Agradecemos a finales Rudy Limburg para fabricar el perímetro del brazo de cardán, Kimberly Jamison, Mateo McHenry, y Raju Metherate por prestarnos el equipo, y Almut Kelber y Kentaro Arikawa, para el estímulo. Este trabajo fue apoyado por una Fundación Nacional de Ciencia (NSF) Licenciado beca de investigación para KJM y NSF IOS-1.257.627 a ADB

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

registro intracelular puede ser una técnica difícil de dominar debido a los muchos pasos técnicos involucrados. Para los experimentos con éxito varios puntos importantes deben ser considerados. En primer lugar, es importante tener una mesa adecuadamente aislado vibratoriamente-en el que se realiza el experimento. Muchos investigadores utilizan mesas de aire, que separan completamente de la mesa de la base, dando el aislamiento de vibración superior. Nuestra configuración consiste en una mesa de mármol de espesor con una caja de arena en la parte superior, en la que se coloca el aparato etapa micromanipulador / soporte del electrodo / muestra. Esta es una alternativa eficaz y más asequible a una mesa de aire, especialmente si el acceso al gas en la empresa o el aire comprimido es una limitación. Medidas adicionales de absorción de vibraciones pueden ser tomadas como la suspensión de aire pasiva, o la adición de elementos de amortiguación de las patas de la mesa (por ejemplo, pelotas de tenis abierto, tubos para bicicletas, almohadillas de gel de espesor). Además, es esencial que la configuración experimental estar dentro de unajaula de Faraday con todo correctamente conectado a tierra. La jaula de Faraday debe tener una pantalla de malla de metal en la parte delantera que se puede quitar cuando se trabaja dentro de la jaula y se sustituye fácilmente cuando la grabación. Incluso una pequeña cantidad de ruido eléctrico ambiente (especialmente de 50 Hz el ruido de la fuente de alimentación principal de CA) puede hacer una buena grabación de otro modo inutilizables. En la preparación de las capas de muestras, la hemolinfa y pigmentos que rodean la ommatidia puede impedir grabaciones exitosas. Si el orificio de la córnea se corta demasiado grande, el bombeo normal de hemolinfa en el cuerpo hace que la superficie del líquido para moverse hacia arriba y hacia abajo en el sitio de corte, lo que resulta en una grabación inestable. Una vez que se corta el agujero, capas de pigmento y de la superficie de la hemolinfa se coagulan rápidamente en una costra impenetrable incluso cuando se sella con gelatina de petróleo, por lo que es importante para obtener el electrodo en el ojo tan pronto como sea posible. solución de Ringer también puede ser usada en lugar de vaselina. El electrodo de tierra puede ser introducido en elpartes de la boca o en el muñón de una antena de corte. Además, a menudo es útil para mantener al animal como oscuro adaptada como sea posible. Para este método, los pasos incluyen mantener la sala de grabación muy oscuro, bloqueando la luz parásita de la lámpara de xenón de entrar en la jaula de Faraday, destellos de estímulo de corta duración (30-50 ms), y una frecuencia lo suficientemente baja entre destellos (0.5 o superior). Cuando un pigmento visual absorbe un fotón, el cromóforo en la rodopsina cambia de 11- cis -3-hydroxyretinal a todo - trans retinal, induciendo el cambio conformacional de la proteína opsina, y la activación de todo el complejo como metarodopsina, que inicia la proteína G cascada. Foto-blanqueamiento ocurre cuando la luz de alta intensidad hace que el cromóforo para separar físicamente de la proteína opsina. El tiempo es un factor limitante en este experimento debido a que el electrodo solamente de forma estable registrar las respuestas de dentro de la célula durante un cierto período de tiempo antes de que se caeo la membrana se daña. Por esta razón no rompemos para permitir que la célula se recuperan, pero sí usamos una duración del destello y la frecuencia que hemos encontrado no degrada la respuesta de la célula a través del tiempo. Es importante disminuir la frecuencia y la intensidad de la luz si se produce foto-blanqueo. Durante la grabación, la punta del electrodo grande o gran movimiento por el electrodo pueden dañar la célula al penetrar la membrana. Sólo punta fina (al menos ~ 100 mO) y pequeños movimientos deben ser utilizados cuando se acerca a una célula para la grabación. Si el registro intracelular se aplica a otras aplicaciones, tales como grabaciones cerebrales, robustas, electrodos extremadamente finas se puede tirar el uso de vidrio de cuarzo, pero un extractor especializado deben ser utilizados para estos electrodos. La primera vez que fabricar un electrodo tirando programa, se comprobó la resistencia a la punta de relleno del electrodo, lo fija en el soporte del electrodo en una configuración simulada, y la colocación de la punta y el electrodo de masa en solución salina. norteext aplicamos una corriente para medir la variación de la tensión en el osciloscopio. Para mover la punta del electrodo se utiliza un micromanipulador manual que se mueve a lo largo de dos ejes. Existen otros manipuladores incluyendo los digitales que permiten el movimiento a lo largo de los tres ejes y estos pueden ser utilizados para este o más complejas aplicaciones. Hay muchas maneras de construir un escenario para la grabación, y hay muchos tipos diferentes de hardware y software utilizados en registro y análisis de los datos observados. Nuestra configuración representa una configuración sencilla, fácil y asequible del equipo de grabación. En la construcción de la curva de VlogI, funciones desarrolladas por Naka y Rushton 33 y otros 34,35 de cuenta para las partes no lineales de las respuestas representados. Se utilizan varios métodos para adaptarse a esta curva para los datos, y que representan gráficamente los resultados de uno de tales métodos que no requiere software de ajuste de curvas, aunque otros métodos son también adecuados 36,37 ( <strong&gt; Figura 7). También puede ser útil comparar las sensibilidades espectrales de los modelos de absorbancia rodopsina a una longitud de onda máxima dada. Varios modelos publicados objetivo de reproducir espectros de absorbancia rodopsina 38,39. Una idea más precisa del espectro de absorbancia del pigmento visual se expresa en una célula fotorreceptora de insectos puede ser modelado por teniendo en cuenta las propiedades ommatidial tales como pigmentos de filtrado, pero esto requiere la medición de la fisiológico adicional y los parámetros anatómicos 11,40. Una limitación de este método es que si el organismo estudio expresa más de una opsina genéticamente similares en el ojo, puede ser difícil identificar qué opsina mRNA probable corresponde a qué clase espectral de las células fotorreceptoras. Para superar este problema, este método se ha combinado con colorante-inyecciones e hibridación in situ o inmunohistoquímica para identificar con éxito las opsinas expresarse en células grabadas 10. Nuestro método es sencillo y accesible para los investigadores no están familiarizados con la electrofisiología visual. Esta técnica es común en la neurociencia, pero específica y métodos claros están ausentes en la literatura, por lo que este método difícil de reproducir. Aunque existen muchas variaciones de esta técnica, ofrecemos una forma sencilla de medir la sensibilidad espectral en el ojo compuesto. Los datos fisiológicos es una pieza importante de evidencia en las historias de la ecología y la evolución visual 41. variación de la secuencia opsina se vincula estrechamente con la sensibilidad de una célula de fotorreceptores, por lo que este método ideal para los estudios que examinan la base genética para el cambio fenotípico. La medición de la sensibilidad de las células fotorreceptoras también puede ser emparejado con ensayos de discriminación de color de comportamiento, que muestra la base fisiológica de umbrales de discriminación importantes en la visión del color 42-46. En manipulaciones genéticas o terapéuticos en Drosophila, por ejemplo, este technique puede ser una buena manera de medir la función fisiológica adecuada del ojo o el cerebro, así 47,48. A pesar de que el nuestro no es el primero ni el método más complejo de registro intracelular en el ojo, nuestra esperanza es que podemos hacer que este método más fácilmente disponibles para la reproducción y la integración en programas de investigación fuera de la neurociencia formal.

Las propiedades eléctricas de las células tales como neuronas se observan mediante la medición de flujo de iones a través de las membranas celulares como un cambio en el voltaje o la corriente. Una variedad de técnicas electrofisiológicas han sido desarrollados para medir eventos bioeléctricos en las células. Las neuronas que se encuentran en los ojos de animales son accesibles y sus circuitos a menudo es menos compleja que en el cerebro, por lo que estas células buenos candidatos para el estudio electrofisiológico. Las aplicaciones más comunes de electrofisiología en el ojo incluyen el electrorretinograma (ERG) 1,2 y el registro intracelular de microelectrodos. ERG consiste en colocar un electrodo en o sobre el ojo de un animal, la aplicación de un estímulo de luz, y midiendo el cambio en la tensión como una suma de las respuestas de todas las células cercanas 3-6. Si uno está interesado específicamente en la caracterización de las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales, a menudo múltiples tipos de células responden de forma simultánea en diferentes puntos fuertes a un estímulo determinado; Por lo tanto,puede ser difícil de determinar las sensibilidades de los tipos celulares específicos a partir de datos ERG especialmente si hay varios tipos diferentes de células fotorreceptoras espectralmente similares en el ojo. Una posible solución es crear transgénico con el gen de Drosophila fotorreceptor (opsina) de interés se expresa en las células mayoría R1-6 en el ojo y después realizar ERGs 7. Las posibles desventajas de este método son que no a baja expresión de la proteína fotorreceptor 8, y el período de tiempo largo para la generación y detección de animales transgénicos. Para los ojos con un menor número de tipos de fotorreceptores espectralmente distintas, la adaptación del ojo con filtros de color puede ayudar con la reducción de la contribución de algunos tipos de células a la ERG, permitiendo de ese modo la estimación de máximos sensibilidad espectral 9. registro intracelular es otra técnica en la que una multa electrodo empala una célula y se aplica un estímulo. Los registros de electrodos sólo eso IndivLa respuesta de las células idual de manera que a grabar y analizar varias celdas individuales puede producir sensibilidades específicas de los diferentes tipos de células fisiológicamente 10-14. Aunque nuestro protocolo se centra en el análisis de sensibilidad espectral, los principios básicos de intracelular de grabación con electrodos afilados son modificables para otras aplicaciones. El uso de una preparación diferente de una muestra, por ejemplo, y el uso de electrodos de cuarzo afilados, se puede grabar de más profundo en el lóbulo óptico o de otras regiones en el cerebro, dependiendo de la pregunta que se hace. Por ejemplo, los tiempos de respuesta de las células fotorreceptoras individuales 15, la actividad de células en la óptica lóbulos 16 (lámina, médula o lobula 17), cerebro 18 o otros ganglios 19 también se pueden grabar con técnicas similares, o estímulos de color podría sustituirse con polarización 20 -22 o moción estímulos 23,24. Fototransducción, el proceso por el cual la luzla energía es absorbida y convertida en una señal electroquímica, es un antiguo rasgo común a casi todos los presentes el día 25 filos animales. El pigmento visual que se encuentra en las células fotorreceptoras y responsable de iniciar la fototransducción visual es la rodopsina. Rhodopsins en todos los animales se componen de una proteína opsina, un miembro de la familia 7 transmembrana G receptor acoplado a la proteína, y un cromóforo asociado que se deriva de la retina o una molécula similar 26,27. Opsin secuencia de aminoácidos y la estructura de cromóforo afectar la absorbancia de la rodopsina a diferentes longitudes de onda de luz. Cuando un fotón es absorbida por el cromóforo de la rodopsina se activa, iniciando una cascada de proteína G en la célula que en última instancia conduce a la apertura de los canales iónicos de membrana 28. A diferencia de la mayoría de las neuronas, las células fotorreceptoras se someten a posibles cambios graduales que se pueden medir como un cambio relativo en la amplitud de la respuesta con el cambio de estímulo luminoso. Normalmente, un dadotipo de fotorreceptor expresa sólo un gen de la opsina (aunque existen excepciones 8,10,29-31). la visión del color sofisticado, de la que se encuentra en muchos vertebrados y artrópodos, se consigue con un ojo complejo de cientos o miles de células fotorreceptoras cada que expresan uno o más tipos de vez en cuando rodopsina. La información visual se captura mediante la comparación de las respuestas sobre el mosaico fotorreceptor través de la señalización neural aguas abajo complejo en el ojo y el cerebro, dando como resultado la percepción de una imagen completa con el color y el movimiento. Después de medir las respuestas primas de una célula fotorreceptora a diferentes longitudes de onda de luz a través de registro intracelular, es posible calcular su sensibilidad espectral. Este cálculo se basa en el principio de univariante, que establece que la respuesta de una de las células fotorreceptoras depende del número de fotones que absorbe, pero no en las propiedades particulares de los fotones que absorbe 32. Cualquier fotón que es absorbed por rodopsina inducirá el mismo tipo de respuesta. En la práctica, esto significa que la amplitud de la respuesta en bruto de una célula aumentará ya sea debido a un aumento en la intensidad de la luz (más fotones para absorber), o a un cambio en la longitud de onda hacia su sensibilidad pico (mayor probabilidad de rodopsina de absorción de esa longitud de onda). Hacemos uso de este principio en relacionar las respuestas celulares a una intensidad conocida y la misma longitud de onda de respuestas a diferentes longitudes de onda y la misma intensidad pero la sensibilidad relativa desconocida. Los tipos de células a menudo se identifican por la longitud de onda a la que sus picos de sensibilidad. Aquí se muestra un método para el registro y análisis de sensibilidad espectral de los fotorreceptores en el ojo de una mariposa intracelular, con un enfoque en lo que este método sea más accesible para la comunidad científica en general. Aunque registro intracelular sigue siendo común en la literatura, particularmente con respecto a la visión de color en los insectos, hemos encontrado that descripciones de materiales y métodos son por lo general demasiado breve para permitir la reproducción de la técnica. Presentamos este método en el formato de vídeo con el fin de permitir su replicación más fácil. También describimos la técnica utilizando un equipo fácil de obtener y asequible. Nos dirigimos advertencias comunes que a menudo no son reportados, que ralentizan la investigación la hora de optimizar una nueva y compleja técnica.

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

registro intracelular es una técnica poderosa utilizada para determinar cómo una sola célula puede responder a un estímulo dado. En la investigación de la visión, el registro intracelular ha sido históricamente una técnica común utilizada para estudiar la sensibilidad de las células fotorreceptoras individuales a diferentes estímulos luminosos que se sigue utilizando hoy en día. Sin embargo, sigue habiendo una escasez de metodología detallada en la literatura para los investigadores que desean replicar experimentos registro intracelular en el ojo. Aquí se presentan los insectos como modelo para examinar la fisiología del ojo de manera más general. células fotorreceptoras de insectos se encuentran cerca de la superficie del ojo y por lo tanto son fáciles de alcanzar, y muchos de los mecanismos implicados en la visión se conservan a través de filos animal. Se describe el procedimiento básico para la grabación intracelular in vivo de las células fotorreceptoras en el ojo de una mariposa, con el objetivo de hacer que esta técnica sea más accesible a los investigadores con poca experiencia previa en el correolectrophysiology. Introducimos el equipo básico necesario, cómo preparar una mariposa en vivo para la grabación, la forma de insertar un microelectrodo de vidrio en una sola celda, y, finalmente, el procedimiento de grabación en sí. También se explica el análisis básico de datos de respuesta primas para la determinación de la sensibilidad espectral de distintos tipos de células. Aunque nuestro protocolo se centra en la determinación de la sensibilidad espectral, otros estímulos (por ejemplo, luz polarizada) y variaciones del método son aplicables a esta configuración.

Para muchos elementos de la configuración de la grabación, una descripción escrita no proporciona suficiente detalle. La Figura 1 es un esquema de los componentes involucrados en el sistema de grabación completa. En la Figura 2, los espectros se trazan para la luz blanca y cada filtro de interferencia para dar una idea de por qué se necesita un factor de corrección y lo que se necesita para calcular esta corrección. La figura 3 muestra fotos y un diagrama del brazo del cardan que se utiliza para estos experimentos. la Figura 4 es una imagen compuesta que muestra la etapa de grabación y micromanipulador. figura 5 muestra varios pasos en la preparación de una mariposa para el experimento. Una vez que comience la grabación, un cambio negativo en el voltaje en respuesta a un flash de luz significa que el electrodo se encuentra fuera de una célula, como en la figura 6a. La fuerza de la respuesta depende de la proximidad del electrodoinclinar a una de las células fotorreceptoras, y el ángulo de incidencia de la luz del flash. La respuesta debe ser grande (&gt; 30 mV) antes de que la punta está lo suficientemente cerca de una celda para empalar. Figura 6b muestra una respuesta clara de despolarización a un estímulo de luz, lo que significa la entrada en una de las células fotorreceptoras. El potencial de reposo debe ser estable y de la amplitud de la respuesta debe ser grande (por lo menos 40 mV), aunque la amplitud absoluta puede variar considerablemente. Medimos la respuesta relativa, lo que es más importante que la relación señal a ruido es alto. Si el reposo cambios potenciales en gran medida, la forma de onda de respuesta se ve inusual, o la respuesta máxima es demasiado baja, entonces la comparación de las respuestas relativas a través de todos los filtros de interferencia se hace imposible. Ejemplos de grabaciones no utilizables se muestran en la Figura 6c, 6d. Después de completar una grabación correcta, las respuestas ND deben registrarse y la ecuación de Naka-Rushton deben estar equipados con los datos de 33, shown en la Figura 7. Esta figura se representa mediante la serie de filtro ND sin ningún tipo de filtros de interferencia. Si la grabación es estable, los datos de la serie de filtros ND deben ser similares antes y después del experimento. La sensibilidad espectral se determina ajustando la ecuación Naka-Rushton a la trama VlogI en la Figura 7, a continuación, la solución para (I) por cada respuesta (V) a una longitud de onda dada, como se explica en los cálculos de la sección 6 del protocolo. Un ejemplo representativo de sensibilidad espectral derivada de una sola grabación se representa en la figura 8a (tenga en cuenta este ejemplo muestra datos reales calculados, pero el pico se ha desplazado ya que este resultado es inédito). Los tipos de células pueden clasificarse por la sensibilidad pico a una longitud de onda similar y forma general del espectro de sensibilidad. Tipos de células similares se promedian y la sensibilidad media se grafican con barras de error estándar en cada longitud de onda en Figure 8b. Sensibilidades espectrales de los tres tipos de células típicas que se encuentran en un insecto se muestran en la Figura 8c (barras de error de magnitud y se calculan a partir de datos reales, pero los picos se desplazan). <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig3.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 1: Esquema de grabación. Componentes Componentes de la trayectoria de la luz, la muestra de configuración, y el hardware de grabación se indican. Pista óptica se sienta en el banco de madera fuera de la jaula de Faraday. Xe, lámpara de arco de xenón, Cd, montaje condensador, Lx, lente convexa, Dakota del Norte, rueda de filtros de densidad neutra, Cf, filtro de interferencia, S, obturador, Lc, lente cóncava, Co , sonda de haz colimador, FO, cable de fibra óptica. La jaula de Faraday se sienta en elbanco de madera alrededor de la muestra. El banco de madera se encuentra por encima, pero no toca la mesa de mármol vibratoriamente aislado debajo. Grabación (Rc) y referencia (RF) se colocan electrodos en el cabezal de la platina (Hs). Rc se introduce en el ojo (E) y Rf se introduce en otra parte del cuerpo. El cabezal de la platina es parte de la configuración del preamplificador (Pa) fuera de la jaula de Faraday. La señal se transmite desde el preamplificador a través del reductor de ruido Humbug (Hb), y en el osciloscopio (Os). Desde el osciloscopio la señal se pasa a través del hardware Powerlab (PLB) y en el ordenador portátil (CPU), donde es leído por el software LabChart. El obturador es controlado por un generador de funciones (Fg) que se hace pasar a través de un segundo canal en el osciloscopio, y también se puede hacer pasar a través de un segundo canal en el hardware Powerlab si esta señal va a ser grabada también. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig5.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 2:. La interferencia de la luz blanca y filtro espectros utilizados para calcular los factores de corrección de los espectros medidos en el paso 2.5 del protocolo se muestra desde 300 a 700 nm, para la luz blanca, así como cada uno de los 41 filtros de interferencia. Cada espectro filtro de interferencia se mide con sólo eso filtro en la trayectoria de la luz. T 520 se corresponde con el área bajo el espectro para el filtro con el pico de 520 nm, y 520 s corresponde a la intensidad de la luz blanca en el pico de longitud de onda del filtro, 520 nm. Estos valores se utilizan en el cálculo de los factores de corrección para cada filtro (en este caso 520 nm) como se describe en el paso 2.6 en el protocolo. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig4.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 3:. Descripción del cardán Brazo Perímetro utilizados en los experimentos El brazo Cardan sujeta el cable de fibra óptica y permite la rotación esférica completa y ajuste angular para que la luz puede ser entregado en el ángulo adecuado de la incidencia de la celda que se está grabando. (A) vista desde arriba hacia abajo. (B) Vista desde el lado en un ángulo. Los números corresponden a la misma parte en todos los paneles. (1) La placa inferior circular permite la rotación completa en el plano horizontal. (2) La placa vertical permite la rotación completa circular del brazo en un plano vertical. (3) Este cilindro mantiene el brazo de metal con el cable de fibra óptica en el extremo, y permite que un segundo plano vertical de rotación circular perpendicular a (2). (4) se lleva a cabo el cable de fibra óptica in lugar en el extremo del brazo, y la luz se dirige hacia la ubicación de la muestra en la configuración experimental. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig1.jpg" /> Figura 4:. Los componentes de la instalación de grabación (A) Tubo de plástico se utiliza para mantener la muestra. (B) Vista de arriba de la plataforma sobre la que se montan la muestra y el tubo. (C) Vista lateral de la plataforma de bola y conjunta con base magnética (1). Electrodo de referencia mantiene inmóvil con pegamento y cera en el lado de la plataforma (2). Electrodo de referencia envuelto alrededor de pinza de cocodrilo y soldada en su lugar, proporcionando un área de fijación, donde el electrodo de referencia cabezal de la platina puede clip (3). (D) la punta del electrodo bajo 20 aumentos. Barra de escala, 25 micras. (E) Etapa, soporte del electrodo, y la configuración micromanipulador. El cabezal de la platina (1) se fija por encima del aparato con laalambre de grabación de plata (2), y el electrodo de referencia con pinza de conexión (3) unidos. El soporte de electrodo (4) está fijado a un micromanipulador manual (5) con un puesto inferior que puede ajustarse con un mando para el movimiento vertical o puede ser empujada o se tira para el movimiento horizontal del soporte de electrodo. La plataforma magnética y la muestra se encuentra en la etapa (6) justo por debajo del soporte del electrodo. (F) La jaula de Faraday rodea al proceso de grabación con una pantalla que se puede tirar hacia arriba o hacia abajo en la parte delantera. El papel de aluminio se coloca debajo de todo el equipo con almohadillas de goma en la parte superior. El cable de fibra óptica (1) lleva en la jaula de la pista óptica exterior, y está dirigida por el brazo de transmisión (2) hacia la etapa (3). El aparato etapa de grabación y el manipulador se coloca en una caja de arena (4) que descansa sobre una mesa de mármol debajo de la configuración. El resto del equipo se apoya en la parte superior del banco de madera que no toque la mesa de mármol. La caja de arena se sienta encima de la mesa de mármol en un agujerolabrado en la mesa de madera, por lo que la muestra está completamente aislado de vibratoriamente el equipo en el tablero de la mesa de madera. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53829/53829fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig2.jpg" /> Figura 5:. Mariposa Prep (A) La mariposa se ​​inserta en el tubo y la cabeza, las alas, y las antenas se inmovilizan con cera caliente. El electrodo indiferente se inserta en el aparato bucal (1), un trozo de cera seca se utiliza para sujetar el abdomen (2), y un pañuelo de papel mojado se coloca detrás de la muestra. (B) Primer plano de la cabeza hacia abajo encerado. El ojo que se registró a partir de (1) se mantiene claro a partir de la cera o residuos, y se introduce el electrodo de referencia (2) en las partes de la boca y la cera caliente se funde rápidamente sobre él para mantenerlo en su lugar.(C) Un agujero cortado en el ojo, donde la capa de células fotorreceptoras de color rosa-blanco puede ser visto. pigmento negro y amarillo hemolinfa están ausentes. (D) Vista lateral de la muestra con un electrodo de registro de vidrio (1) colocado en el ojo, y el electrodo indiferente (2) unida a la etapa de la cabeza, que debe completar un circuito como se ve en el osciloscopio. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53829/53829fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig6.jpg" style="font-size: 14px;" /> Figura 6:. Respuestas primas de grabaciones de muestra Cada respuesta corresponde a un solo destello de luz de 50 ms de duración (barras negras). (A) Un ejemplo de la gran variación de la tensión negativa que debe ser visto simplementeantes de entrar en una célula. (B) Una grabación limpia debe tener poco ruido de fondo y una gran respuesta de despolarización, normalmente de al menos 40 mV. (C) Un ejemplo de una grabación pobres debido al cambio de potencial negativo después del pico principal (puntas de flecha). (D) Otro ejemplo de una mala grabación. El potencial de reposo está experimentando fluctuaciones grandes (barra roja) y la gran cantidad de ruido de fondo puede oscurecer la amplitud de la respuesta (punta de flecha). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig7.jpg" /> Figura 7:.-Intensidad Respuesta función de log-lineal Los círculos sólidos muestran las respuestas medidas de una célula 3,5-0 OD, para este montaje experimental. La intensidad de luz es en una escala logarítmica. A muy altas intensidades se satura la respuesta, y con intensidades muy bajas una pequeña respuesta persiste en lugar de caer a cero a lo largo de la línea. Tque Naka-Rushton ecuación 33 se monta en esta forma no lineal (línea de puntos). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig8.jpg" /> Figura 8:. Ejemplos de sensibilidad espectral (A) se registraron las respuestas de una célula única representante y la sensibilidad espectral relativa se calculó. El pico de esta célula es a 440 nm, lo que significa que responde mejor a la luz azul. datos de las celdas individuales pueden parecer ruidosa (pico a 380 nm). (B) Las células con el mismo pico y la forma relativa se promedian y se añaden barras de error estándar. A continuación, se promediaron siete células azules de siete individuos que proporciona una fuerte evidencia de que existe un tipo de célula en esta especie máximamente sensibles a la luz a 440 nm. (C) Este proceso se puede repetir para todos los tipos de células que se encuentran, y se representa juntos. ojos de los insectos varían ampliamente en sus sensibilidades espectrales sino un ins típicosect puede tener picos que se muestran aquí, a 370 nm, 440 nm y 510 nm. Tenga en cuenta, estas sensibilidades espectrales están calculados a partir de datos reales, pero los picos se han desplazado debido a que la técnica no ha sido publicado para esta especie.

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Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

La técnica electrofisiológica de registro intracelular se demuestra y se utiliza para determinar las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales en el ojo compuesto de una mariposa.

Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos<em&gt; En Vivo</em&gt; registros intracelulares

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

determination-photoreceptor-cell-spectral-sensitivity-an-insect-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

11.3K vistas.  University of California, Irvine.  La técnica electrofisiológica de registro intracelular se demuestra y se utiliza para determinar las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales en el ojo compuesto de una mariposa. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

Una sola unidad En vivo Grabaciones de la quiasma óptico de la rata

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Diseño y montaje de un Microdrive ultraligero motorizado para crónicos Grabaciones neuronales en Pequeños Animales

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Un método simple y barato para la Determinación de la sensibilidad al frío y Adaptación en ratones

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em