Este trabajo fue financiado por el Departamento de Genética, Desarrollo y Biología Celular y la Universidad Estatal de Iowa y por el NIH subvención EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner proporcionó comentarios sobre el manuscrito.

Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Estatal de Iowa y la Universidad de Maryland. 1. Diseño TALEN <ol><li> De entrada deseada secuencia diana a un sitio web de diseño TALEN. (Por ejemplo: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Entrada elegido longitudes de matriz espaciador / repetición. <ol><li> Copiar la secuencia genómica en la casilla &quot;Secuencia&quot;. </li><li> Dentro de la pestaña &quot;Usuario Proporciona espaciador / RVD Longitudes&quot; seleccionar la longitud del espaciador y la longitud de la matriz. Nota: Las longitudes del espaciador de 15 pares de bases y repetir longitudes de matriz de 15-17 trabajo bien y hacer el montaje menos complejo. </li></ol></li><li> Seleccionar un par TALEN. pares TALEN diseñado alrededor de un sitio de enzima de restricción único permiten para el genotipado por digestión de enzima de restricciónun producto de PCR. </li><li> Cebadores Diseño para amplificar la región genómica que rodea el sitio de destino TALEN el uso de un sitio web, como Primer3 30-32. Cuando genotipo con una enzima de restricción, cebadores de diseño para amplificar una región que contiene el sitio de enzima de restricción sólo una vez. Se recomienda que esta región se amplifica y se secuenció antes de la construcción para identificar cualquier TALEN polimorfismos presentes en el A. mexicanus población laboratorio para ser utilizado para la microinyección. </li></ol> 2. Asamblea TALEN (Modificado de Protocolo TALEN Kit) 33,34 Para detalles adicionales y solución de problemas, consulte el protocolo 34. <ol><li> Preparar y secuenciar los plásmidos necesarios del kit TALEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Configurar el # 1 para las reacciones reacciones A y B. Incluir repetir variable diresidues (1-10) RVDS y la pFUS_A vector de destinación en la Reacción A. Incluir RVDS 11- (N-1) y THvector e destino pFUS_B (N-1) en la Reacción B, donde N es el número total de RVDS en la TALEN. <ol><li> Añadir a cada reacción: 1 l de cada plásmido que contiene cada RVD (100 ng / l), el vector de destino (100 ng / l), 1 l Bsa I enzima de restricción, 1 l albúmina de suero bovino (BSA) (2 mg / ml ), 1 l de ligasa, 2 l de tampón de ligasa 10X y x l de agua para un volumen total de 20 l. Por ejemplo, véase la Tabla 1. Nota: La mitad de reacciones también se pueden utilizar. </li><li> Coloque reacciones en un termociclador y ejecute el ciclo: 10 veces (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Se incuban las reacciones con nucleasa. Para cada reacción de añadir 1 l de ATP 25 mM y 1 l de nucleasa. Se incuban las reacciones a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Transformar reacciones. <ol><li> Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes. Nota: Hecho en casa c competenteells se pueden utilizar. Sin embargo, las células con baja competencia puede dar lugar a la falta de colonias. <ol><li> Mezclar 2,5 l de la reacción con 25 l de células químicamente competentes. Incubar en hielo durante cinco min. Se incuban las células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Colocar los tubos en hielo durante 2 min. Añadir 125 l de caldo de Super óptima con la represión catabólica (SOC). Agitar los tubos a 37 ° C durante 1 hora. </li></ol></li><li> Plate 100 l de las células transformadas en placas LB con espectinomicina (50 g / ml), X-gal e isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Crecer O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Escoja 2-3 colonias blancas para cada reacción y comprobar mediante PCR de colonias usando cebadores pCR8_F1 y pCR8_R1 (Tabla 2). <ol><li> Hacer una mezcla maestra de los reactivos. Por ejemplo, véase la Tabla 3. </li><li> Escoja una colonia y untarlo en el fondo de un tubo de PCR, y luego poner los restos de la colonia en 2 ml de LB con espectinomicina(50 mg / ml). Colocar 15 l de la mezcla maestra en el tubo con la colonia. </li><li> Ejecute el siguiente programa de PCR (Tabla 4) </li><li> Compruebe el PCR (ejecutar todo el volumen) en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los clones correctos tendrán una banda en el tamaño esperado, así como una mancha y una escalera de bandas. Para un ejemplo de la mancha apropiada, consulte 34,33. </li><li> Grow 2 ml de cultivos de los clones correctos en medio LB O / N a 37 ° C en una incubadora con agitación. </li></ol></li><li> Miniprep los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Secuencia de verificación de secuencia TALEN con pCR8_F1 y pCR8_R1. Siga los procedimientos descritos anteriormente 35. </li><li> El uso de los clones correctos verificadas por secuenciación, configurar la reacción # 2 (kit TALEN), que situará a los RVDS de los vectores A y B y el final de RVD en el vector de destino. <ol><li> Preparar la mezcla de reacción 2 (Tabla 5). Nota: Jareacciones LF pueden ser utilizados. </li><li> Colocar las reacciones en un termociclador y ejecute el siguiente programa: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Transformar reacciones. <ol><li> Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes. <ol><li> Mezclar 2,5 l de la reacción con 25 l de células químicamente competentes. Incubar en hielo durante 5 min. Choque térmico de las células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Colocar los tubos en hielo. Añadir 125 l de SOC. Colocar los tubos en una incubadora de agitación a 37 ° C durante 1 hr. </li></ol></li><li> Plate 100 l de las células transformadas en placas LB con ampicilina (100 mg / ml), X-gal e IPTG. Crecer O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Escoja 1-3 colonias blancas para cada reacción y comprobar mediante PCR de colonias usando cebadores TAL_F1 y TAL_R2 (Tabla 2). <ol><li> Hacer una solución de la polimerasa de Mastermix, agua y cebadores tal como sese describe en la Tabla 3. Escoja una colonia y untarlo en el fondo de un tubo de PCR, y luego poner los restos de la colonia en 2 ml de LB con ampicilina (100 mg / ml). Colocar 15 l de la solución en el tubo con la colonia. </li><li> Ejecutar el programa de PCR (Tabla 6). </li><li> Compruebe la PCR en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los clones correctos tendrán un emborronamiento y una escalera de bandas. Para un ejemplo de la mancha apropiada, consulte 34,33. </li><li> Grow 2 ml de cultivos de los clones correctos en medio LB O / N a 37 ° C en una incubadora con agitación. </li></ol></li><li> Miniprep los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Secuencia de verificación de secuencia TALEN con TAL_F1 y TAL_R2 siguiendo los métodos descritos anteriormente 35. </li></ol> 3. La transcripción de ARNm Talens <ol><li> Digerir 4 g de plantilla de secuencia verificada con 2 l Sac I durante 2 horas a 37 ° C. </li&gt; <li> Ejecutar 2 l de plásmido digerido con Sac en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los plásmidos que se digieren correctamente se mostrará una sola banda. </li><li> Se purifica el plásmido digerido con Sac restante siguiendo el protocolo de kit de purificación de PCR. Lavar dos veces con la solución de lavado antes de la elución. Eluir en 30 l de agua libre de nucleasa. </li><li> Siga el protocolo estándar para la producción de T3 mRNA. <ol><li> Configurar medias reacciones utilizando 0,5 g de plantilla linealizado (preparado anteriormente). Incubar a 37 ° C durante 2 hr. </li><li> Añadir 0,5 l de DNasa (incluido en el kit) y se incuba a 37 ° C durante 15 minutos. </li></ol></li><li> Se purifica el mRNA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluir en 30 l de agua libre de nucleasa. </li><li> Ejecutar un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis para comprobar el mRNA. <ol><li> Limpiar el aparato de gel con un producto para eliminar la contaminación de ARNasa y preparar un gel de 1,2%. </li><li> Mezcla 1 mRNA l + 4 y# 181; l de agua + 5 l de tinte de carga glioxilo libre de nucleasa. Incubar las muestras a 50 ° C durante 30 min. Centrifugar los tubos brevemente y colocar en hielo antes de ejecutar el gel. </li></ol></li><li> Comprobar la concentración utilizando un método de cuantificación de las concentraciones de ácidos nucleicos y almacenar el RNA en alícuotas a -80 ° C. Elija un tamaño de alícuota de tal manera que el ARN no está congelado / descongelado más de una vez. Nota: Las concentraciones de 500-1000 ng / nl se obtienen típicamente. ARN con una concentración más baja se puede utilizar como el tiempo que se mantiene la integridad del ARN (tal como se evaluó por una banda en lugar de una mancha en el gel). </li></ol> 4. Inyectar Astyanax mexicanus Los embriones con TALEN ARNm <ol><li> Preparar Herramientas para inyección. <ol><li> Verter en las placas de inyección mediante el vertido de 1,2% de agarosa en agua de pescado (agua acondicionada con bicarbonato de sodio y sal de mar a pH 7,4 y la conductividad de 700 mS) en una placa de Petri. Colocar un molde (pieza de plástico con las proyecciones de hacer pozos para peceshuevos) en el interior del plato. Retire el molde cuando la agarosa se ha endurecido y se almacena a 4 ° C. Para más detalles sobre el molde ver 36. </li><li> Tire de agujas para inyección utilizando un extractor de aguja de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: longitud de la aguja apropiada es importante para inyecciones. Agujas que son demasiado largos serán demasiado flexible para inyecciones. El protocolo para agujas de tracción variará con el equipo utilizado para tirar de las agujas. Un ejemplo de una aguja apropiada se muestra en la Figura 1. Para nuestro equipo, que tire las agujas que son de 5-6 cm de longitud, y tienen un diámetro exterior en la punta de aproximadamente 0,011 mm cuando se rompen. Sin embargo, las agujas deben ser calibrados (paso 4.3.4) para determinar el ancho de la abertura. Un programa de ejemplo para tirar de las agujas se puede encontrar en la Tabla 7. </li><li> Preparar pipetas de vidrio para la transferencia de embriones rompiendo la pipeta de modo que la abertura sea suficientemente grande para un huevo pase a través. Flamear el extremo roto hastaya no es agudo. Nota: Es importante utilizar pipetas de vidrio y recipientes de vidrio cuando se trabaja con A. huevos mexicanus y embriones, ya que son pegajosos y se adhieren al plástico. </li></ol></li><li> Recoge 1 de células Etapa huevos. <ol><li> Raza A. mexicanus siguiendo protocolos estándar 37. Nota: Por ejemplo, si los peces se mantienen en un 14 ciclo de luz: oscuridad 10 y usando el tiempo Zeitgerber (ZT) con Zt0 como luces encendidas y ZT14 como las luces apagadas, nuestra peces desovan superficie entre ZT15 y ZT19. la época de reproducción exacta debe determinarse para cada laboratorio individual. </li><li> Inducir el desove de los peces sobrealimentación durante 3-4 días antes del apareamiento y la colocación de los peces en agua dulce. Elevar la temperatura de 2 ° C. Nota: Nuestro temperatura inicial del agua es de aproximadamente 74 ° C. </li><li> Recoger los huevos de peces de la superficie en la oscuridad, comprobando cada 15 min para obtener huevos en la etapa de 1 célula. Cientos de huevos se pueden obtener de un único par de peces superficie. </li><li> Recogerhuevos en recipientes de vidrio para evitar que se pegue a las superficies de plástico y de tipo para aislar embriones en la etapa de 1 célula antes de la inyección mediante la observación de los huevos bajo el microscopio y la recogida de los huevos que son una sola célula. Mantenga los huevos en agua dulce del sistema (agua del tanque en el que se alojan los peces adultos, que ha sido tratado para el pH y la conductividad). </li></ol></li><li> Inyectar TALEN mRNA. <ol><li> Inyectar diferentes cantidades de mRNA total (cantidades iguales de cada TALEN en el par) para determinar la concentración óptima para la inyección como la toxicidad y la eficacia varían por TALEN par. Para empezar, la inyección de concentraciones de ARNm totales que son 400-800 pg. Diluir y combinar mRNA a concentraciones deseadas para la inyección de 1,5 nl. </li><li> Cargar diluyó ARNm en la parte posterior de la aguja y colocar la aguja a un micro-inyector. </li><li> Romper la aguja con unas pinzas. </li><li> Calibrar la aguja. Por ejemplo, expulse 10 veces y recoger el consiguiente descenso de un capilar micro. Por 10 x 100 1.0 desechable81; l, 32 mm micro capilar, la caída debe llenar el micro capilar de 0,5 mm para la inyección de 1,5 nl / 1. Ajustar el tiempo de inyección y la presión según sea necesario. </li><li> Insertar la aguja en la celda única e inyectar el ARNm. Inyectar el mRNA directamente en la célula, no en la yema. </li><li> Recoger los embriones inyectados en recipientes de vidrio. Mantener embriones a 23-25 ​​° C. Retire los embriones muertos (que se convierten en embriones nublado y de forma irregular) regularmente durante los primeros días después de la inyección. Un número récord de embriones muertos y deformes de control (no inyectada) y las placas inyectadas. Nota: El aumento de la concentración de ARNm puede conducir a un aumento de la toxicidad y la deformidad / muerte de los embriones. Por lo tanto, la toxicidad frente a la eficiencia debe ser equilibrado para determinar la mejor concentración de ARNm para inyectar. </li></ol></li></ol> 5. El fenotipo de los pescados Fundador y evaluar la eficiencia TALEN <ol><li> Sacrificar embriones de animales según el protocolo institucional. Nota: Se practicar la eutanasiaembriones se refrigera rápidamente en hielo. </li><li> Recoger los embriones en 0,8 l de PCR tiras de tubos utilizando una pipeta de transferencia. Nota: El genotipado puede realizarse en embriones o piscinas de embriones individuales. </li><li> Extraer el ADN. <ol><li> Coloque los embriones en 100 l de hidróxido de sodio 50 mM (NaOH) y se incuba a 95 ° C durante 30 min, después se enfría a 4 ° C. </li><li> Añadir 1/10 volumen (10 l) de 1 M Tris-HCl pH 8. </li></ol></li><li> Realizar una PCR en la región utilizando los cebadores diseñados en el paso 1.3 (véase las Tablas 8 y 9 para los protocolos de muestra). Para los embriones individuales 1 l de ADN es suficiente para la reacción de PCR. </li><li> Se digiere el producto de PCR resultante con la enzima de restricción apropiada y correr un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. <ol><li> Por ejemplo, para la genotipificación del locus albinismo oculocutáneo 2 (OCA2) en embriones inyectados digerir el producto de PCR usando la enzima de restricción Bsr I mediante la adición de 0.5 L de Bsr I directamente a 12,5 l de la reacción de PCR completado, incubando a 65 ° C durante 2 horas. Ejecutar el no digerido y el producto digerido en un gel. Bandas resistentes de enzimas de restricción (es decir, bandas que no digieren) indican que las mutaciones inducidas por TALEN están presentes (Figura 2). </li></ol></li><li> (Opcional) Calcular la tasa de mutación porcentaje determinando el porcentaje de producto sin cortar mediante el análisis de imágenes de los geles en Fiji 38 utilizando la herramienta de análisis de gel para calcular el valor de intensidad de cada banda como se ha descrito previamente 29. </li><li> Determinar la secuencia de los alelos mutantes por clonación TA la banda mutante resistente se purificó en gel de enzima de restricción y secuenciación de clones. <ol><li> Gel purificar la enzima de restricción banda mutante resistente siguiendo las instrucciones del fabricante. TA clonar la banda siguiendo las instrucciones del fabricante. Recoger colonias y crecer en 1,5 ml de LB O / N a 37 ° C en un zarandeoincubadora. </li><li> culturas Miniprep siguientes instrucciones del fabricante. Enviar el ADN para la secuenciación. </li><li> El uso de un programa como el mono, alinear las secuencias mutantes de la secuencia de tipo salvaje. <ol><li> Copiar y pegar las dos secuencias en archivos APE. Elija la herramienta &quot;alinear dos secuencias&quot; en el menú &quot;Herramientas&quot;. </li><li> Especificar las dos secuencias de ADN utilizando los menús desplegables. Nota: puede ser necesario utilizar dependiendo de la dirección de la PCR entró en el vector de clonación el complemento inverso de la secuencia clonada. Si las secuencias no se alinean, repita los pasos marcando la casilla &quot;Rev-Com&quot; en el cuadro &quot;ADN Align&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Evaluar los peces fundador de fenotipos en la etapa adecuada y mediante métodos apropiados para el fenotipo esperado 29 (Por ejemplo, la Figura 3). Los métodos de fenotipificación se basarán en el fenotipo esperado para el gen diana por el investigador usando el protocol. </li></ol> 6. Pantalla de transmisión de la línea germinal Nota: A. mexicanus alcanzar la madurez sexual a los 4-8 meses. <ol><li> Cruzar los peces sexualmente maduros fundador de peces de tipo salvaje. </li><li> Embriones de pantalla o peces adultos usando métodos en los pasos 5.1-5.7 (Figura 4). Para peces adultos, un trozo de la cola se puede enganchar tras la anestesia. <ol><li> Anestesiar pescado sumergiendo pescado en una solución de tricaína (éster etílico del ácido 3-aminobenzoico) para reducir la tensión durante el recorte de la aleta. Tras corte de una aleta, permiten que los peces se recuperen en agua dulce. Los peces se recuperan con rapidez; observar hasta que se recuperen (normalmente son la natación). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Grandes avances se han hecho en los últimos años hacia la comprensión de la base genética de la evolución de los rasgos. Aunque se han identificado los genes candidatos que subyacen a la evolución de una serie de rasgos, se ha mantenido un reto para poner a prueba estos genes in vivo debido a la falta de maleabilidad genética de las especies evolutivamente más interesantes. Aquí mostramos un método para la edición del genoma de A. mexicanus, una especie usada para estudiar la evolución de los animales de la cueva. La cartografía genética estudia 1,21,23 y el gen candidato se aproxima a 19,40 han identificado una serie de genes candidatos para la evolución de los rasgos en forma de cueva A. mexicanus. La reciente publicación del genoma cavefish 41 proporciona una poderosa herramienta adicional para la identificación de genes candidatos para la evolución de los rasgos de la cueva. Prueba de la función de muchos de estos genes candidatos requiere de técnicas para reducir la expresión de genes. La única opción actual para el estudioing expresión génica reducida en A. mexicanus es por el uso de morfolinos. Sin embargo, gen desmontables morfolino es transitoria, limitada a unos pocos días después de la fecundación, y no es útil para el estudio de los rasgos en los animales adultos, como las diferencias de comportamiento entre la cueva de adultos y peces de superficie como la instrucción 17, 19 hiperfagia y la atracción de vibración 42 comportamiento. Generación de pérdida de alelos función de los genes, como los que se pueden hacer usando Talens, será crítico para el ensayo de la función de los genes candidatos para estos rasgos. Se han desarrollado métodos para facilitar el montaje de pares TALEN 33 y el protocolo de detalles de este método está disponible 34. Este protocolo se ha optimizado para el uso de pez cebra por Bedell et al., 7, utilizando un vector destino final diferente, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). Este vector permite la transcripción de mRNA TALEN para la inyección en embriones de pez cebra unicelulares.Hemos utilizado este método de montaje modificada, se explica en detalle aquí, para ensamblar y transcribir Talens para la inyección en A. mexicanus. Hemos encontrado que cuando se inyecta en la superficie unicelular A. embriones mexicanus, tal como se describe en este protocolo, se podrían mutar A. genes mexicanus 29. Para futuras investigaciones sobre genes candidatos que no se describen en este protocolo, las secuencias se pueden encontrar en el genoma cavefish 41 y utilizarse para identificar sitios diana TALEN. Crítico para inyecciones exitosas es ARNm TALEN alta calidad. Por lo tanto, la comprobación de la calidad del ARN mediante la ejecución de una pequeña cantidad de ARN en un gel antes de la inyección es importante (Paso 3.6). Otras precauciones para mantener la integridad del ARN, tales como la congelación alícuotas para evitar el deshielo de congelación (paso 3.7), y el mantenimiento de condiciones estériles mediante el uso de tubos de agua limpia y libre de RNasa y consejos durante las inyecciones (paso 4), se deben tomar. Un paso crítico adicional para la cría de peces es inyectadala limpieza de embriones muertos después de la inyección, como embriones muertos pueden afectar rápidamente la calidad del agua. De este modo, se elimina embriones muertos la mañana después de las inyecciones, y periódicamente durante los próximos pocos días después de las inyecciones para mantener los embriones vivos sanos (Paso 4.3.6). TALEN mutagénesis en Astyanax mexicanus puede ser altamente eficiente; Sin embargo, la eficiencia varía en función del par TALEN inyecta 29. El aumento de las concentraciones de ARNm puede conducir a un aumento de la toxicidad y la deformidad y la muerte de los embriones inyectados. Por lo tanto, la toxicidad frente a la eficiencia debe ser probado y equilibrado para determinar la concentración óptima de mRNA para inyectar. Para los pares de TALEN altamente eficientes, fenotipos pueden ser evaluados en el pescado fundador inyectado. Por ejemplo, la inyección de Talens OCA2 focalización resultó en parches albinos en el pescado superficie 29 (Figura 3). Para otros rasgos o genes, sin embargo, la evaluación de los fenotipos en los peces fundador puede ser un reto debidoque sutilmente del fenotipo o baja eficiencia de la pareja TALEN inyectado. Por lo tanto, para muchas aplicaciones será deseable para generar mutaciones de línea germinal en un gen de interés para el análisis de la función de un gen candidato en un animal no mosaico. La obtención de la transmisión de la línea germinal de mutaciones inducidas por TALEN en A. mexicanus es posible 29 (Figura 4). Por lo tanto, esta técnica se puede aplicar para evaluar otros genes candidatos. Existen unas pocas limitaciones para realizar manipulaciones genéticas en Astyanax mexicanus en este momento. Superficie y raza cavefish en la oscuridad, tarde en la noche. En un laboratorio en el que no es posible revertir el ciclo de oscuridad luz, los investigadores deben llegar tarde por la noche para llevar a cabo inyecciones, ya que es fundamental para inyectar inmediatamente después del desove. Además, es importante recoger embriones de peces de superficie en la oscuridad, como la luz afecta el desove. Otras técnicas, en particular el sistema / Cas CRISPR (revisado en 43), existiendo para la edición del genoma y que probablemente será aplicable a A. mexicanus. De hecho, existen protocolos para el conjunto de guía de ARN que son rápida y fácil 44 y el protocolo reportados aquí pueden ser modificados para inyección CRISPR / Cas. Además, se están desarrollando nuevos rápidamente aplicaciones para editar genoma, y muchas de ellas pueden resultar útiles para A. investigadores mexicanus. Por ejemplo, en las mutaciones precisas de pez cebra se han hecho en un gen de interés por coinjecting Talens con una sola oligo hebra que contiene una mutación 7. Esta técnica podría ser útil para evaluar el papel de los alelos de la cueva en la generación de fenotipos de las cavernas, tales como el papel de una mutación sin sentido en ciertos alelos cueva de MC4R en diferencias en el metabolismo observadas entre cavefish y la superficie de los peces 19. Talens también se han utilizado para generar alelos de genes a través de recombinación homóloga que expresan marcadores fluorescentes in patrones similares a los loci endógenos 45. Estos métodos se podrían utilizar en A. mexicanus para evaluar subconjuntos de células o la expresión de genes candidatos. El sistema / Cas CRISPR se ha utilizado en el pez cebra para obtener los tejidos específicos de eliminación de genes 46. Estas técnicas, aplicadas a A. mexicanus, podría ser útil para evaluar la base genética de los procesos tales como la pérdida del ojo en cavefish. La lente tiene un papel crítico en el proceso de pérdida de ojo en cavefish 47 y el sistema / Cas CRISPR específico de tejido puede ser usado para evaluar el papel de los genes candidatos para la pérdida de ojo específicamente en la lente frente a otros tejidos del ojo. Estas y otras técnicas de edición de genoma pueden ser utilizados en A. mexicanus en futuros estudios para responder a las preguntas críticas acerca de la evolución de los rasgos de la cueva.

La comprensión de la base genética de la evolución rasgo es un objetivo de investigación crítica de los biólogos evolutivos. Se ha logrado un progreso considerable en la identificación de loci que subyacen a la evolución de los rasgos y la localización de genes candidatos dentro de estos loci (por ejemplo 1-3). Sin embargo, las pruebas funcionalmente el papel de estos genes se ha mantenido desafiante como muchos organismos utilizados para el estudio de la evolución de los rasgos no son actualmente manejable de forma genética. El advenimiento de las tecnologías de edición genoma ha aumentado considerablemente manipulabilidad genética de una amplia gama de organismos. Nucleasas de transcripción activador de efectoras (Talens) y agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPRs) se han utilizado para generar mutaciones específicas en los genes en un número de organismos (por ejemplo 4-11). Estas herramientas, aplicado en un sistema evolutivamente relevante, tienen el potencial de revolucionar la forma en que los biólogos evolutivos estudiar la base genética de la evolución. Astyanax mexicanus es una especie de pez que existe en dos formas: a. (Peces de superficie) que habitan en el río forma superficial y múltiples formas cavernícolas (cavefish) A. cavefish mexicanus evolucionó de ancestros de peces de superficie (revisado en 12). Las poblaciones de cavefish han desarrollado una serie de características, incluyendo la pérdida de los ojos, disminución o pérdida de la pigmentación, el número de papilas gustativas y neuromastos craneales, y los cambios de aumento en el comportamiento, tales como la pérdida de la conducta escolar, aumento de la agresividad, los cambios en la alimentación de la postura y la hiperfagia 13 -19. Cavefish y pescado superficie son interfértiles, y los experimentos de mapeo genético se han realizado para identificar loci y genes candidatos para los rasgos de la cueva 1,20-26. Algunos genes candidatos han sido probados para un papel funcional en la contribución a los rasgos de la cueva en el cultivo celular 1,19, en organismos modelo de otras especies de 21 o 27 por la sobreexpresión o una caída transitoria ucantar morfolinos 28 en A. mexicanus. Sin embargo, cada uno de estos métodos tiene limitaciones. La capacidad de generar alelos mutantes de estos genes en A. mexicanus es crítica para la comprensión de su función en la evolución de cavefish. Por lo tanto, A. mexicanus es un organismo candidato ideal para la aplicación de las tecnologías de edición genoma. Aquí describimos un método para la edición del genoma de A. mexicanus usando Talens. Este método se puede utilizar para evaluar mosaico inyectado peces fundador para fenotipos y para el aislamiento de líneas de pescado con mutaciones estables en los genes de interés 29.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection station</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (ordered through Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicillin (1,000x solution)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bsa&lt;/em&gt;I</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>provided with restriction enzymes</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 ligase buffer</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Quick ligation kit</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Esp&lt;/em&gt; 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td><td>Epicentre (Ordered through Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sac&lt;/em&gt; I</td><td>Promega (Ordered through Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&amp;nbsp;</td><td>Ambion (ordered through Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (ordered through Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf (ordered through Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

TALEN par inyecciones dan como resultado la unión de los RVDS a los nucleótidos de ADN específicas y por lo tanto la dimerización de los dominios de FokI, dando lugar a roturas de doble cadena 39 que pueden ser reparados a través de extremos no homólogos (NHEJ). NHEJ menudo introduce errores que resultan en inserciones o deleciones (indeles). Indeles pueden ser identificados mediante la amplificación de la región que rodea el sitio de destino TALEN y digerir el amplicón resultante con una enzima de restricción que corta dentro de la región espaciadora TALEN. Los alelos sin un indel se digerir, mientras que los alelos que contiene indeles que cambian la secuencia diana con enzimas de restricción no digerirá, produciendo una banda resistente a los enzimas de restricción (Figura 2). Inyecciones TALEN probable pueden dar lugar a mutaciones de genes bialélicos en A. mexicanus 29. Por lo tanto, algunos fenotipos pueden ser evaluados en el pescado fundador. por<html> ejemplo, se evaluó la pigmentación en peces tapa inyectada en Talens OCA2 la orientación, el gen de la hipótesis de ser responsable de albinismo en múltiples poblaciones albinas de cavefish 1,28. Encontramos parches albinos en los peces inyectados-TALEN OCA2 no está presente en el pescado sin inyectar 29 (Figura 3). Para muchos experimentos, es deseable disponer de líneas mutantes de peces para evaluar fenotipos. Fundador de pescado con alelos mutantes de transmisión puede ser identificado por genotipo de la progenie de los cruces de peces fundador a los peces de tipo salvaje (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig1.jpg" /> Figura 1. Aguja para la inyección de mRNA. Fotografía de una micropipeta antes de ser rota utiliza para inyectar TALEN ARNm en embriones unicelulares._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig2.jpg" /> Figura 2. eficiencia TALEN para OCA2. 306 productos pb de PCR de exón 9 de OCA2 en Astyanax mexicanus se examinaron para la pérdida del sitio de enzima de restricción cuando se inyectaron diferentes cantidades de mRNA 29 TALEN. El amplicón de un embrión de control se digirió mientras que una parte del amplicón era resistente a la digestión de restricción en las piscinas de 10 TALEN inyecta embriones. Restricción de digestión con enzimas de bandas resistentes a partir de embriones inyectados con mRNA TALEN dirigido OCA2 han demostrado que contienen indeles 29. Tenga en cuenta que el aumento de las concentraciones de ARNm inyectado se obtiene mayor eficiencia TALEN (ADN sin digerir más). Carriles con &quot;-&quot; son digeridas, carriles con &quot;+&quot; son DigesTed con enzimas de restricción. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig3.jpg" /> Figura 3. Fenotipificación peces fundador de los cambios en la pigmentación. (A) Superficie de control no inyectado A. mexicanus. (B) Parche que carecen de melanóforos en un pez superficie fundador inyectados con 400 pg TALEN ARNm de orientación OCA2 (flecha). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig4.jpg" /> Figura 4. transmisión de la línea germinal de mutatio TALEN inducidans. 306 bp productos PCR de exón 9 del OCA2 en A. mexicanus se examinaron para la pérdida del sitio de enzima de restricción en piscinas de 10 F 1 pescado de un pez fundador inyectado. El amplicón de un embrión de control se digirió mientras que una parte del amplicón era resistente a la digestión de restricción en las piscinas de 10 F 1 embriones. Enzima de restricción digerir bandas resistentes de F OCA2 han sido mostrados 1 s para contener indeles 29. Carriles con &quot;-&quot; están sin digerir, carriles con &quot;+&quot; son digeridos con la enzima de restricción. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reacción A </td><td></td><td></td><td> Reactien B </td><td></td></tr><tr><td> cantidad </td><td> reactivo </td><td></td><td> cantidad </td><td> reactivo </td></tr><tr><td> 4 l </td><td> agua </td><td></td><td> 10 l </td><td> agua </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pFUS_A </td><td></td><td> 1 l </td><td> pFUS_B4 </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> BsaI </td><td></td><td> 1 l </td><td> BsaI </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> BSA </td><td></td><td> 1 l </td><td> BSA </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> ligasa </td><td></td><td> 1 l </td><td> ligasa </td></tr><tr><td> 2 l </td><td colspan="2"> tampón de ligasa 10X </td><td> 1 l </td><td> tampón de ligasa 10X </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pNH1 </td><td></td><td> 1 l </td><td> pNG1 </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pNH2 </td><td></td><td> 1 l </td><td> PhD2 </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pNG3 </td><td></td><td> 1 l </td><td> pNH3 </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pHD4 </td><td></td><td> 1 l </td><td> pNI4 </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> PhD5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> PHD6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pNG7 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pHD8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pNG9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> pHD10 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Ejemplo de montaje de reacción A y B para unaTALEN contiene RVDS NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> nombre de imprimación </td><td> secuencia (5&#39;-3 &#39;) </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Los cebadores de PCR para PCR de colonias, de 34. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reactivo </td><td> cantidad </td></tr><tr><td> Mastermix Taq, 2x </td><td> 50 l </td></tr><tr><td> pCR8_F1 imprimación,10 uM </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> cebador pCR8_R1, 10 uM </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> agua libre de nucleasa </td><td> 42 l </td></tr><tr><td colspan="2"> * Ajuste de mezcla maestra si se utiliza un taq diferente </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Maestro mezcla de 100 l (15 l / reacción) por PCR de colonias 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> paso </td><td> la temperatura (° C) </td><td> tiempo (seg) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 105 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Vaya al paso 2 durante 30 ciclos </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Programa de PCR para PCR de colonias 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> cantidad </td><td> reactivo </td><td> concentración </td></tr><tr><td> 12 l </td><td> agua </td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> A vector </td><td> 100 ng / l </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> vector B </td><td> 100 ng / l </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> vector destino pT3Ts-GT </td><td> 50 ng / l </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> RVD final (PLR-RVD) </td><td> 100 ng / l </td></tr><tr><td> 1 l </td><td> Esp3I </td><td></td></tr><tr><td> 1 l </td><td> ligasa </td><td></td></tr><tr><td> 2 l </td><td colspan="2"> tampón de ligasa 10X </td></tr></tbody></table> Tabla 5. Protocolo para las reacciones de segundo montaje. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> paso </td><td> la temperatura (° C) </td><td> tiempo (seg) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 180 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Vaya al paso 2 durante 30 ciclos </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr></tbody></table> Tabla 6. Programa de PCRpara la PCR de colonias 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> calor </td><td> 290 </td></tr><tr><td> Halar </td><td> 150 </td></tr><tr><td> velocidad </td><td> 100 </td></tr><tr><td> hora </td><td> 150 </td></tr><tr><td colspan="2"> Estos parámetros son para un Flaming / Castaño Micropipeta Tirador Modelo P-97 utilizando un filamento de artesa </td></tr></tbody></table> Tabla 7. Ejemplo de programa de la aguja tirando. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reactivo </td><td> cantidad </td></tr><tr><td> Mastermix Taq, 2x </td><td> 12,5 l </td></tr><tr><td> gen cebador directo específico, 10 micras </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> gen cebador inverso específico, 10 micras </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> agua libre de nucleasa </td><td> 9.5 l </td></tr><tr><td> ADN </td><td> 1 l </td></tr><tr><td colspan="2"> * Ajuste de mezcla maestra si se utiliza un taq diferente </td></tr></tbody></table> Tabla 8. protocolo de muestra para la PCR específica de genes. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> paso </td><td> la temperatura (° C) </td><td> tiempo (seg) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 56 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Ve a SASO 2 durante 35 ciclos </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr><tr><td colspan="3"> * Ajustar la temperatura de recocido y tiempo de extensión de cebadores específicos y el tamaño del producto de PCR </td></tr></tbody></table> Tabla 9. programa de PCR de la muestra para la PCR específica de genes.

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Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish.

Edición genoma en<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Uso de transcripción activador de efector nucleasas (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

8.2K vistas.  Iowa State University.  mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish. 

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Investigación

Genética

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Biología del Desarrollo

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Aumento de la Tetra mexicano Astyanax mexicanus para análisis de fenotipos Post-larval y Immunohistochemistry Whole-mount

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

Desmontaje genético directo de las células madre neurales de la médula espinal de Axolotl a través de la electroporación de los complejos de proteína-gRNA CAS9

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount hibridación In Situ de embriones de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Edición genoma en

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