Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson's Institute Brain Donation Program.

El registro de la donación de cerebro incluye documentación por el solicitante de registro de su intención de donar. El permiso de la autopsia para la recuperación de los tejidos es proporcionada por los familiares de lo permitido por la ley. Los estudios de investigación utilizando muestras de autopsia recogidos son revisados ​​por la Junta de Revisión Institucional (IRB) para garantizar el cumplimiento de portabilidad del seguro médico y reglamentos de la Ley de Responsabilidades (HIPAA). Nota: Las muestras leptomeninges son recogidos por el disector de cerebro o neuropathologist durante una disección cerebro y se almacenan en tubos cónicos de 50 ml que contenían 25-30 ml meninges medio de crecimiento. La muestra se almacena a 4 ° C hasta que la preparación de muestras. El tratamiento debe realizarse lo más pronto posible ya que la viabilidad de las células disminuye con el tiempo de post mortem. 1. Puesta en marcha antes de iniciar la disección leptomeninges NOTA: Los pasos 1.1 a 1.3 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad. <ol><li> Preparar medio de crecimiento meninges combinando 375 ml de Dulbecco modificado de Eagle Media, 100 ml de suero bovino fetal, 5 ml 10 mM de aminoácidos no esenciales, 5 ml 200 mM L-alanil-L-glutamina, 5 ml de piruvato sódico 100 mM, 5 ml 10000 U / ml de penicilina / estreptomicina y 5 ml 250 mg / ml de anfotericina B en 500 ml unidad de filtro. Filtrar y mezclar. Utilizar los medios de comunicación para un máximo de cuatro semanas. </li><li> Coloque todos los materiales en la cabina de bioseguridad antes de comenzar la disección: platos de Petri 4x, 2x placas de 6 pocillos, 2x escalpelos, 15-20 esterilizados cubreobjetos de 15 mm, tampón fosfato salino (PBS), pipetas serológicas, aspirando pipetas. </li><li> Añadir 1 ml de solución estéril en autoclave gelatina 0,1% a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Ajuste el plato a un lado durante 30-60 minutos. Preparar 2x placas de 6 pocillos. </li></ol> 2. Preparación de la muestra leptomeninges NOTA: Los pasos 2.1 a 2.3 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad. <ol><li> Añadir aproximadamente 10 ml de PBS paraa 10 cm placa de cultivo tisular estéril y coloque la muestra meninges en el plato. Con unas pinzas, lavar suavemente leptomeninges con PBS para eliminar la sangre. </li><li> La transferencia de las meninges en un nuevo 10-cm placa de cultivo de tejido que contenía 10 ml de PBS fresco y seguir lavando. Repetir si es necesario para eliminar la mayor cantidad de sangre posible. </li><li> El uso de dos escalpelos, cortados leptomeninges tejido en un aproximado de 6 cm x 6 cm pedazo grande. </li><li> Coloque la tapa sobre una placa de cultivo y la transferencia a un microscopio de disección en una campana de flujo laminar horizontal. </li></ol> 3. La disección de tejidos de leptomeninges NOTA: Los pasos 03.01 a 03.03 se va a realizar dentro de una campana de flujo laminar horizontal usando un microscopio de disección. <ol><li> Eliminar los vasos sanguíneos de una región en la pieza leptomeninges (paso 2.3) lo suficientemente grande como para crear al menos 20-25 3 piezas mm x 3 mm. Mantenga las leptomeninges en su lugar con una bisturí y con la otra, utilizar un mo raspado suave y poco profundación para separar los vasos. </li><li> Cortar pequeños cuadrados de tejido de la región preparados. Cortar en un proceso por etapas primero haciendo pedazos más grandes y luego cortar los en secciones más pequeñas. </li><li> Utilice uno bisturí para mantener el tejido en su lugar y otro bisturí para cortar el tejido con un movimiento de balanceo. Debido a la consistencia del tejido, es difícil deslizar los escalpelos uno contra el otro. Esto sólo se rasgará el tejido aparte y los resultados en los bordes desiguales. </li><li> Continuar el corte de las piezas por la mitad hasta que hay alrededor de 20-25 piezas de 3 mm x 3 mm. </li></ol> 4. Transferencia de disecado meninges piezas en tejido Placas de Cultivo NOTA: El paso 4 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad. <ol><li> Aspirar la gelatina de la placa de 6 pocillos (del paso 1.3). Añadir 1 ml de medio de crecimiento de las meninges a cada pocillo. El uso de pinzas estériles, coloque 3-4 piezas de biopsia en cada pocillo. </li></ol> 5. Colocación de la cubierta se desliza sobre MPiezas eninges NOTA: Los pasos 5.1 a 5.2 se va a realizar dentro de una campana de flujo laminar horizontal usando un microscopio de disección. <ol><li> Cubrir las piezas con 1-2 de 15 mm cubreobjetos circulares estériles por pocillo. </li><li> Presione hacia abajo firmemente con unas pinzas para asegurar las piezas estén en contacto con la parte inferior de la placa. Esto permite la unión de piezas de tejido a la parte inferior del pozo. </li><li> Coloque la placa de 6 pocillos en un 37 ° C, 5% de CO2. </li></ol> 6. Mantenimiento de Cultivos Celulares NOTA: Los pasos 6.1 a 6.3 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad. Manejar con cuidado las placas de cultivo como cubreobjetos no deben mover y desplazar las piezas meninges. <ol><li> Después de 2 días de cultivo, añadir 1 ml adicionales de medio de cultivo fresco meninges a cada pocillo. </li><li> En el día 7, aspirar con cuidado los medios de comunicación y añadir 2 ml de medio fresco a cada pocillo. </li><li> Después Día 9, seguirá cambiando cada medio de crecimientodos días hasta que se convierte en la cultura confluente. </li></ol> 7. pases NOTA: Todos los pasos deben ser realizados dentro de una cabina de bioseguridad. Una vez que los fibroblastos meníngeos han emigrado fuera de las piezas de tejido meníngeas y empezar a crecer hacia los bordes del recipiente de cultivo, ampliar fibroblastos meníngeos en placa de cultivo más grande. <ol><li> Antes de iniciar el passaging, capa la placa de cultivo con 1% de gelatina durante 15-30 min. </li><li> Aspirar los medios de placa de 6 pocillos y lavar las células con 2 ml de PBS. </li><li> Añadir 1 ml de tripsina / EDTA a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 5 a 10 min. No es necesario retirar los cubreobjetos o el tejido meníngeo para este paso. </li><li> Cuando las células se redondean y se empiezan a separar, añadir 2 ml de medio de cultivo. </li><li> Las células de la pipeta hacia arriba y abajo para interrumpir por completo todos los grumos y transferir la solución de células de placa de cultivo más grande. </li><li> Utilice una relación de 1: 3 a 1: 4 para combinar las células de los tres platos de 6 pocillos ena una placa de cultivo T75. </li><li> Una vez que las células fibroblastos meníngeos son confluentes en matraces de cultivo T75, trypsinize las células, y criopreservar en los medios de crioconservación en 1x10 6 células / ml por vial. Un matraz de cultivo T75 con meníngea fibroblastos confluentes contiene alrededor de 5-7 millones de células. </li></ol> 8. Caracterización de los fibroblastos meníngeos por inmunotinción NOTA: Antes de comenzar el procedimiento, preparar la solución de paraformaldehído al 4%, suero de cabra normal al 5% en PBS (tampón de bloqueo), 0,3% de Triton X-100 en PBS (tampón de permeabilización), soluciones de anticuerpos primarios y secundarios, y 1 mg / ml de Hoechst 33342 diluido en PBS a partir de 10 mg / mL de stock. <ol><li> Semilla de 15.000 a 30.000 fibroblastos meníngeos en 8 pocillos recubiertos con cámara de diapositivas 0,1% de gelatina. </li><li> Después de 24 h cuando se unen las células, fijar las células en 100 l 4% de paraformaldehído por pocillo durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x. </li><li> Permeabilizar las células con 150 l de 0,3% de Triton X-100 para 5 min a temperatura ambiente. Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x. </li><li> Añadir 200 l de solución de bloqueo (PBS + 5% de suero normal de cabra) durante 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar la solución de bloqueo, y añadir 150 l de anticuerpos primarios deseados diluido en solución de bloqueo. Por doble tinción, preparar diluciones de trabajo de los anticuerpos primarios en tubos de centrífuga separados en el hielo de la siguiente manera: <ol><li> Preparar una dilución 1: 300 de anti-fibronectina + dilución 1: 200 de anti-nestina en solución de bloqueo. Preparar una dilución 1: 250 de anti-SERPINH1 + 1: 1000 dilución de anti-Tuj1 en solución de bloqueo. Preparar 1: 250 dilución de anti-SERPINH1 + 1: 100 dilución de anti-SOX2 en solución de bloqueo </li></ol></li><li> Se incuba a 4 ° C durante la noche. </li><li> Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x. </li><li> Preparar un trabajo dilución 1: 400 de la etiqueta fluorescente secundaria de anticuerpos de cabra anti-conejo (verde; Ex / Em 2 </shasta&gt; 495/519 nm) y de cabra anti-ratón (rojo; Ex / Em 2 590/617 nm) en solución de bloqueo y añadir 100 l a cada pocillo. Incubar durante 1 h, en la oscuridad, a temperatura ambiente. Luego se lavan los pocillos una vez con PBS 1x. </li><li> Añadir 100 l de 1 mg / ml de Hoechst 33342 (azul; Ex / Em 2 358/461 nm) solución a cada pocillo y se incuba en la oscuridad durante 3 min. Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x, dejando en la final de lavado 1x PBS en el pozo, y cubrir el portaobjetos con papel de aluminio. </li><li> Analizar las células bajo el microscopio de fluorescencia. </li></ol>

<ol>
	<li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meninges:+from+protective+membrane+to+stem+cell+niche.">Meninges: from protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li><li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+stem/progenitor+cells+with+neuronal+differentiation+potential+reside+in+the+leptomeningeal+niche.">Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche.</a> J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).</li><li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meninges+harbor+cells+expressing+neural+precursor+markers+during+development+and+adulthood.">Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood.</a> Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).</li><li>Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+niches+in+health+and+diseases.">Neural stem cell niches in health and diseases.</a> Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).</li><li>Hayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+cells+induce+dopaminergic+neurons+from+embryonic+stem+cells.">Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells.</a> Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).</li><li>Nakagomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptomeningeal-derived+doublecortin-expressing+cells+in+poststroke+brain.">Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain.</a> Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).</li><li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+autopsy+donor-derived+somatic+cells.">Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells.</a> Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).</li><li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-differentiated+neural+cell+cultures+progress+towards+donor-identical+brain+tissue.">In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue.</a> Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).</li><li>Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+autopsy-derived+fibroblasts+as+a+tool+to+study+systemic+alterations+in+human+neurodegenerative+disorders+such+as+Alzheimer's+disease--methodological+investigations.">Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations.</a> J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).</li><li>Bliss, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+postmortem+human+dura+mater+and+scalp+for+deriving+human+fibroblast+cultures.">Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures.</a> PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).</li><li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+iPSC+lines+from+archived+non-cryoprotected+biobanked+dura+mater.">Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).</li><li>Adler, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+clinical+diagnostic+accuracy+of+early+vs+advanced+Parkinson+disease:+clinicopathologic+study.">Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study.</a> Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).</li><li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+clinical+diagnosis+of+idiopathic+Parkinson's+disease:+a+clinico-pathological+study+of+100+cases.">Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).</li><li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+accuracy+of+clinical+diagnosis+of+Lewy+body+Parkinson's+disease.">Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease.</a> Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).</li><li>Langston, J. W., Sch&#252;le, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisystem+Lewy+body+disease+and+the+other+parkinsonian+disorders.">Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders.</a> Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).</li><li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Sch&#252;le, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts.">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> J Vis Exp. (77), e3779 (2013).</li><li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNCA+triplication+Parkinson's+patient's+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress.">SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).</li><li>Sanders, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+mutations+cause+mitochondrial+DNA+damage+in+iPSC-derived+neural+cells+from+Parkinson's+disease+patients:+reversal+by+gene+correction.">LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction.</a> Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).</li><li>Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+dopaminergic+models+of+Parkinson's+disease.">Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease.</a> Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este protocolo describe un protocolo simple y robusto para derivar un cultivo de fibroblastos de meníngea leptomeninges postmortem humanos recogidos en conjunción con una donación cerebro. Hay muy pocas descripciones de los protocolos para derivar los cultivos celulares a partir de material humano postmortem. Dos estudios describen cultivos de fibroblastos 7, 8, de la piel derivado de 9, un estudio describe muestras Dura 10, y otro describe no criopreservados muestras Dura congelado 11. Preparamos dos placas de 6 pocillos con 2-3 piezas de tejido (aproximadamente 3 mm x 3 mm) en cada pocillo para asegurar la suficiente extensión y expansión antes de ser congelados. Es fundamental que las piezas meninges están unidos a la placa de cultivo por prensado suave una hoja de cubierta de vidrio estéril sobre las piezas de tejido para mantenerlos en su lugar. Sin un cubreobjetos, las meninges piezas será sint se adhieren a la parte inferior de la placa de cultivo. excrecencia éxito sólo se observa cuando las piezas de tejido están en contacto directo con la parte inferior de plástico. Si las piezas de tejido flotan en el medio de cultivo, no se observa crecimiento externo de células del tejido. Esto debe realizarse con unos 500 l de crecimiento de los medios para no secar las muestras y luego añadir hasta 1 ml de medio de crecimiento a la vasija. No es necesario el uso de más de silicona para mantener la cubierta se desliza en su lugar. Si las piezas son más pequeñas que 3 mm x 3 mm, la consecuencia es más lento y, en algunos casos no se puede establecer cultivos confluentes. Es fundamental no crecen las células demasiado escasa y se recomienda una relación de división de 1: 3 a 1: 4. pequeños pozos individuales permiten la contaminación potencial una mejor gestión. Wells se pueden alimentar de forma individual y pipetas deben cambiarse entre los pozos. Hemos derivado éxito meníngea fibroblastos de 9 muestras postmortem con un postmortem intervalo entre 10-24 h. Los donantes fueron entre 70 y 88 años de edad y tienen duraciones de las enfermedades de la enfermedad de Parkinson entre 8-31 años. Nos damos cuenta de que los tejidos con un intervalo post mortem ya llevan más tiempo antes de que las primeras células crecen fuera (hasta 9 días). En las muestras con intervalo post mortem más corto, observamos consecuencia, tan pronto como 3 días después de la preparación. No hemos notado una diferencia en el crecimiento basado en la edad del donante, pero sólo tuvimos donantes&gt; 70 años. La importancia del método es la obtención de un cultivo celular primario para una enfermedad neurodegenerativa esporádica como la enfermedad de Parkinson, que actualmente sólo puede ser confirmado en la autopsia 12, 13, 14 ya que están definiendo ningún plenamente las características clínicas, las técnicas de imagen o biomarcadores que pueden proporcionar un diagnóstico seguro durante la vida 15. Tenemos anteriormente devellado un protocolo para la derivación de los fibroblastos de biopsias de piel principalmente para los casos confirmados genéticamente de la enfermedad de Parkinson 16 que nos han permitido generar células madre pluripotentes inducidas y estudiar mecanismos de la enfermedad 17, 18, pero este nuevo protocolo será crucial para comparar directamente los cambios neuropatológicos con los hallazgos in vitro para la enfermedad de Parkinson esporádica. Para nuestro conocimiento, este es el primer protocolo derivado de fibroblastos meníngeos leptomeninges humanos post mortem. Cultivos de fibroblastos meníngeos directamente se pueden utilizar para el estudio de los mecanismos moleculares respecto a la enfermedad o lesión, o como una fuente para la reprogramación nuclear en células madre pluripotentes inducidas o conversión directa en cultivos neuronales como modelos preclínicos avanzados para la enfermedad de Parkinson esporádica u otros trastornos neurodegenerativos 19. estos humodelos derivados del paciente por el hombre son la base y acelerar los avances en la medicina personalizada y regenerativa.

Meninges consisten en tres membranas que protegen el cerebro: la duramadre, la aracnoides y la piamadre. Más recientemente, se ha reconocido que meninges también juegan un papel importante en el desarrollo del cerebro y el cerebro homeostasis 1. Meninges se derivan de mesenquimales y células derivadas de la cresta neural y de manera interesante, se ha demostrado que las células progenitoras que residen en meninges puede dar lugar a neuronas in vitro y después del trasplante in vivo 2, 3, 4. Culturas Meninges han sido también utilizado con éxito como capas de alimentación, ya que poseen actividad inductora de derivado de células del estroma para la diferenciación de células madre embrionarias en neuronas dopaminérgicas 5. Por otra parte, leptomeninges tienen el potencial de diferenciarse directamente en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos en condiciones isquémicas 6. Para este protocolo, humanos muestras postmortem meninges se recogen de la aracnoides y la piamadre, llamados colectivamente las leptomeninges, y se adquieren como parte de una donación de cerebro humano con fines de investigación. La disección del cerebro se lleva a cabo dentro de las 24 h de la muerte y la muestra leptomeninges se coloca en medio de cultivo frío para su posterior procesamiento en el próximo 6-8 h como se ilustra aquí en este protocolo. Este protocolo describe la disección y preparación de muestras meninges humanos para el desarrollo de cultivo de células primarias leptomeninges paciente. El tejido se corta en piezas de aproximadamente 25-30 3 mm x 3 mm cuadrados. Tres piezas se colocan en cada uno de 6 pocillos recubiertos de gelatina bien y se mantiene presionada con cubreobjetos de vidrio redondos. La disección de las meninges toma alrededor de 25-35 minutos. El principal reto con esta cultura es la esterilidad como la adquisición del cerebro, el transporte, y la disección generalmente no se llevan a cabo en condiciones estériles. Tor lo tanto, es importante para complementar los medios de cultivo con un cóctel de penicilina, estreptomicina y anfotericina B y el uso de platos de múltiples pocillos de cultivo de tejidos por separado piezas. Consecuencia de fibroblastos meníngeos ocurre generalmente dentro de la primera semana. Medios se cambia cada dos o tres días hasta que las células son confluentes y las células se pasan enzimáticamente. Los fibroblastos meníngeos son criopreservados en 1 millón de células por ml / vial en los medios de crioconservación. Con este protocolo, 20-30 millones de fibroblastos meníngeos se pueden derivar en 6-8 semanas para la criopreservación. aplicaciones posteriores de estos fibroblastos meníngeos son cultivos primarios para la investigación de enfermedades, la diferenciación neuronal directa o derivación de células madre pluripotentes inducidas a partir de las leptomeninges para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad y para el desarrollo de fármacos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1256">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:459px;">Corning Petri dishes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">351029</td>
			<td style="width:485px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc 6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-mm cover slips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">12-545-83 15CIR-1D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpels, sterile blade, No. 15</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved precision tip forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-230490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30264.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning 500 mL filter unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430770</td>
			<td>Combine media components and filter.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>178883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Growth Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Hyclone DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30081.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B (Yellow Solution/250 &#181;g/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bambanker Freeze 120 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9582225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Fibronectin Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">8 well chamber slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1256518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Glycerol&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>9455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% normal goat serum&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>101098-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Fibronectin antibody [F1]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32419</td>
			<td>1:300 dilution in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SERPINH1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5950-200ul</td>
			<td>1:250 dilution in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SOX2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4343</td>
			<td>1:100 dilution in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5326</td>
			<td>1:200 dilution in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-TUJ1</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>1:1000 dilution in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 555 anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21424</td>
			<td>1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342 stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>dilute to a final concentration of 1.0 &#956;g/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of leptomeninges explant cultures from postmortem human brain donors

A pesar de que se han hecho grandes avances en la caracterización clínica de la enfermedad de Parkinson, varios estudios indican que el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson no está confirmado patológicamente en hasta el 25% de las enfermedades clínicamente diagnosticados de Parkinson. Por lo tanto, el tejido recogido de pacientes con diagnóstico clínico de enfermedad de Parkinson idiopática pueden tener una alta tasa de diagnóstico erróneo; por lo tanto, en estudios in vitro a partir de tales tejidos para estudiar la enfermedad de Parkinson como un modelo preclínico puede llegar a ser inútil. Mediante la recopilación de las leptomeninges humanos postmortem con un diagnóstico neuropatológico confirmado de la enfermedad de Parkinson y que se caracteriza por la pérdida de células nigroestriatal y las inclusiones de proteínas intracelulares llamadas cuerpos de Lewy, uno puede estar seguro de que el parkinsonismo clínicamente observada no es causada por otra enfermedad subyacente (por ejemplo, tumores, arteriosclerosis). Este protocolo presents la disección y preparación de las leptomeninges de cadáver utilizadas para derivación de un cultivo de fibroblastos meníngea. Este procedimiento es robusto y tiene una alta tasa de éxito. El reto de la cultura es la esterilidad como la adquisición cerebro generalmente no se lleva a cabo en condiciones estériles. Por lo tanto, es importante para complementar los medios de cultivo con un cóctel de penicilina, estreptomicina y anfotericina B. La derivación de los fibroblastos meníngeos de casos confirmados de la autopsia con la enfermedad de Parkinson proporciona la base para el modelado in vitro de la enfermedad de Parkinson. fibroblastos meníngeos aparecen 3-9 días después de la preparación de la muestra y cerca de 20-30 millones de células pueden ser criopreservados en 6-8 semanas. El cultivo de fibroblastos meníngea es homogénea y las células expresan la fibronectina, un marcador utilizado comúnmente para identificar meninges.

Cuando el protocolo de procesamiento leptomeninges ha tenido éxito, primero se observa consecuencia de fibroblastos meníngeos tres a nueve días después de la disección, aunque esto puede depender de la duración del intervalo post-mortem para el cerebro. La Figura 1 muestra los cultivos de fibroblastos meníngeas de cuatro donantes diferentes. La figura 1A muestra una pieza leptomeninges sujetado por un cubreobjetos de vidrio (línea diagonal oscura) y el crecimiento de los fibroblastos del tejido alrededor de los cuatro días después de la transformación de una de 88 años de edad del donante con 10 h 20 min intervalo post mortem. La Figura 1B muestra escasa consecuencia de fibroblastos de post-procesamiento de siete días a partir de un donante de 70 años de edad y 11 h 45 min intervalo post mortem. La figura 1C muestra fibroblastos excrecencia de 13 días después de la disección de un 88 años de edad de los donantes y 24 h intervalo post mortem. La figura 1D muestra un cultivo confluente que se pasó en un Vess T75EL y las células pueden ser criopreservadas en esta etapa. Fibroblastos meníngeos son bipolar o multipolar y han alargado o formas irregulares (Figura 2). Se caracterizan por la expresión de la glicoproteína de fibronectina y el marcador de fibroblastos SERPINH que se localiza en el retículo endoplásmico (Figuras 2A-2C). Fibroblastos meníngeos no son inmuno-reactiva a SRY factor de transcripción (región determinante del sexo Y) -Box 2 (SOX2) que es un marcador para las células madre no diferenciadas (Figura 2A). Sin embargo, un subconjunto de los fibroblastos leptomeníngeo es positivo para el tipo VI nestin filamentos intermedios, un marcador de células madre neurales (Figura 2B), y la clase específica de neuronas III beta-tubulina (Tuj1) (Figura 2C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55045/55045fig1.jpg" /> Figura 1.Ejemplos de derivación de fibroblastos meníngeas de cuatro donantes diferentes. A) pieza de tejido leptomeninges se mantiene presionado por un cubre de vidrio (línea diagonal oscura) y el crecimiento de fibroblastos alrededor del tejido se observó cuatro días después de la transformación de una de 88 años de edad del donante con 10 h 20 min intervalo post mortem. B) fibroblastos Escaso excrecencia de siete días post-procesamiento de un donante de 70 años de edad y 11 h 45 min intervalo post mortem. C) meníngea consecuencia de fibroblastos 13 días después de la disección de un 88 años de edad de los donantes y 24 h intervalo post mortem. D) confluentes cultivo de fibroblastos meníngea a pases en un recipiente T75. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55045/55045fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55045/55045fig2.jpg" /> Figura 2. Immunost<html> aining de las meninges, celular, de células madre neurales, y los marcadores de las neuronas del tallo. A) La tinción de inmunofluorescencia para los marcadores de fibroblastos SERPINH1 (verde) y el vástago SOX2 marcador de células (rojo). SERPINH1 se expresó en todos los núcleos de las células contadas. Stem SOX2 marcador de células no se detectó en estos leptomeninges cultura. B) La tinción de inmunofluorescencia para fibronectina meninges específicas de marcador (verde) y el marcador de células madre neurales nestina (rojo). 52,1% de los núcleos de las células contadas fueron positivos tanto para la nestina y fibronectina. C) La tinción de inmunofluorescencia para SERPINH1 (verde) y Tuj1 marcador neuronal (rojo). 6,9% de núcleos contados fueron positivos para SERPINH1 y Tuj1. datos de recuento de células se determinaron utilizando el manual de células Contador Multi-Select herramienta en ImageJ. imágenes teñidas individuales se evaluaron mediante el recuento del número de células DAPI-positivas en comparación con el número de células positivas para cada marcador en porcentajes.lacio &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Día </td><td colspan="6"> Resultados previstos </td></tr><tr><td> 3-9 </td><td colspan="6"> Consecuencia de primeros fibroblastos meníngeos. </td></tr><tr><td> 7-18 </td><td colspan="6"> meníngea fibroblastos se expanden, y la cultura se vuelve más densa. Cambio de medio de 2 ml cada dos días. </td></tr><tr><td> 18-25 </td><td colspan="6"> placa de 6 pocillos se vuelve confluente, una vez que los fibroblastos meníngeos son confluentes se combinan tres pozos en un matraz de cultivo T75 (paso a 1: 3 a 1: 4). </td></tr><tr><td> 26-45 </td><td colspan="6"> Una confluentes resultados matraz de cultivo T75 en 5-7 millones de células. Criopreservar fibroblastos meníngeos en 1 millón de células / vial. </td></tr></tbody></table> LengüetaLe 1: Cronología de la excrecencia celular.

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Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

El protocolo de cultivo de explante de leptomeninges cerebral postmortem humana es una forma técnicamente robusto y sencillo para derivar los fibroblastos meníngeos fibronectina positiva dentro de 6-8 semanas y criopreservar aproximadamente 20-30 millones de células.

Derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem Humanos Los donantes de cerebro

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

derivation-leptomeninges-explant-cultures-from-postmortem-human-brain

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K vistas.  Parkinson’s Institute and Clinical Center.  El protocolo de cultivo de explante de leptomeninges cerebral postmortem humana es una forma técnicamente robusto y sencillo para derivar los fibroblastos meníngeos fibronectina positiva dentro de 6-8 semanas y criopreservar aproximadamente 20-30 millones de células. 

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Investigación

Neurociencias

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

Derivación de los precursores gliales restringidas de los ratones E13

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell lineage development. In vitro expansion of neural progenitors from fetal CNS tissue has been well characterized. Despite the identification and isolation of glial progenitors from adult human sub-cortical white matter and development of various culture conditions to direct differentiation of fetal neural progenitors into myelin producing oligodendrocytes, acquiring sufficient human oligodendrocytes for in vitro experimentation remains difficult. Differentiation of galactocerebroside+ (GalC) and O4+ oligodendrocyte precursor or progenitor cells (OPC) from neural precursor cells has been reported using second trimester fetal brain. However, these cells do not proliferate in the absence of support cells including astrocytes and neurons, and are lost quickly over time in culture. The need remains for a culture system to produce cells of the oligodendrocyte lineage suitable for in vitro experimentation.
Culture of primary human oligodendrocytes could, for example, be a useful model to study the pathogenesis of neurotropic infectious agents like the human polyomavirus, JCV, that in vivo infects those cells. These cultured cells could also provide models of other demyelinating diseases of the central nervous system (CNS). Primary, human fetal brain-derived, multipotential neural progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons (progenitor-derived neurons, PDN) and astrocytes (progenitor-derived astrocytes, PDA) This study shows that neural progenitors can be induced to differentiate through many of the stages of oligodendrocytic lineage development (progenitor-derived oligodendrocytes, PDO). We culture neural progenitor cells in DMEM-F12 serum-free media supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 and triiodothyronine (T3). The cultured cells are passaged at 2.5e6 cells per 75cm flasks approximately every seven days. Using these conditions, the majority of the cells in culture maintain a morphology characterized by few processes and express markers of pre-oligodendrocyte cells, such as A2B5 and O-4. When we remove the four growth factors (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) and add conditioned media from PDN, the cells start to acquire more processes and express markers specific of oligodendrocyte differentiation, such as GalC and myelin basic protein (MBP). We performed phenotypic characterization using multicolor flow cytometry to identify unique markers of oligodendrocyte.

Primary, human fetal brain-derived, multipotential progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons and astrocytes. This work shows that neural progenitors can be induced to differentiate through stages of the oligodendrocytic lineage by conditioning with select growth factors.

Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

De alta resolución de imagen de resonancia magnética estructural del subcorteza Humano<I&gt; En Vivo</I&gt; Y Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...