de Olomouc, República Checa. Derivan de vivir violentamente en los bosques, que eran buscados por el ejército Checo bosque servicio durante la temporada regular de la caza de ciervo.
1. preparación de la muestra de Hemi-laringe
Nota: Muestras debidamente preparadas sólo puede usarse, como se indica en4 . Rápida congelación de la laringe25 inmediatamente después de la supresión y almacenamiento a-80 ° C se minimiza el potencial de degradación del tejido y la alteración de las propiedades biomecánicas y permite la realización de los experimentos en cualquier momento conveniente.
<ol><li>
Descongelación de la laringe
	<ol>
<li>Inserte la laringe congeladora en dos bolsas de autoclave o cualquier otras bolsas de plástico con sellado impermeable. Sellar las bolsas y ponerlas en un baño de agua calentado a 30 ° C hasta que la laringe esté completamente descongelada. La duración necesaria oscila entre unas horas y más de un día, dependiendo del tamaño de la laringe y la temperatura de congelación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Limpieza de la laringe
	<ol>
<li>Después de que la laringe esté descongelada, retire de la bolsa y limpiar con solución salina (0,9% NaCl).</li>
		<li>Retire con cuidado el tejido superfluo como aplicable (músculos del cuello es decir externo, hueso hioides etc.) sin dañar las estructuras laríngeas principal y acortar la tráquea a una longitud adecuada para el montaje de la laringe en un tubo de suministro de aire (generalmente ca. 4-5 cm).</li>
		<li>Compruebe el tejido laríngeo para posibles anomalías del tejido, tales como heridas, deformaciones orgánicas o grietas potencialmente producido por el proceso de congelación, que podría hacer que la laringe no aptos para el experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exposición de los cartílagos tiroides y cricoides
	<ol>
<li>Saque las piezas del tejido muscular laríngeo externo alrededor del cartílago tiroides y cricoides con un bisturí, exponiendo los cartílagos en preparación para el corte sagital creando la hemi-laringe. Esta etapa de preparación se representa en la figura 1A y 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Corte sagital a través del cartílago tiroides
	<ol>
<li>Hacer un corte vertical inicial a través de la parte anterior del cartílago tiroides.</li>
		<li>Coloque con cuidado el corte un poco más hacia el lado que está a punto de retirarse, para no dañar el doblez vocal que debe permanecer conservados. Si es posible, utilice un bisturí para cortar. Si el cartílago está osificado, use una sierra pequeña.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cortar cartílago cricoides
	<ol>
<li>Llevar el corte verticalmente (inferiorly) de entre los cartílagos aritenoideo y luego a través del cartílago cricoides a un nivel aproximadamente horizontal de la entalladura de la tiroidea inferior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Retiro del doblez vocal uno, creando una incisión en forma de L en la laringe
	<ol>
<li>Hacer horizontal cortado a partir del extremo inferior del anterior corte vertical en el cartílago cricoides y conducir el nuevo corte a la muesca de la tiroidea inferior. Pliegue anterior del lado de la laringe que se va a quitar.</li>
		<li>Hacer una vertical corte a través del tejido blando en la cara interna del cartílago tiroides - tenga cuidado mientras que el corte entre el accesorio anterior de las cuerdas vocales hacia el cartílago tiroides, evitando así daños en el pliegue vocal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Refinamiento del corte a través del cartílago tiroides
	<ol>
<li>Uso de un bisturí, una sierra o un archivo, con el fin de aplicar un corte recto precisamente en el cartílago tiroides y como cerca posible de la parte anterior del doblez vocal previamente inspeccionado.</li>
		<li>Quitar también una parte pequeña del cartílago tiroides posterior, con el fin de crear espacio para la inserción de la clavija para adducting el aritenoides cartílago y, por tanto, el vocal doblan (véase abajo). Esta etapa de preparación se representa en la figura 1C y 1D. Nota: Dependiendo de la pregunta de investigación, exposición completa del doblez vocal entera puede necesitar para permitir su visibilidad desde arriba. En tal caso, deben eliminarse las estructuras por encima del doblez vocal (verdadera) (es decir, la ventricular o vestibular veces, según sea el caso teniendo en cuenta la anatomía del espécimen). En algunos ejemplares el interior suave del tejido laríngeo por encima de las cuerdas vocales puede perder su conexión con el cartílago tiroides e interfiere con el pliegue vocal durante la vibración, potencialmente causando falsos patrones oscilatorios (en su mayoría irregulares). En tal caso es inevitable eliminar de ese tejido.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig1.jpg"> Figura 1 : Montaje y preparación de Hemi-laringe. (A) y (B) limpió laringe espécimen, vista medial y posterior, antes del retiro del doblez vocal izquierdo; (C) y (D) preparado hemi-laringe con incisión en forma de L (a la izquierda del doblez vocal removido), medial y posterior. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55303/55303fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

2. Hemi-laringe experimento
<ol><li>
Configuración de Hemi-laríngea
	<ol>
<li>Utilizar un tubo de suministro de aire que entrega el aire humidificado y calentado en la laringe.</li>
		<li>Construir dos perpendicular había arreglado placas transparentes como una sustitución por piezas desmontadas laríngeas.</li>
		<li>Uso puntas 4 para aumentar la estabilidad de la laringe y la creación de una configuración adecuada de laringe pre-phonatory por adducting del doblez vocal restante a la placa vertical (ver figura 2A). Nota: En teoría, las cuerdas vocales pueden también ser aducción por suturas y pesas en un sistema de polea-palanca 26 . Sin embargo, este enfoque tiene, para el mejor conocimiento de estos autores, aún no han intentado para una preparación hemilarynx.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig2.jpg">
Figura 2 : Configuración de Hemi-laringe. (A) las estructuras de apoyo: tubo de suministro de aire, arreglo de la placa de vidrio en forma de L dientes de aducción. (B) montaje preparación de hemi-laringe con las horquillas de aducción. (C) y (D) planos de hemi-laringe-preparación, visto desde el lado y desde arriba, respectivamente. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55303/55303fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2"><li>
Montaje de la hemi-laringe
	<ol>
<li>Cubrir el tubo de suministro de aire con fijador de prótesis dental crema y montar la laringe con la parte restante de su tráquea. La crema fijadora funciona como adhesivo y cierra brechas posibles, creando un sello hermético.</li>
		<li>Fijar la tráquea con una correa o una abrazadera de apriete de plástico.</li>
		<li>Cubrir también los bordes del corte a través del cartílago tiroides con el crema, evitando separarse crema fijadora en el pliegue vocal o los tejidos blandos de los laringeos interiores fijador.</li>
		<li>Acople las placas transparentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estabilización del cartílago tiroides, aducción del doblez vocal con dientes
	<ol>
<li>Utilice las clavijas para aducción del doblez vocal a la placa y estabilizar el cartílago tiroides.</li>
		<li>Después la crema fijadora, aplicar el flujo de aire con el fin de establecer la oscilación de la cuerda vocal y verifique posibles fugas entre el hemi-laringe y las placas de vidrio.</li>
		<li>Sellar huecos eventualmente ocurrir agregando más crema fijadora.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La preparación de la hemi-laringe comparte las ventajas de la configuración "convencional" laringe extirpada (completo): en este enfoque experimental, condiciones físicas y fisiológicas y parámetros (tales como presión subglótico o alargamiento de cuerdas vocales) pueden ser controlar bastante bien. El comportamiento del hemilarynx es homólogo de una laringe completo con un perfecto lateral simetría, con la excepción de que magnitudes de algunos parámetros (e.g., caudal de aire, presión sonora) se re...

Voz se crea típicamente por vibración del tejido laríngeo (principalmente las cuerdas vocales), que convierte un flujo de aire constante, suministrada por los pulmones, en una secuencia de pulsos de flujo de aire. La forma de onda de presión acústica (es decir, el sonido principal) salen de esta secuencia de pulsos de flujo acústico excita el tracto vocal que filtra, y el sonido resultante es irradiado de la boca y (hasta cierto punto) de la nariz1 . La composición espectral del sonido generado en gran parte está influenciada por la calidad de la vibración vocal, gobernada por la biomecánica laríngea y las interacciones con el flujo de aire traqueal2. Tanto en una clínica y un contexto de investigación, documentación y evaluación de la vibración de la cuerda vocal está así de interés principal al estudiar la producción de la voz.
En los seres humanos, investigación endoscópica directa de la laringe durante la producción de sonido en vivo es un desafío, y es prácticamente imposible en los mamíferos no humanos, medios tecnológicos actuales. Por lo tanto y en orden a la garantía cuidadosamente controlado física o fisiológica experimental condiciones de contorno, el uso de laringes suprimido3,4 es en muchos casos una substitución adecuada para la investigación de en vivo mecanismos de producción de la voz.
Vibración de la cuerda vocal es un fenómeno tridimensional complejo5. Mientras que los métodos de investigación convencionales como endoscopia laríngea (en vivo) o preparaciones de laringe suprimido normalmente proporcionan sólo una vista superior de los pliegues vocales vibrante6, no permiten análisis tridimensional completo de movimiento de la cuerda vocal. En particular, en la vista superior los márgenes inferiores (caudales) de las cuerdas vocales son invisibles durante una parte importante del ciclo vibratorio. Esto es debido al retraso de fase entre el inferior (caudal) y el borde superior (craneal) de las cuerdas vocales, un fenómeno que se ve típicamente durante el doblez vocal oscilación5. Como escasa evidencia empírica directa para respaldar los resultados de modelos matemáticos y físicos, conocimiento de la geometría y el movimiento del vocal baja doble borde7y, por tanto, la geometría del canal subglótico8,9 , 10 es crucial para entender mejor la interacción entre el flujo de aire laríngea, tejido del pliegue vocal y la resultante fuerzas y presiones11,12. Otro aspecto de la vibración de cuerdas vocales que se esconde de la vista superior habitual es la vertical (caudo-craneal) profundidad de contacto entre las dos cuerdas vocales. La profundidad vertical del contacto se relaciona con el espesor vertical de las cuerdas vocales, que es un indicador potencial del registro vocal en canto ("pecho" vs "falsete" registro)13,14.
Para superar las deficiencias de los preparados convencionales laringe extirpada (completo), se puede utilizar una configuración llamada hemi-laringe, donde la mitad de la laringe se quita, lo que facilita la evaluación de las características vibratorias de los restantes del doblez vocal en tres dimensiones. Sorprendentemente, desde la introducción de esta configuración en la década de 196015 y una validación inicial del concepto en 199316, no muchos laboratorios han realizado experimentos con este prometedor enfoque experimental17,18 ,19,20,21,22,23. Una explicación para esto podría encontrarse en las dificultades de crear una preparación viable hemi-laringe. Mientras que la preparación convencional extirpada laringe (completo) está bien documentado4, no hay tales instrucciones más detalladas aún están disponibles para crear una configuración de hemi-laringe. Por lo tanto es el objetivo del presente trabajo proporcionar un tutorial para crear una configuración fiable reproducible hemi-laringe, complementada por los resultados experimentales de ejemplares de ciervo rojo.
Una configuración de hemi-laringe comparte muchas características con una configuración "convencional" laringe suprimido, como equipo de medida, de alta velocidad u otra tecnología de imagen para documentar adecuadamente las vibraciones de las estructuras laríngeas durante la generación de sonido, o correcto suministro de aire calentado y humidificado. Estas consideraciones de configuración general se describen en detalle en un capítulo del libro4 y un informe técnico del Centro Nacional de la voz y el habla24. Reiteración de estas instrucciones sería más allá del alcance de este manuscrito. Aquí, se presentan sólo las directivas especializadas para generar una configuración de hemi-laringe.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Surgical blades</td>
			<td >Surgeon</td>
			<td >Jai Surgical Ltd., New Delhi, India</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saw</td>
			<td >Hand saw (Lux, 150 mm length)</td>
			<td >Lux, Wermelskirchen, Germany</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermometer</td>
			<td >Testo 922</td>
			<td >Testo Ltd., Hampshire, UK</td>
			<td >K-type Probe, Operating temperature -20 to +50 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave bags</td>
			<td >Autoclave bags</td>
			<td >vwr.com, VWR International s.r.o., Stribrna Skalice, Czech republic</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conductive glass plates</td>
			<td >Custom made</td>
			<td >UPOL - Joint laboratory of Optics 
			Trida 17. listopadu 50A, 772 07 Olomouc, the Czech Rep.</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixative cream</td>
			<td >Denture fixative cream</td>
			<td >Blend-a-dent Natural</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Prongs and fastening system</td>
			<td >Customized Kanya Al eloxed profiles</td>
			<td >Distributor: VISIMPEX a.s.. Seifertova 33, 750 02 Prerov, the Czech Rep.;</td>
			<td >&#160;Combination of Kanya RVS and PVS fastening systems (http://www.kanya.cz/) + custom made prongs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting tube</td>
			<td >Custom made</td>
			<td >UPOL - Joint laboratory of Optics, 
			Trida 17. listopadu 50A, 772 07 Olomouc, the Czech Rep.</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED Light</td>
			<td >Verbatim 52204 LED Lamp</td>
			<td >Mitsubishi Chemical Holdings Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Camera</td>
			<td >Canon EOS1100D</td>
			<td >Canon Inc.</td>
			<td >18-55 mm lens</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Airpump</td>
			<td >Resun LP100</td>
			<td >Resun</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Strobe light</td>
			<td >ELMED Helio-Strob micro2</td>
			<td >ELMED Dr. Ing. Mense GmbH, Heiligenhaus, Germany</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Humidifier</td>
			<td >Custom made</td>
			<td >Voice Research Lab, Dept. Biophysics, Faculty of Sciences, Palacky University Olomouc, Czech republic</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Subglottic tract</td>
			<td >Custom made adjustable subglottic tract</td>
			<td >Voice Research Lab, Dept. Biophysics, Faculty of Sciences, Palacky University Olomouc, Czech republic</td>
			<td >Hampala, V., Svec, Jan, Schovanek, P., and Mandat, D. Uzitny vzor c. 25585: Model subglotickeho traktu. [Utility model no. 25585: Model of subglottal tract] (In Czech) Soukup, P. 2013-27834(CZ 25505 U1), 1-7. 24-6-2013. Praha, Urad prumysloveho vlastnictvi</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemi-laryngeal setup for studying vocal fold vibration in three dimensions

La voz de los seres humanos y la mayoría de los mamíferos no humanos se genera en la laringe a través de la oscilación autosostenible de las cuerdas vocales. Documentación visual directa de la vibración de la cuerda vocal es un reto, especialmente en los mamíferos no humanos. Como alternativa, extirpada laringe experimentos proporcionan la oportunidad para investigar la vibración vocal bajo condiciones fisiológicas y físicas controladas. Sin embargo, el uso de una laringe completo simplemente proporciona una vista superior de las cuerdas vocales, excepto las porciones cruciales de las estructuras oscilantes de la observación durante su interacción con las fuerzas aerodinámicas. Esta limitación puede ser superada mediante la utilización de una configuración de hemi-laringe donde la mitad de la laringe se mid-sagittally retira, proporcionando una superior y una vista lateral del doblez vocal restante durante oscilación autosostenida.
Aquí, se da una guía paso a paso para la preparación anatómica de las estructuras de la hemi-laríngea y su montaje en el Banco de laboratorio. Fonación ejemplar de la preparación de la hemi-laringe está documentado con datos de alta velocidad videos capturados por dos cámaras sincronizadas (vistas superiores y lateral), mostrando del movimiento tridimensional del doblez vocal y área contacto variables en el tiempo correspondiente. La documentación de la configuración de la hemi-laringe en esta publicación facilitará la aplicación y constancia fiable en la investigación experimental, los científicos de la voz proporciona el potencial para entender mejor la biomecánica de la producción de la voz.

Ilustraciones de la preparación de la hemi-laringe y su montaje en el tubo de suministro de aire, como se indica en el apartado anterior, se encuentran en la figura 1 y figura 2, respectivamente.
Documentación de la vibración de la cuerda vocal desde dos ángulos de cámara
Inducida por el ...

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Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Este papel presenta un protocolo para la preparación de las muestras de hemi-laringe facilitando una visión multidimensional de la vibración de la cuerda vocal, con el fin de investigar diversos aspectos biofísicos de la producción de la voz en los seres humanos y no humanos mamíferos.

Configuración de Hemi-laríngea para el estudio de vibración de la cuerda vocal en tres dimensiones

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

hemi-laryngeal-setup-for-studying-vocal-fold-vibration-three

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K vistas.  Palacky University Olomouc. Este papel presenta un protocolo para la preparación de las muestras de hemi-laringe facilitando una visión multidimensional de la vibración de la cuerda vocal, con el fin de investigar diversos aspectos biofísicos de la producción de la voz en los seres humanos y no humanos mamíferos.

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Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Basada en el chip tridimensional de cultivo celular en perfundido Micro-biorreactores

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Investigación

Biología

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Un modelo In Vitro para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

El cultivo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En tres dimensiones en el Laboratorio

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Enfoques cuantitativos para el estudio de las estructuras celulares y la morfología de los organélilos en Los cenoheman

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The Quadruple&#160;checkerboard, also called the Q-checkerboard, aims at maximizing the number of possible combinations that can be obtained between four drugs in one experiment to minimize the time and work needed to accomplish the same results with other protocols. This protocol is based on the simple micro dilution technique where the drugs are diluted and combined together in several 96-well plates.
In the first set of 96-well plates, Muller-Hinton broth is added followed by the first required drug (e.g., Cefotaxime here) to serially dilute it. After the first step is done, another set of 96-well plates is used to dilute the second drug (e.g., Amikaci), which will be transferred by removing a specific volume of drug 2 and put in the corresponding wells in the first set of 96-well plates that contains drug one. The third step is done by adding the required concentrations of the third drug (e.g., Levofloxacin), to the appropriate plates in the initial set containing combination of drug 1 and 2. The fourth step is done by adding the required concentrations of the fourth drug (e.g., Trimethoprim-sulfamethoxazol) into the appropriate plates in the first set. Then, E. coli ESBL bacterial inoculum will be prepared and added.
This method is important to evaluate all the possible combinations and has a wider range of possibilities to be tested furthermore for in vivo testing. Despite being a tiring technique requiring a lot of focus, the results are remarkable and time saving where a lot of combinations can be tested in a single experiment.

This protocol describes how to study all possible combinations that can be obtained between four drugs in one single experiment. This method is based on the standard 96-well plate micro dilution assay and the calculation of fractional inhibitory concentrations (FICs) to evaluate the results.

Cuádruple-Checkerboard: Una modificación del tablero de ajedrez tridimensional para el estudio de combinaciones de drogas

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often require indirect methods due to their small diameter (40-250 nm), which is beneath the diffraction limit of typical light microscopy. We have developed a super-resolution microscopy-based visualization of EVs to bypass the diffraction limit in both two and three dimensions. Using this approach, we can resolve the three-dimensional shape of EVs to within +/- 20 nm resolution on the XY-axis and +/- 50 nm resolution along the Z-axis. In conclusion, we propose that super-resolution microscopy be considered as a characterization method of EVs, including exosomes, as well as enveloped viruses.

Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) is used to bypass the typical diffraction limit of light microscopy and to view exosomes at the nanometer scale. It can be employed in both two and three dimensions to characterize exosomes.

Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa de vesículas extracelulares en tres dimensiones

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display intelligent behaviors. In both natural and artificial systems, learning is the adaptive updating of system parameters based on new information, and intelligence is a measure of the computational process that facilitates learning. Stentor coeruleus is a unicellular pond-dwelling organism that exhibits habituation, a form of learning in which a behavioral response decreases following a repeated stimulus. Stentor contracts in response to mechanical stimulation, which is an apparent escape response from aquatic predators. However, repeated low-force perturbations induce habituation, demonstrated by a progressive reduction in contraction probability. Here, we introduce a method for quantifying Stentor habituation using a microcontroller board-linked apparatus that can deliver mechanical pulses at a specified force and frequency, including methods for building the apparatus and setting up the experiment in a way that minimizes external perturbations. In contrast to the previously described approaches for mechanically stimulating Stentor, this device allows the force of stimulation to be varied under computer control during the course of a single experiment, thus greatly increasing the variety of input sequences that can be applied. Understanding habituation at the level of a single cell will help characterize learning paradigms that are independent of complex circuitry.

Studying Habituation in Stentor coeruleus

We introduce a method for quantifying Stentor habituation using a microcontroller board-linked apparatus that can deliver mechanical pulses at a specified force and frequency. We also include methods for assembling the apparatus and setting up the experiment in a way that minimizes external perturbations.

Estudiando la habituación en Stentor coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display ...

Configuración de Hemi-laríngea para el estudio de vibración de la cuerda vocal en tres dimensiones

Resumen

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Capítulos en este video

Basada en el chip tridimensional de cultivo celular en perfundido Micro-biorreactores

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados en Xenopus Ovocitos

FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

Un modelo In Vitro para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi

El cultivo de

Enfoques cuantitativos para el estudio de las estructuras celulares y la morfología de los organélilos en Los cenoheman

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