Los autores desean reconocer el DFG para la ayuda.

1. Hydrophobization de nanopartículas magnéticas <ol><li>para la síntesis de las partículas magnéticas hidrofóbicas, Añadir 0,85 g FECLAS 3 hexahidrato (3.14 mmol) y 0,30 g FECLAS 2 tetrahidrato (1.51 mmol) a 200 mL solución de agua y etanol (v/v de 4:1).</li>
	<li>a esta mezcla, agregar 0,20 mL 1H, 1H, 2 H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5.23 mmol) con agitación vigorosa por un agitador magnético (500 rpm). Llevar a cabo la síntesis en una atmósfera de gas inerte (N 2) utilizando un matraz de fondo redondo con un corcho para evitar la oxidación secundaria de las partículas de la magnetita.</li>
	<li>Ajustar la gota de la solución sabia con una solución de hidróxido de amonio (1,5 M) a un pH de 8 (pH determinado por un medidor de pH). Agitar la solución durante 24 horas utilizando un agitador magnético.</li>
	<li>Separar magnéticamente las partículas de la solución colocando el matraz en una barra de imán (fuerza de neodimio imán cuboides 40 x 20 x 10 mm, adhesiva 25 kg). Vierta la solución manteniendo el imán en la parte inferior del matraz.</li>
	<li>Lavar las partículas tres veces con la solución de agua y etanol durante el uso de una barra de imán como se describe en la 1.4). Seco las partículas a 60 ° C por 24 h (rendimiento aprox. 0,43 g).</li>
	<li>Para el análisis de las partículas, usar un microscopio electrónico de barrido según fabricante &#39; instrucciones s.</li>
</ol> 2. Fabricación de microreactores <ol><li>moler todas las partículas secas un poco con un mortero de vidrio y posteriormente colocar todos ellos directamente en un platillo (46 × 46 × 8 mm, poliestireno).</li>
	<li>Pipeta 10 μl reacción solución (composición como descrito en 5.1) todas las partículas y mover el peso de la cacerola levemente en forma circular de aproximadamente 10 s (masa de la partícula para un microreactor de 10 μl: aprox. 3.2 x 10 -7 kg 33). Almacenar las partículas restantes (partículas que no uno mismo-montar alrededor de la solución de reacción) a temperatura ambiente para más aplicaciones.</li>
	<li>Para medir el ángulo de contacto de los microreactores, construir un microreactor de 5 μl con agua como se describe en 2.2), coloque en una película de teflón y analizar el ángulo de contacto mediante el uso de un dispositivo de medición de ángulo de contacto óptico según fabricante &#39; s instrucciones.</li>
</ol> 3. 3D-impresión de los cuerpos de bobina <ol><li>diseño de los cuerpos de doble bobina con una altura de 16 m m (una cámara), un diámetro de 10 mm y un diámetro interior de aprox. 4 mm mediante el uso de un software de CAD según fabricante &#39; s instrucciones.</li>
	<li>Imprimir los cuerpos de bobina con una impresora 3D según el fabricante &#39; instrucciones utilizando materiales como filamentos de poliláctido. Envolver los cuerpos con un alambre de cobre 0.08 mm para conseguir 4.500 bobinas mediante el uso de una máquina de bobina controlado ordenador.</li>
</ol> 4. Fabricación de la plataforma de actuación <ol><li>organizar el doble bobinas en una matriz (por ejemplo 3 x 3) en un tablero eléctrico con un elemento Peltier, enroscar las bobinas dobles y conectarlos a un control a través de cable de cinta ( figura 3).</li>
	<li>Según la aplicación deseada, agregar una base de hierro (altura 32 mm, 4 mm de diámetro) o un imán de neodimio (12,5 mm de altura, 4 mm de diámetro, 1.035 kA m -1) en el cuerpo de la bobina para obtener un campo magnético más fuerte.</li>
	<li>Para terminar la plataforma Coloque una placa, preferiblemente cristal de cuarzo, con una altura máxima de 1 mm en la matriz de la bobina.</li>
	<li>Lugar en la superficie de la plataforma de un microreactor.</li>
	<li>Para retirar las partículas superiores de la solución de reacción y así abrir un microreactor activa una bobina con un imán de neodimio interior usando el control mencionado en la 4.1). Para cerrar el microreactor desactivar nuevamente la bobina de.</li>
	<li>Para combinar dos microreactores que inicialmente son aprox. 10 mm. utiliza imanes de neodimio como se describe en 4.2). Levante el imán en el cuerpo de la bobina requerida mediante la activación de las bobinas para aprox. 25 s abra un microreactor (distancia entre imán y microreactores mentiras aproximadamente 12 mm) y uno en la misma posición en la plataforma de.</li>
	<li>Enfriar la reacción solución en microreactores en la superficie de la plataforma y disminuir la temperatura de la bobina encienda el elemento Peltier colocado debajo de la matriz de la bobina como se describe en la 4.1).</li>
</ol> 5. Reacción enzimática de microreactores fusión <ol><li>disolver con peroxidasa de rábano en una concentración de 0,1 μg mL -1 en tampón de fosfato de potasio (0.1 M, pH 6,5). Diluir el sustrato, 10-acetilo-3,7-dihydroxyphenoxazine (10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO)) con tampón de fosfato de potasio (0.1 M, pH 6,5) a una concentración de 200 μm.</li>
	<li>Uso 10 μl de cada una de estas soluciones para construir dos microreactores descrito en 2.2). Combinar los dos microreactores por medio de fuerzas magnéticas (imanes de neodimio cilindro: 12,5 mm x 4 mm, 1.035 kA m -1) como se describe en 4.6) a 25 ° C.</li>
	<li>Detectar la reacción colocando una sonda de fluorescencia (longitud de onda de excitación: 570 nm, longitud de onda emisión: 585 nm) aprox. 10 mm directamente por encima de un microreactor abierto antes de la fusión.</li>
</ol>

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	<li>Squires, T., Quake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+Fluid+physics+at+the+nanoliter+scale.">Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale.</a> Rev. Mod. Phys. 77 (3), 977-1026 (2005).</li><li>Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+in+Droplets+in+Microfluidic+Channels.">Reactions in Droplets in Microfluidic Channels.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 45 (44), 7336-7356 (2006).</li><li>Erickson, D., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+devices.">Integrated microfluidic devices.</a> Anal. Chim. 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P., Dupin, D., Suzaki, M., Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-responsive+liquid+marbles+stabilized+with+poly(2-vinylpyridine)+particles.">pH-responsive liquid marbles stabilized with poly(2-vinylpyridine) particles.</a> Soft Matter. 6 (3), 635 (2010).</li><li>Aussillous, P., Qu&#233;r&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marbles.">Liquid Marbles.</a> Nature. 411 (6840), 924-927 (2001).</li><li>Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-stick+water.">Non-stick water.</a> Nature. 411 (6840), 895-896 (2001).</li><li>Tian, J., Arbatan, T., Li, X., Shen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+marble+for+gas+sensing.">Liquid marble for gas sensing.</a> Chem. Commun. 46 (26), 4734 (2010).</li><li>Bormashenko, E., Musin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+of+water+surface+pollution+with+liquid+marbles.">Revealing of water surface pollution with liquid marbles.</a> Appl. Surf. 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K., Vandevyver, C., Rida, A., Gijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+magnetic+manipulation+of+microdroplets+on+a+chip+as+a+platform+for+bioanalytical+applications.">Two-dimensional magnetic manipulation of microdroplets on a chip as a platform for bioanalytical applications.</a> Sens. Actuator B-Chem. 117 (2), 457-463 (2006).</li><li>Sato, E., Yuri, M., Fujii, S., Nishiyama, T., Nakamura, Y., Horibe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+marbles+as+a+micro-reactor+for+efficient+radical+alternating+copolymerization+of+diene+monomer+and+oxygen.">Liquid marbles as a micro-reactor for efficient radical alternating copolymerization of diene monomer and oxygen.</a> Chem. Commun. 51 (97), 17241-17244 (2015).</li><li>Shikida, M., Takayanagi, K., Inouchi, K., Honda, H., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+wettability+and+interfacial+tension+to+handle+droplets+of+magnetic+beads+in+a+micro-chemical-analysis+system.">Using wettability and interfacial tension to handle droplets of magnetic beads in a micro-chemical-analysis system.</a> Sens. Actuator B-Chem. 113 (1), 563-569 (2006).</li><li>Sheng, Y., Sun, G., Wu, J., Ma, G., Ngai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica-based+liquid+marbles+as+microreactors+for+the+silver+mirror+reaction.">Silica-based liquid marbles as microreactors for the silver mirror reaction.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (24), 7012-7017 (2015).</li><li>Zhao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+Polymer+Aggregates+with+a+Biomimetic+Hierarchical+Structure+and+its+Superhydrophobic+Effect.">Self-organized Polymer Aggregates with a Biomimetic Hierarchical Structure and its Superhydrophobic Effect.</a> Cell Biochem. Biophys. 49 (2), 91-97 (2007).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Liquid+Marbles:+A+"Precise"+Miniature+Reactor.">Magnetic Liquid Marbles: A "Precise" Miniature Reactor.</a> Adv. Mater. 22 (43), 4814-4818 (2010).</li><li>Zhang, L., Cha, D., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remotely+Controllable+Liquid+Marbles.">Remotely Controllable Liquid Marbles.</a> Adv. Mater. 24 (35), 4756-4760 (2012).</li><li>Zhao, Y., Xu, Z., Parhizkar, M., Fang, J., Wang, X., Lin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+liquid+marbles,+their+manipulation+and+application+in+optical+probing.">Magnetic liquid marbles, their manipulation and application in optical probing.</a> Microfluid Nanofluid. 13 (4), 555-564 (2012).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superhydrophobic+magnetic+poly(DOPAm-co-PFOEA)/Fe3O4/cellulose+microspheres+for+stable+liquid+marbles.">Superhydrophobic magnetic poly(DOPAm-co-PFOEA)/Fe3O4/cellulose microspheres for stable liquid marbles.</a> Chem. Commun. 52 (9), 1895-1898 (2016).</li><li>Glettenberg, M., Niemeyer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+Peroxidase+Activity+by+Covalently+Tethered+DNA+Oligonucleotides.">Tuning of Peroxidase Activity by Covalently Tethered DNA Oligonucleotides.</a> Bioconjugate Chem. 20 (5), 969-975 (2009).</li><li>Al-Kaidy, H., Tippk&#246;tter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superparamagnetic+hydrophobic+particles+as+shell+material+for+digital+microfluidic+droplets+and+proof-of-principle+reaction+assessments+with+immobilized+laccase.">Superparamagnetic hydrophobic particles as shell material for digital microfluidic droplets and proof-of-principle reaction assessments with immobilized laccase.</a> Eng. Life Sci. 16 (3), 222-230 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para el uso exitoso de las tecnologías de microfluidos, es importante mover el volumen de reacción correspondientes a los requisitos de análisis y la síntesis biotecnológica. La plataforma de actuación presentada aquí permite mover microfluídicos gotitas por la fuerza magnética. El movimiento puede realizarse libremente en dos dimensiones en una superficie plana de una plataforma de reacción utilizando la gota líquida con una cáscara superhidrófobos magnética. Así se introduce un sistema alternativo a canales predefinidos microfluídicos con instalaciones de control de flujo compleja, como se utiliza en sistemas de microfluidos convencional, solventes y muestras. El accionamiento automatizado de gotitas pequeñas de la reacción así es una simplificación importante de las conocidas plataformas de lab on a chip. Además, esta plataforma hace posible abrir reversiblemente un microreactor para añadir y eliminar muestras de reacción. En combinación con un sistema de depósito, esto puede resultar en un alto grado de control de reacción automatizada y es el primer paso para en silico diseño microreactions en un virtual laboratorio-en-un-drop. La principal limitación de esta técnica es que los microreactores pueden construirse sólo con volúmenes pequeños (hasta aprox. 30 μL). Un paso crítico en el protocolo es la detección de la reacción enzimática dentro de los microreactores porque la sonda de fluorescencia debe ser ajustada adecuadamente. Otra posibilidad de la detección puede ser espectroscopia UV/vis.
El proceso de desarrollo de la plataforma demostró que una bobina electromagnética con un diámetro de 10 mm es suficiente para el movimiento de la gota. Por otra parte, una bobina doble rellenas de aire o un núcleo de hierro no es capaz de inducir la fuerza magnética que se necesita para abrir un shell microreactor. Por lo tanto, núcleos de neodimio fueron elegidos en las bobinas para realizar esta tarea. Otra vez los gradientes de campo magnético resultante pueden ser variados mediante movimiento electromagnética del imán vertical a la plataforma de reacción. El tamaño de la echada de la plataforma sólo está limitado por el control. El control ya existente y el software está diseñado y listo para usar para una matriz de 10 x 10. El elemento Peltier no es necesaria para las aplicaciones descritas, pero puede ser necesario cuando el microreactor tiene que fijarse por un tiempo más largo y permite que se enfríe la mezcla de reacción sobre la superficie de la plataforma.
En el futuro, la combinación de la plataforma de actuación con los mármoles líquidos puede funcionar como laboratorio-en-un-gota-sistemas flexibles para la aplicación de exámenes, análisis ópticos rápido y complejo enzima cascada reacciones con volúmenes muy pequeños de la reacción. Además, la plataforma puede utilizarse para análisis químicos (bio-) tales como PCR, electroforesis o ELISA. Por otra parte, la proyección de enzimas relevantes nuevos, industriales y amplificaciones de aptámeros es prometedoras posibilidades.

Aplicaciones técnicas con micro reacciones se llevan a cabo predominante en fichas predefinidas microchannel. Estos sistemas son ampliamente establecidos y ampliamente descritos en la literatura (entre otras cosas 1,2,3). En 2011, el volumen de negocios de tecnologías de microfluidos en todo el mundo totalizaron 6,2 billones euro 4. En contraste, el uso de compartimientos del reactor micro libremente movible fue previamente sólo revisado y publicado hasta cierto punto. El método más común para el movimiento acuosas gotitas micro es electrowetting 5. Otros métodos para el movimiento de las gotas sobre las superficies se basan en campos eléctricos 6, fuerza magnética 7 o 8de actuación acústica. Debido a su superficie desfavorable relación, estos sistemas microreactor basada en gotas están expuestos a efectos de fuerte evaporación. Así, el movimiento de la gota generalmente se establece como un sistema de dos fases líquido, donde la fase superior tiene un elevado punto de ebullición contra evaporación de la fase acuosa. Sin embargo, este enfoque implica un alto riesgo de contaminación de la gota de la reacción por la incontrolada difusión. Esto es un obstáculo importante para la creación técnica de los sistemas mencionados.
Trabajo reciente se refiere a las transiciones de fase de líquido-sólido no adherente. Un enfoque muy eficaz es el uso de superficies superhidrófobos, que permite la formación de gotas acuosas esféricas. Una extensión de este concepto de reacción es el uso de compartimientos de la micro reacción con una superhidrófobos superficie o cáscara, que por ejemplo puede consistir en partículas de politetrafluoroetileno (PTFE) 9. Sus ángulos de contacto en las superficies suelen estar en el rango de 160° (dependiendo de la rugosidad de la superficie). Los compartimientos esféricos así ofrecen mínima resistencia al movimiento en una superficie y al mismo tiempo proporcionan una protección contra la evaporación del agua.
Gotas acuosas recubiertas con partículas PTFE tamaño micro pueden mantener su forma esférica hasta alrededor de 2 mm de diámetro. En volúmenes más altos, la cáscara hidrofóbica generalmente no está completamente cerrada ya 10. La influencia de otros materiales de la cáscara y la expansión del campo de aplicación del líquido mármol en solventes no polares se implementó por Gao y McCarthy usando líquidos iónicos 12. Para la formación de conchas basada en partículas hidrofóbicas, diámetros de partículas en tamaños de 10 nm-30 μm hasta ahora han sido descritas 11,14,16. Nuevos estudios demostraron que nanopartículas hidrofóbicas como material de la cáscara son de uso incluso mejor que el de micropartículas 13. Primeros estudios de estabilidad confirmaron un aumento en la estabilidad cuando se reduce el tamaño de partícula de ca. 600 nm a aprox. 100 nm. Esto resulta probablemente de la distribución de partículas más densa alrededor de la esfera acuosa 15.
La protección de los compartimientos de la reacción acuosa por una cáscara hidrofóbica y su designación como mármoles de líquido primero fue descrita en 2001 por Aussillous et al. y Mahadevan et al. 17 , 18. desde entonces, se han descrito algunas aplicaciones de estos compartimientos de reacción definidas. Por ejemplo, un sensor de gases basado en mármoles líquido 19 y un método de detección de contaminación del agua sobre una base cualitativa ópticamente han sido desarrollados 20. Los autores distinguen las ventajas de alta reacción y el bajo consumo de productos químicos de sus sistemas de reacción micro. Publicaciones más recientes tratan de la producción de mármoles líquido sensible al pH 16 o la representación de 'Partículas Janus' con dos diversas capas de diferente funcionalidad. Por ejemplo, Bormashenko et al. podría sintetizar un microreactor con cáscaras de teflón y semiconductor negro 21. Además se demostró que los microreactores pueden eficiente y conveniente sintetizar polyperoxides absorbiendo oxígeno externo como comonoméricas a través de la interfaz de gas-líquido permeable 24. En otro enfoque, la cáscara de la partícula-basados en sílice líquidos mármoles proporcionan las superficies de sustrato reactivo para regular el clásico espejo de plata reacción 26. Problemas actuales de investigación y desarrollo en el campo de gotitas hidrofílico-core-hidrofóbico-shell son el ajuste de tamaño de partícula, la producción reproducible de gotitas monodispersa, la mojabilidad de las superficies y el efecto de segundo shell hidrofílico en la micro reacción compartimentos 22, así como un mejor control de las trayectorias de la gota, por ejemplo, para el desarrollo de sistemas continuos de microPCR 4.
Una actuación magnética de los microreactores ofrece la ventaja de las gamas de movimiento relativamente alta y una buena selectividad de la fuerza cuando se trabaja en sistemas bioquímicos. Al utilizar partículas de magnetita hidrofóbico, que cumplen la función de la transmisión de la fuerza magnética a la circulación de los microreactores, así como la función de una cubierta hidrófoba. El movimiento magnético de gotas con partículas magnéticas dentro de una gota fue postulado por primera vez en 2006 por Lehmann et al. 23 y Shikida et al. 25, que utilizar manualmente mover imanes permanentes como actuadores para la movilización de una sola gota. Otro enfoque para mover una pequeña cantidad de líquido fue realizado por Zhao et al., quienes utilizan las partículas hidrofóbicas de4 de3O de Fe como cáscara magnética. La cáscara del mármol líquido magnético fue abierta en la parte superior de la gota por un vertical campo magnético inverso 27. Basado en este concepto, Xue et al fueron capaces de desarrollar las partículas que forman un microreactor con una tensión de superficie de Dina 20,1 cm−1 28. Lin et al. fabricados novedosas basados en celulosa micro/nano jerárquicas esferas con superparamagnetism y superhydrophobicity que proporcionan estabilidad de Dios para transporte y manipulación de gotas de líquido magnético 31. Esto hasta ahora sólo fue liberado como una prueba del principio de estudio y no utilizar para cualquier aplicación. El control eléctrico y magnético de los mármoles de líquido actualmente es perseguido en los primeros acercamientos. Zhao et al. en 2010 15 y Zhang et al 2012 29 fueron capaces de desarrollar una manipulación de gota por el movimiento manual (manual) de un imán permanente debajo de las gotitas de core-shell. Bormashenko et al. 11 lograr la aceleración de un mármol ferromagnético líquido a una velocidad de 25 cm s-1 acercando un imán de neodimio. El mencionado principio los estudios se llevaron a cabo exclusivamente por el movimiento manual de un pequeño imán permanente. Como un paso siguiente del desarrollo, Zhao et al pudieron recientemente estimar la densidad del flujo magnético necesaria para el movimiento de mármol líquido magnético variando la distancia de un imán permanente 30. Para un control de reacción comparable a la de los comunes sistemas lab-on-a-chip, parece inevitable que proporcionan los medios de control automatizado de la discreta v líquidaolumes. Para satisfacer esta necesidad, hemos desarrollado un nuevo sistema de control basado en gradientes de campo variable para fijar, mover y abrir los microreactores magnético.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">3D-printer</td>
			<td style="width:163px;">FelixPrinters</td>
			<td style="width:211px;">Pro1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A12222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:163px;">TU-KL</td>
			<td>1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CAD software</td>
			<td style="width:163px;">Siemens</td>
			<td style="width:211px;">Soled edge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Contact angle measuring device</td>
			<td style="width:163px;">Dataphysics</td>
			<td style="width:211px;">OCA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Cylinder magnet</td>
			<td style="width:163px;">Webcraft GmbH</td>
			<td style="width:211px;">S-04-13-N</td>
			<td>https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dipotassium phosphate</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>7758-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drying oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>FD 115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>68-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">FeCl2 tetrahydrate</td>
			<td style="width:163px;">TU-KL</td>
			<td>1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">FeCl3 hexahydrate</td>
			<td style="width:163px;">TU-KL</td>
			<td>1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence probe</td>
			<td style="width:163px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:211px;">LS 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish peroxidase</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9003-99-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td>Th.Geyer GmbH &#38; Co</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peltier element</td>
			<td style="width:163px;">Conrad&#160;</td>
			<td style="width:211px;">193569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perfluoroctyltriethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51851-37-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:163px;">FEI</td>
			<td style="width:211px;">Helios NanoLab 650 DualBeam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Separation bar magnet</td>
			<td style="width:163px;">Webcraft GmbH</td>
			<td style="width:211px;">Q-40-20-10-N,&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Winding machine</td>
			<td style="width:163px;">IWT GmbH</td>
			<td style="width:211px;">FW122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aqueous droplets used as enzymatic microreactors and their electromagnetic actuation

Para la implementación exitosa de sistemas de reacción de microfluidos, como PCR y electroforesis, el movimiento de pequeños volúmenes de líquidos es esencial. En el laboratorio-en-un-chip-plataformas convencionales, solventes y las muestras pasan a través de canales definidos microfluídicos con instalaciones de control de flujo compleja. La plataforma de actuación gotita presentada aquí es una alternativa prometedora. Con él, es posible mover una gota líquida (microreactores) sobre una superficie plana de una plataforma de reacción (laboratorio en gota). La actuación de microreactores en la superficie de la plataforma se basa en el uso de fuerzas magnéticas que actúan en el exterior de las gotas de líquido que está hecho de una fina capa de partículas de magnetita superhidrófobos. La superficie de la plataforma es necesaria para evitar cualquier contacto entre la base líquida y la superficie para permitir un movimiento suave de los microreactores. En la plataforma, microreactores de uno o más volúmenes de 10 μl pueden ser colocados y movidos al mismo tiempo. La plataforma sí mismo consiste en una matriz de 3 x 3 de bobinas dobles eléctricas que acomodar corazones neodimio o hierro. Los gradientes de campo magnético son controlados automáticamente. Por la variación de los gradientes de campo magnético, magnético shell hidrofóbico los microreactores puede manipularse automáticamente para mover el microreactor o abrir el shell reversible. Reacciones de los sustratos y las enzimas correspondientes se pueden iniciar por fusión de los microreactores o traerlos en contacto con la superficie catalizadores inmovilizados.

Las partículas de cáscara tienen un diámetro de alrededor de 640 nm. Las nanopartículas magnetizables dentro de esta las partículas de cáscara de fluorosilane tienen diámetros en un rango entre 22 nm y 37 nm. Un microreactor de 5 μl con agua como un núcleo líquido tenía un ángulo de contacto de alrededor de 160°.
La fuerza necesaria para mover un microreactor de 10 μl, como se describe anteriormente es 1.34 ± 0.08 µN. la figura 1 muestra la fuerza electromagnética de una bobina con 4.500 bobinados de alambre de cobre y un núcleo interior de hierro con 58 mA. La distribución de fuerza se estima un modelo de elementos finitos (FEM) para determinar las propiedades de la bobina necesaria para mover un microreactor. Como puede verse en la figura 1, la fuerza magnética dirigida por la bobina se describe es lo suficientemente fuerte como para mover un microreactor a una distancia de más de 10 mm del centro de la bobina.
La fuerza magnética para abrir un microreactor es igual a 0.85 mN ± 0.05 que es mucho mayor que la fuerza necesaria para mover la gota. Como la fuerza magnética inducida por la bobina con el núcleo de hierro (figura 1) no es lo suficientemente fuerte como para abrir un microreactor, un imán de neodimio fue utilizado en las bobinas. Alimentando las bobinas dobles en las direcciones de flujo de corriente alterna, se puede mover el imán permanente hacia o lejos de la plataforma. Así, los microreactores pueden abre o se cierra magnéticamente. Si dos microreactores con una cáscara totalmente intacta se encuentran lado a lado no combinan como la tensión superficial inhibe su fusión. Por lo tanto al menos uno debe estar abierto.
La figura 2 muestra la cinética de Michaelis-Menten resultante de fusión un microreactor de 10 μl que contiene peroxidasa con otro 10 microreactor μl que contiene el sustrato correspondiente (n = 3). Por valor de Lineweaver-Burk linearización K calculadom para la reacción dentro del microreactor es 86.85 μm ± 10.95 μm, el valormáximo de v se encuentra en 378.8 nmol L-1 s-1 ± 115,6 nmol L-1 s-1. Que el valor dem K sea en buena correspondencia con eso dado en literatura, 81 ± 3 μm 32, se puede suponer que la reacción enzimática dentro de los microreactores en pequeña escala con el material de la cáscara hidrofóbico no se influencia con respecto a afinidad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54643/54643fig1.jpg"> 
Figura 1: Simulación de una bobina con 58 la fuerza electromagnética mA y 4.500 bobinados de cobre alambre en dependencia de la distancia de los microreactores al centro de la bobina determinado FEM. El diámetro de la bobina es 10 mm, el diámetro de la base de hierro 4 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54643/54643fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54643/54643fig2.jpg"> 
Figura 2: Cinética de Michaelis-Menten de la peroxidasa se mide por la fusión de dos 10 μl microreactores. La temperatura es 25 ° C y el buffer utilizado es el fosfato de potasio (0,1 M) con un pH de 6.5. Se realizaron tres repeticiones.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54643/54643fig3.jpg"> 
Figura 3: Plataforma de actuación. La plataforma de actuación consiste en una matriz de 3 x 3 de bobinas dobles. Una bobina tiene 4.500 bobinados, una altura de 16 m m (una cámara), un diámetro de 10 mm y un diámetro interior de aprox. 4 mm. La altura de las bobinas está predefinida por la altura la utiliza cilindros de imanes de neodimio. El diámetro fue elegido porque estudios anteriores demostraron que se trata de una distancia razonable para un microreactor con este tipo de imán en movimiento. Se determinó el número de los devanados y la corriente por FEM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54643/54643fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

Sistemas de laboratorio en gota reacción permiten la aplicación versátil de reacciones complejas en una escala de microfluidos. Una plataforma de actuación automatizada que consiste en una matriz de 3 x 3 de bobinas electromagnéticas fue desarrollada y utilizado con éxito para combinar dos 10 μl microreactores y así iniciar una reacción enzimática en los mármoles líquidos resultantes.

Gotas acuosas utilizan como enzimática microreactores y su accionamiento electromagnético

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In ...

aqueous-droplets-used-as-enzymatic-microreactors-their

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

5.3K vistas.  University of Kaiserslautern. Sistemas de laboratorio en gota reacción permiten la aplicación versátil de reacciones complejas en una escala de microfluidos. Una plataforma de actuación automatizada que consiste en una matriz de 3 x 3 de bobinas electromagnéticas fue desarrollada y utilizado con éxito para combinar dos 10 μl microreactores y así iniciar una reacción enzimática en los mármoles líquidos resultantes.

Video: Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and fold into higher order nanostructures. Structurally similar to peptides, peptoids are poly N-substituted glycines, where the side chains are attached to the nitrogen rather than the alpha-carbon. Their ease of synthesis and structural diversity allows testing of basic design principles to drive de novo design and engineering of new biologically-active and nanostructured materials.
Here, a simple manual peptoid synthesis protocol is presented that allows the synthesis of long chain polypeptoids ( up to 50mers) in excellent yields. Only basic equipment, simple techniques (e.g. liquid transfer, filtration), and commercially available reagents are required, making peptoids an accessible addition to many researchers' toolkits. The peptoid backbone is grown one monomer at a time via the submonomer method which consists of a two-step monomer addition cycle: acylation and displacement. First, bromoacetic acid activated in situ with N,N'-diisopropylcarbodiimide acylates a resin-bound secondary amine. Second, nucleophilic displacement of the bromide by a primary amine follows to introduce the side chain. The two-step cycle is iterated until the desired chain length is reached. The coupling efficiency of this two-step cycle routinely exceeds 98% and enables the synthesis of peptoids as long as 50 residues. Highly tunable, precise and chemically diverse sequences are achievable with the submonomer method as hundreds of readily available primary amines can be directly incorporated.
 
Peptoids are emerging as a versatile biomimetic material for nanobioscience research because of their synthetic flexibility, robustness, and ordering at the atomic level. The folding of a single-chain, amphiphilic, information-rich polypeptoid into a highly-ordered nanosheet was recently demonstrated. This peptoid is a 36-mer that consists of only three different commercially available monomers: hydrophobic, cationic and anionic. The hydrophobic phenylethyl side chains are buried in the nanosheet core whereas the ionic amine and carboxyl side chains align on the hydrophilic faces. The peptoid nanosheets serve as a potential platform for membrane mimetics, protein mimetics, device fabrication, and sensors. Methods for peptoid synthesis, sheet formation, and microscopy imaging are described and provide a simple method to enable future peptoid nanosheet designs.

A simple and general manual peptoid synthesis method involving basic equipment and commercially available reagents is outlined, enabling peptoids to be easily synthesized in most laboratories. The synthesis, purification and characterization of an amphiphilic peptoid 36mer is described, as well as its self-assembly into highly-ordered nanosheets.

En fase sólida Submonomer Síntesis de Polímeros peptoide y su auto-ensamblaje en altamente ordenadas nanoláminas

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

Investigación

Bioingeniería

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in the tissues are important parameters for successful clinical outcomes. In order to improve tissue integration, porous metallic implants have being developed. Open porosity of metallic foams is very advantageous, since the pore areas can be functionalized without compromising the mechanical properties of the whole structure. Here we describe such modifications using porous titanium implants based on titanium microbeads. By using inherent physical properties such as hydrophobicity of titanium, it is possible to obtain hydrophobic pore gradients within microbead based metallic implants and at the same time to have a basement membrane mimic based on hydrophilic, natural polymers. 3D pore gradients are formed by synthetic polymers such as Poly-L-lactic acid (PLLA) by freeze-extraction method. 2D nanofibrillar surfaces are formed by using collagen/alginate followed by a crosslinking step with a natural crosslinker (genipin). This nanofibrillar film was built up by layer by layer (LbL) deposition method of the two oppositely charged molecules, collagen and alginate. Finally, an implant where different areas can accommodate different cell types, as this is necessary for many multicellular tissues, can be obtained. By, this way cellular movement in different directions by different cell types can be controlled. Such a system is described for the specific case of trachea regeneration, but it can be modified for other target organs. Analysis of cell migration and the possible methods for creating different pore gradients are elaborated. The next step in the analysis of such implants is their characterization after implantation. However, histological analysis of metallic implants is a long and cumbersome process, thus for monitoring host reaction to metallic implants in vivo an alternative method based on monitoring CGA and different blood proteins is also described. These methods can be used for developing in vitro custom-made migration and colonization tests and also be used for analysis of functionalized metallic implants in vivo without histology.

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

In this video, we will demonstrate modification techniques for porous metallic implants to improve their functionality and to control cell migration. Techniques include development of pore gradients to control cell movement in 3D and production of basement membrane mimics to control cell movement in 2-D. Also, a HPLC-based method for monitoring implant integration in-vivo via analysis of blood proteins is described.

Modificación Multi-Escala de implantes metálicos con gradientes de poro, polielectrolitos y su control indirecto<em&gt; En vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

El accionamiento a distancia magnética del micrométrica Sondas para<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D bacterianas Biofilm Propiedades Físicas

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimática Ensayo para medir la transcripción Inhibición por galio (III) y H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe a novel protocol employing the TiO2 photocatalysis to locally alter cell affinity of the substrate surface. For this experiment, a thin TiO2 film was sputter-coated on a glass coverslip, and the TiO2 surface was subsequently modified with an organosilane monolayer derived from octadecyltrichlorosilane (OTS), which inhibits cell adhesion. The sample was immersed in a cell culture medium, and focused UV light was irradiated to an octagonal region. When a neuronal cell line PC12 cells were plated on the sample, cells adhered only on the UV-irradiated area. We further show that this surface modification can also be performed in situ, i.e., even when cells are growing on the substrate. Proper modification of the surface required an extracellular matrix protein collagen to be present in the medium at the time of UV irradiation. The technique presented here can potentially be employed in patterning multiple cell types for constructing coculture systems or to arbitrarily manipulate cells under culture.

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.

Photopatterning proteínas y células en el medio ambiente acuoso Usando TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Fotocatálisis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

Gotas acuosas utilizan como enzimática microreactores y su accionamiento electromagnético

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Una

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Recombinante colágeno péptido Microcarriers para la extensión celular y su posible uso como sistema de células en un biorreactor modelo