Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO G.0856.13N) y el Consejo de Investigación de la Universidad Católica de Lovaina (OT / 13/113). KDC es financiado por el FWO Bélgica. AH es financiado por OT / 13/113. Nos gustaría dar las gracias a la instalación Cell Imaging Core de la Universidad Católica de Lovaina (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) para el uso del microscopio confocal.

<ol>
	<li>Cummings, A. M., Yochim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+uterus+in+preparation+for+gestation:+a+model+for+the+action+of+progesterone.">Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone.</a> J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).</li><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+regulation+of+menstruation.">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li><li>Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+signals+direct+the+formation+of+tight+junctional+permeability+barrier+in+the+decidualizing+stroma+during+embryo+implantation.">Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).</li><li>Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+vasculogenesis+in+pregnancy.">Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).</li><li>Power, M. L., Schulkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The evolution of the human placenta. , (2012).</li><li>Finn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+of+the+decidual+cell+reaction+in+the+uterus+of+the+aged+mouse.">The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse.</a> J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).</li><li>Grant, K. S., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mouse+uterine+stromal+cells+on+epithelial+cell+transepithelial+resistance+(TER)+and+TNFalpha+and+TGFbeta+release+in+culture.">Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture.</a> Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).</li><li>De Clercq, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+transient+receptor+potential+channels+in+human+endometrial+stromal+cells+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle.">Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).</li><li>Pieper, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vimentin+expression+in+cultured+epithelial+cells.">Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells.</a> Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).</li><li>Greaves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+endometriosis+mimics+human+phenotype+and+reveals+insights+into+the+inflammatory+contribution+of+shed+endometrium.">A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium.</a> Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).</li><li>Pierro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+modulate+estrogen+responsiveness+in+normal+human+endometrium.">Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium.</a> Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).</li><li>Kim, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone-dependent+release+of+transforming+growth+factor-beta1+from+epithelial+cells+enhances+the+endometrial+decidualization+by+turning+on+the+Smad+signalling+in+stromal+cells.">Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).</li><li>Chen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculturing+human+endometrial+epithelial+cells+and+stromal+fibroblasts+alters+cell-specific+gene+expression+and+cytokine+production.">Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production.</a> Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Decidualization es la diferenciación de progesterona dependiente de las células del estroma endometrial a las células deciduales ronda secretoras. En humanos, este proceso se produce de forma espontánea durante la fase lútea del ciclo menstrual y se inicia en las células del estroma que rodean a las células vasculares para formar el predecidua. Sin embargo, en los roedores, la presencia de un blastocisto es imperativo para inducir decidualization. El hecho de que decidualization sólo se produce después del contacto con las células epiteliales del endometrio implica que los factores importantes son secretadas por las células epiteliales para inducir decidualization en el estroma subyacente. Aunque esta diferencia en la iniciación del proceso de decidualization debe ser reconocido, el hecho de que decidualization humano se vuelve más robusta a la implantación del embrión sugiere que mecanismos similares podrían estar involucrados. In vitro de cultivos celulares a menudo se utilizan para estudiar el efecto de moléculas específicas durante el proceso de decidualization.Sin embargo, la disponibilidad y la cantidad de tejido humano que puede ser recogida suele ser limitada y acompañadas de variaciones, por ejemplo, la fase del ciclo, número de embarazos y la presencia de enfermedades ginecológicas como la endometriosis o adenomiosis. Muchos de estos problemas pueden evitarse con el uso de tejido murino que es fácilmente accesible y la fase del ciclo independiente. Otra gran ventaja de la utilización de tejido murino es la oportunidad de utilizar los roedores modificados genéticamente y por la posibilidad de instalar un gran número de experimentos. Por el momento, muchos protocolos de aislamiento diferentes se han descrito en la literatura con alta variabilidad en la edad de los animales y el período en la fase de estro en el momento de uso. En este estudio se presenta un nuevo método para endometriales co-cultivos primarios de células estromales y epiteliales en el que se aprovechó de un ciclo estral estandarizada por una inyección diaria de estrógeno antes del aislamiento. Además, el estrógeno es known para inducir la proliferación en las células epiteliales y estromales que aumenta aún más el rendimiento por aislamiento. El protocolo de aislamiento descrito en este documento se basa en Grant et al. 7, sin embargo, se incluyeron otras medidas de optimización para aumentar el rendimiento, la pureza y la viabilidad de los diferentes cultivos celulares. En primer lugar, HBSS siempre fue suplementado con antibióticos para evitar la contaminación del cultivo primario. Durante el aislamiento de MEEC, se llevó a cabo una adaptación de la temperatura (15 min a 37 ° C) para aumentar la cosecha de las células epiteliales durante la primera digestión. A continuación, se incluye un paso adicional para moderar la actividad enzimática después de digestión con tripsina mediante la adición de medio que contiene FBS para inhibir su actividad. Además, MEECs se pasaron a través de un filtro de la cual la malla era más grande que lo que se describe comúnmente (100 micras) ya que a menudo vienen en racimos y láminas de células. Por otra parte, la contaminación por células estromales se redujo mediante la realización de un complementoitional etapa en la que MEECs y mESCs fueron separados basados ​​en la sedimentación por gravedad. Finalmente, MEECs se sembraron en cubreobjetos recubiertos con colágeno para aumentar la unión de las células a cubreobjetos de vidrio, como se puso de manifiesto que el apego a cubreobjetos de vidrio no recubiertas o-PLL era insuficiente. Durante el aislamiento de los mESCs, se complementó colagenasa (1 mg / ml) para mejorar la digestión. Además, esta etapa de digestión se realizó por duplicado para evitar la contaminación de MEECs restantes. Todos estos pasos adicionales resultaron en cultivos puros y viables de poblaciones celulares homogéneas. La pureza de la población de células se evaluó con inmunotinción y QRT-PCR usando vimentina como marcador del estroma y citoqueratina como un marcador epitelial. Claramente, se observó un patrón de expresión opuesto de vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC. Sin embargo, se puede notar que la expresión mRNA relativa de vimentina y citoqueratina es similar en los cultivos MEEC. similar resultados son publicados por otros grupos de investigación, en el que las células epiteliales en la expresión de vimentina cultura adquieren 9. Más importante es la diferencia en la expresión de proteínas entre vimentina y citoqueratina como se observó en los inmunohistoquímico coloraciones de las diferentes poblaciones de células. inmunotinción doble mostró que EECs fueron positivas para citoqueratina y ESC fueron positivas para vimentina. El uso de estos marcadores en la inmunotinción es un método establecido y de manera estándar utiliza para indicar los tipos de células 10. Aunque una gran cantidad de investigación se ha realizado en el decidualization de MESC, sigue siendo posible que la presencia de células epiteliales en este modelo puede alterar los resultados de decidualization. En primer lugar, se ha demostrado que si MEEC crecer a una monocapa en presencia de medio MESC acondicionado o en un entorno de co-cultivo, la monocapa tiene una resistencia eléctrica transepitelial mejorada de células epiteliales (TEER), como resultado de factores secretados por MESC 7. Por otra parte, Pierro et al. 11 proporcionan evidencia de que la proliferación epitelial, influenciado por 17β-estradiol, podría estar mediado por factores secretados por las células del estroma, y de forma alternativa, las células epiteliales pueden liberar factores que modulan decidualization estroma 12, 13. En general, es evidente que el entorno de co-cultivo epitelial-estromal ofrece una situación más fisiológica que permite la interacción paracrina y la comunicación. El método de cultivo de dos tipos de células diferentes utilizando un sistema de co-cultivo inserto se ha descrito anteriormente 14, 15 y se ha adaptado para el uso de células primarias de múrido. Por la detección de los niveles de mRNA de prolactina como de salida para leer decidualization, la técnica descrita tiene un muy reproducible de lectura de salida para decidualization disponible y permitirs así el estudio de la relación epitelial-estromal durante decidualization. paracrinos señales mediadas de MEEC podrían alterar el alcance de decidualization en las células del estroma. Además, el modelo permite la modulación específica de la parte epitelial sin afectar directamente a las células del estroma. Por lo tanto, esta co-cultivo de MEEC y MESC ofrece una herramienta perfecta para evaluar el efecto de las hormonas, citoquinas, etc., en las células epiteliales con una lectura de datos en decidualization estromal. Otra ventaja de este sistema de cultivo es que permite a los investigadores estudiar la implicación de una proteína específica en el decidualization-proceso, ya sea en el epitelial o compartimiento del estroma mediante el uso de células aisladas de animales transgénicos. Además, esta técnica será muy útil para investigar la adhesión de blastocisto para evaluar si los factores paracrinos secretadas por las células epiteliales en presencia de un blastocisto son suficientes para inducir decidualization de la estroma subyacenteCélulas. Un paso importante en la invasión del trofoblasto correlacionada con degradación de la matriz extracelular, que está mediada por la acción de enzimas proteolíticas. La técnica propuesta se puede aplicar como un modelo in vitro para investigar la diafonía entre el blastocisto, las células epiteliales y del estroma de soporte. Sin embargo, por el momento se sabe poco sobre el origen de las células epiteliales que pueden ser, así como luminal glandular. Por lo tanto, se requiere una mayor caracterización del perfil genético y molecular de las células epiteliales. Además, el método descrito está limitado en el conocimiento disponible acerca de la polarización de las células epiteliales. Por el momento, la polarización de las células epiteliales no se tuvo en cuenta. Sin embargo, diferencias en la expresión de proteínas de membrana se describen en las membranas apicales y basales. la polarización inadecuado de la capa epitelial podría tener un impacto en la interacción paracrina entre epitheliAl y las células del estroma. Sin embargo, los métodos para obtener células epiteliales polarizadas se ha descrito y se podrían incluir en la técnica descrita 15, 16. En total, el protocolo descrito propone una técnica para establecer con éxito cultivos celulares primarios de ratón epitelial endometrial y células del estroma. Esta técnica resulta en cultivos de células puras como se confirma por QRT-PCR y la inmunotinción de vimentina y citoqueratina. En última instancia, se introdujo una epiteliales y del estroma de co-cultivo que permite la investigación de las señales paracrinas mediadas por cualquiera de MEEC y / o MESC en el proceso decidualization.

El endometrio humano es el revestimiento interno del útero y se somete a ciclos mensuales de descomposición y la reparación como una preparación para posibles embarazos. Se compone de una sola capa de células epiteliales que recubren el lumen uterino y el estroma subyacente que varía de espesor de acuerdo con las fluctuaciones de las hormonas ováricas estrógenos y progesterona. Durante la fase luteal, el aumento de la progesterona posovulatorio inducirá la diferenciación de las células del estroma endometrial a las células deciduales más grandes, redondas, un proceso llamado decidualization 1, 2. En humanos, este fenómeno se produce de forma espontánea para formar el predecidua, pero se hace más pronunciada después de la implantación del embrión. A consecuencia funcional de decidualization es que el útero se vuelve transitoriamente receptivo a la implantación del embrión. Este intervalo se denomina como la &quot;ventana de implantación&quot;. Durante el período inicial de la implantación del embrión, el correo decidualizedlas células del estroma que rodean ndometrial el embrión implante proporcionarán una barrera para impedir el paso de sustancias perjudiciales para el embrión 3. Durante el embarazo, este decidua proporcionará nutrientes para el desarrollo del feto antes de placentación ha tenido lugar, y más tarde formará la parte materna de la placenta 4. Consideraciones éticas y prácticas limitan el diseño de los estudios en humanos para investigar el proceso de decidualization y han impulsado el uso de modelos animales. Al ser un miembro del grupo de placentación hemochorial, el endometrio de roedores también va a sufrir decidualization antes de la placentación 5. En los roedores, sin embargo, el inicio del proceso de decidualization depende de la presencia de los blastocistos en el lumen uterino, lo que indica que un estímulo extra es necesario para activar las respuestas deciduales 6. Esto implica una compleja comunicación entre THe células endometriales epiteliales que tienen contacto directo con el blastocisto y las células del estroma subyacente. Sin embargo, decidualization puede inducirse artificialmente mediante estímulos como el rascado mecánico o la instilación de aceite en un útero preparado hormonal. Aunque los estudios in vivo utilizando modelos artificiales decidualization nos han permitido mejorar nuestros conocimientos en el proceso complejo de señalización de decidualization, mecanicistas estudios en profundidad, por ejemplo, la investigación de la comunicación indispensable entre las células epiteliales y del estroma, son limitadas. Por lo tanto, en estudios in vitro decidualization se pueden utilizar para manipular vías importantes y estudiar los procesos fundamentales. Con este fin, los cultivos de células estromales endometriales primarios se pueden configurar de endometrio humano o de roedores. El empleo de los roedores consiente el uso de animales modificados genéticamente para investigar el papel de una proteína específica de interés durante el proceso de decidualization. Sin embargo, no maduro, prepúberratones ty se utilizan a menudo con el fin de evitar complicaciones del ciclo estral, mientras que en otros casos úteros se recogen de todas las fases del ciclo estral, lo que resulta en una heterogeneidad en los cultivos. Además, el proceso de decidualization se ha estudiado en diferentes protocolos, por ejemplo, por (i) las hormonas que complementa (estrógeno, progesterona o monofosfato de adenosina cíclico (cAMP)) al medio de cultivo, o por (ii) el aislamiento de las células deciduales de los ratones en día 4,5 de la gestación (pseudo), que exigen la necesidad adicional para la comprobación de enchufe y machos vasectomizados. Estas limitaciones demuestran la necesidad de un método estandarizado para estudiar en decidualization vitro. En este estudio, un modelo fisiológico para examinar decidualization in vitro a partir de adulto, se presentarán (pseudo) ratones no embarazadas. En este método, la inyección diaria de 17β-estradiol (E2) se induce la proliferación de las células del endometrio, dando como resultado un aumento del rendimiento de homogénea y ppoblaciones de células ure. Además, el uso de un sistema de cocultivo permite el estudio de la diafonía epitelial-estromal y la capacidad de manipular el proceso de decidualization en diferentes niveles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 &#181;m pore size; transparant</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662610</td>
			<td>Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. 
			https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0110_0110_0090_0030/13408/&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture treated 24 well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromoadenosine 3&#8242;,5&#8242;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7880</td>
			<td>Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medroxyprogesterone 17-acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1629</td>
			<td>Prepare a stock solution of 250 &#181;M in ethanol. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachis oil</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td>Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue cell viability reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13261</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-046</td>
			<td>Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-&#946; Estradiol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Prepare a stock solution of 1mg/ml in EtOH before diluting in arachis oil (1:1000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell medium filter Stericup, 0.22 &#181;m, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td> http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063&#160;&#160;&#160;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-056</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-018</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-037</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5921</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-105</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6395</td>
			<td>Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1882</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, glass, 18 mm &#216;</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td>
			<td>1001/18</td>
			<td> http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&#38;tx_rmproducts_pi1[g]=937&#38;tx_rmproducts_pi1[p]=3504&#38;tx_rmproducts_pi1[v]=20088&#38;cHash=abd12065683fe74b00eaa5e562824d06&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2674</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, polyethersulfone, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial) 100%</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.00063</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td>From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&#38;productid=354236%28Lifesciences%29#&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3292</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td> https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821296</td>
			<td> https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Tech</td>
			<td>#5741</td>
			<td>use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2562</td>
			<td>use 1/1000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td> http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&#38;region=BE&#38;gclid=Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIwBEiQAI8rq879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k8P8HAQ&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor&#38;reg;%20488\%22$;; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;priorSearchTerms=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td> http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, with calcium and magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040174</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133&#160; </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization

Decidualization es un proceso de diferenciación de progesterona dependiente de las células del estroma endometrial y es un requisito previo para el éxito de la implantación del embrión. Aunque se han hecho muchos esfuerzos para revelar los mecanismos subyacentes de decidualization, la señalización exacta entre las células epiteliales que están en contacto con el embrión y las células del estroma subyacente sigue siendo poco conocida. Por lo tanto, el estudio de decidualization de una manera que toma tanto el epitelio y las células del estroma en cuenta podría mejorar nuestro conocimiento sobre los detalles moleculares de decidualization. Para este propósito, en modelos in vivo de decidualization artificial son fisiológicamente más relevantes; Sin embargo, la manipulación de la comunicación intercelular es limitado. Actualmente, en cultivos in vitro de células del estroma endometrial se utilizan para investigar la modulación de decidualization por varias moléculas de señalización. Convencionalmente, las células estromales humanas o de ratón endometriales sonusado. Sin embargo, la disponibilidad de muestras humanas se limita, con frecuencia. Además, el uso de tejidos murinos se acompaña con variedad en el método de cultivo. Este estudio presenta un método validado y estandarizado para obtener pura de la célula epitelial endometrial (CEE) y las culturas del estroma celular (CES) que utilizan ratones intactos adultos tratados con estrógenos durante tres días consecutivos. El protocolo se ha optimizado para mejorar el rendimiento, la viabilidad y la pureza de las células y se amplió con el fin de estudiar decidualization en un cocultivo de CEE y ESC. Este modelo puede ser adecuado para explotar la importancia de ambos tipos de células en decidualization y evaluar la contribución de las moléculas de señalización importantes secretadas por la CEE o ESC durante la comunicación intercelular.

Descripción general de Protocolo La figura 1A ilustra una visión general del protocolo. Una inyección diaria de E2 (100 ng) durante tres días consecutivos se utiliza para sincronizar los animales y estandarizar la fase del ciclo estral. El ciclo estral se puede evaluar mediante lavados vaginales y se divide en el proestro, estro, diestro, y la fase metaestro. La fase del ciclo puede ser designado de acuerdo con la proporción de células descamadas en el lavado, que están sometidos a cambios hormonales. El aumento de los niveles de estrógeno hará que los animales evolucionan a la fase de estro. Esta fase puede ser fácilmente detectado por la presencia de células epiteliales cornificadas exclusivamente y la ausencia de leucocitos (Figura 1B). El día 4, úteros de los animales que se encuentran en fase de estro se recogen y MEEC y MESC están aislados (Figura 1C). c decidualizationun ser inducida mediante la adición de AMPc 0,5 mM y 1 M MPA al medio FBS 2% durante un período de incubación de 5 d. Control de calidad de MEEC y MESC culturas La pureza de los cultivos de células primarias se puede evaluar por la diferencia de vimentina y citoqueratina expresión. La vimentina es un filamento intermedio que se expresa en las células mesenquimales, por lo tanto, en las células del estroma endometrial. La citoqueratina es un filamento intermedio que se encuentra en el citoesqueleto de tejido epitelial. La figura 2A muestra el nivel de expresión de ARNm de vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC evaluó mediante QRT-PCR. vimentina niveles son altos en MESC y baja en MEEC (2,2 veces más alta, p &lt;0,001), mientras que los niveles de citoqueratina son altos en MEEC y baja en MESC (36x más alta, p &lt;0,001). Un vimentina / doble tinción de citoqueratina se realizó e indicó que las células estromales expresan vimentina, mientras que Epitcélulas helial expresan citoqueratina (Figura 2B, C). La ausencia de anticuerpo primario se utilizó como control negativo para la inmunotinción (Figura 2D, E). Estos inmunohistoquímico coloraciones muestran que tanto los cultivos de células de endometrio (MEEC y MESC) tienen una pureza de hasta el 90%. Decidualization en MEEC / cocultivos MESC Después del aislamiento, las células endometriales estromales de ratón y se sembraron en un sistema de co-cultivo para imitar el entorno de endometrio. Las células se cultivaron hasta que las células epiteliales forman una monocapa en el inserto de cultivo celular (valores de TEER de 800 - 1.000 / pocillo), y las células del estroma llegado a un estado sub-confluente. Decidualization se indujo en las células del estroma con la aplicación de cAMP 0,5 mM y 1 M MPA. Después de cinco días de incubación, los niveles de mRNA de prolactina se evaluaron en las células del estroma de QRT-PCR como una indicación para DECIDualization (Figura 3A). Los niveles de prolactina fueron altamente expresado en células sometidas a las hormonas y no detectables en las células incubadas con el medio de control (p &lt;0,01). Dado que las células epiteliales son difíciles de visualizar el interior de los insertos de cultivo celular, un ensayo de viabilidad se realizó inmediatamente después del período de incubación de cinco días (Figura 3B). Se añadió una mezcla de medio de crecimiento normal y un reactivo de viabilidad a los pocillos y se incubó durante un período de un mínimo de 8 a 12 h. El cambio de color de azul a rosa brillante indicó la presencia de células epiteliales viables. Tenga en cuenta que el cambio de color sólo se producirá cuando las células viables están presentes. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> Figura 1: Descripción General del Protocolo. (A) Esquema de la protocolo de aislamiento a partir de tresdías consecutivos de inyecciones de estrógeno. El día 3, los preparativos necesarios deben estar preparados. En el día 4, se evalúa fase de estro (indicado por la estrella) mediante la realización de un lavado vaginal. MESC y MEEC se aísla a través de diferentes fases de digestión. En el día 6, o cuando las células son confluentes, decidualization puede ser inducida en el sistema de co-cultivo mediante la adición de cAMP y MPA para el medio y un periodo de incubación de cinco días (días 6-11). (B) imagen representativa de la fase de estro se caracteriza por la presencia de células epiteliales cornificadas en el lavado vaginal (magnificación 10X). (C) imagen representativa de MESC y MEEC (ampliación 20X, barra de escala: 100 micras). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2: La inmunotinción y RT-PCR cuantitativa para vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC. (A) los niveles de ARN mensajero de vimentina y citoqueratina expresión para indicar la pureza de los cultivos. los niveles de ARN se cuantificaron relativamente a la media geométrica de los genes de limpieza ACTB y TBP. Los datos se muestran como la media ± SEM. Vimentina / doble tinción de citoqueratina en cultivos de MESC (B) y culturas MEEC (C). Insertar de la izquierda muestra una vista magnificación 63X. Control negativo con el anticuerpo primario omitido para MESC (D) y MEEC (E) (barra de escala: 50 micras). ***: P &lt;0,001 con ANOVA de dos vías con la corrección de Bonferroni para múltiples pruebas. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3: Validación de decidualization a través de RT-PCR. Niveles (A) mRNA expresión de prolactina en las células del estroma para evaluar decidualization. los niveles de ARN se cuantificaron relativamente a la media geométrica de los genes de limpieza PGK1 y TBP. El factor de cambio en las células cultivadas en el control o medio decidual se muestra como media ± SEM. (B) imágenes ilustrativas de las células del estroma antes (arriba) y después (abajo) de estímulo decidualization. El inserto de la derecha ilustra una ampliación de una célula estromal decidualized. Decidualization se caracteriza por la presencia de células multinucleadas, indicado por flechas negras. (C) Imágenes representativas de la evaluación de la viabilidad de las células epiteliales en el inserto después del ensayo. Fotos fueron tomadas inmediatamente después de la administración del reactivo de viabilidad (Prestoblue) (0 h) y el fespués de la mañana (ON). **: P &lt;0,01 con la prueba de Mann-Whitney. ON: durante la noche. Barra de escala: 100 micras. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Este estudio presenta un método estandarizado y validado para el aislamiento y cultivo de ratón primario del estroma endometrial y células epiteliales, que se puede utilizar en un sistema de cocultivo para estudiar en decidualization vitro.

Aislamiento de ratón endometrial epiteliales y células del estroma de<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

isolation-mouse-endometrial-epithelial-stromal-cells-for-vitro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

23.8K vistas.  Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven).  Este estudio presenta un método estandarizado y validado para el aislamiento y cultivo de ratón primario del estroma endometrial y células epiteliales, que se puede utilizar en un sistema de cocultivo para estudiar en decidualization vitro. 

Video: Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own body. The ability to grow bone de novo using a patient's own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient's own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

El aislamiento rápido de BMPR-IB + derivadas de tejido adiposo células estromales de uso en un Defecto La curación Modelo de calota

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In Vitro Crecimiento de los folículos Preantral ratón bajo microgravedad simulada

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

Aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales cardiacas de Endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Aislamiento de células Stromal Endometrial humanas In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...