This research was supported by a National Leading Research Laboratory Program (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) through the National Research Foundation of Korea funded by the Ministry of Science, ICT and Future Planning. The authors also acknowledge a KAIST Systems Healthcare Program.

1. Preparación de la micropatterned Moldes y hidrogeles <ol><li> Producir los patrones de micro-escala deseada utilizando SU-8 fotoprotector en la superficie de una oblea de silicio a través de una de dos pasos 15,17 técnica de fotolitografía estándar para moldes de fundición PDMS. El ejemplo que se muestra utiliza un patrón de malla hígado lóbulo como (Figura 1). </li><li> Pesar PDMS y una solución de agente de curado con una proporción de 1: 5 (es decir, 12,5 g de PDMS y 2,5 g de agente de curado). </li><li> Mezclar el 15 g de la solución a fondo, desgasificar las burbujas en una cámara de vacío, y luego se extendió la solución mezclada sobre una superficie microestructurada de la oblea de silicio uniformemente dentro de un plato de fundición de aluminio. </li><li> Coloque la oblea de silicio sobre una placa de 65 ° C durante 90 min se calienta sobre una superficie plana para curar los PDMS. </li><li> Retire los PDMS curados desde el plato de fundición y la oblea de silicio. </li><li> Cortar los bordes de los PDMS y colocarlo en una placa de Petri de 100 mm de diámetro conel lado micropatterned arriba. </li><li> Lavar los PDMS curados micropatterned en la placa de Petri utilizando etanol al 70% y agua destilada para la esterilización primaria. A continuación, secar completamente durante 10 min en un horno a 65 ° C. </li><li> Disolver y mezclar O / N 3 g de un tensioactivo no iónico en polvo en 100 ml de agua destilada, la creación de un 3% (w / v) solución de revestimiento. </li><li> Coloque los moldes de PDMS micropatterned en un limpiador de plasma y limpiarlos durante 1 min (85 W, 0,73 mbar) para crear una superficie hidrófila, para facilitar la adición de líquidos acuosos. A continuación, recubrir la superficie de los PDMS con la solución de 100 ml de tensioactivo durante al menos 3 hr (Oro / N) utilizando un eje de balancín de laboratorio. </li><li> Lavar la solución de tensioactivo de los moldes de PDMS y secarlas completamente en un horno a 65 ° C durante 10 min. Entonces, esterilizar cada molde microestructurada por la exposición a los rayos ultravioleta (UV) durante 30 min. </li></ol> 2. Preparar la suspensión de células en un hidrogel Precursor <ol><li> Apreparar precursor de hidrogel, se disuelven 0,1 g de polvo de alginato de sodio en 10 ml de tampón fosfato salino (PBS), la creación de un 1% (w / v) precursor de alginato. Para disolver el polvo completamente, incubar y mezclarlas O / N. </li><li> Se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 micras conectado a una jeringa de 1 ml. </li><li> Cultivar las células HepG2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina en una placa de cultivo tisular convencional hasta 70% - 80% de confluencia en un incubador humidificado 5% de CO2 a 37 ° C . </li><li> Lave las células una vez utilizando PBS, y luego trypsinize ellos añadiendo 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA durante 4 minutos en una incubadora de CO 2 humidificado 5% a 37 ° C. Centrifugar las células recogidas de la placa de cultivo a 250 xg durante 3 min y resuspender usando 1 ml de PBS siguientes eliminación del sobrenadante. </li><li> Contar el número de células individuales distribuidas en PBS utilizando una célula automatizadamostrador. </li><li> Después de centrifugación a 250 xg durante 3 min y la eliminación PBS, añadir 1 ml de la 1% (w / v) de solución de alginato de sodio al sedimento celular restante y mezclar suavemente usando pipeteado. La densidad de siembra final de las células debe ser de 5 × 10 6 - 10 7 células / ml. Se incuba la suspensión de células / hidrogel en un incubador humidificado 5% de CO2 a 37 ° C. </li></ol> 3. Carga y reticulación de celular / hidrogel Suspensión <ol><li> Disolver 1,47 g de cloruro de calcio deshidratar en 100 ml de ddH 2 O para producir un reactivo de reticulación (es decir, 100 mM CaCl 2 · 2H 2 O en ddH 2 O). </li><li> Enjuague el interior de un humidificador con transductor ultrasónico usando 70% de etanol, y llenarlo con 200 ml de reactivo de reticulación. El humidificador es de 110 mm de ancho, 300 mm de largo y 170 mm de profundidad (es decir, 110 mm x 300 mm x 170 mm (W x H x D)). </li><li> Coloque el PDMS micropatternedmoldes en un limpiador de plasma y limpiarlos durante 1 min a 85 W para crear una superficie hidrófila. </li><li> Constantemente cargar 7.2 l de la suspensión de células / hidrogel bien mezclada en el borde de la microestructura en el molde. El ejemplo que se muestra utiliza un patrón de malla hígado lóbulo como (Figura 1). El volumen de la suspensión depende del patrón topográfico. </li><li> Para lograr la gelificación de la suspensión de células / hidrogel, encender el humidificador y verifique que el humidificador produce una niebla del reactivo de reticulación. Pulverizar el reactivo de reticulación en el precursor de hidrogel durante 5 min, que cubre la superficie topográfica de los moldes de PDMS dentro de un rango de 5 cm. Nota: Las distancias más largas y más cortas que 5 cm podrían causar gelificación incompleta y desigual, respectivamente. Asegúrese de que el humidificador tiene una tasa de pulverización de 250 ml / hr, produciendo 20 ml de niebla del reactivo de reticulación en 5 min. </li><li> Tras el proceso de entrecruzamiento, apague el humidificador y llenar el mo PDMSlds con PBS. </li></ol> 4. Manejo de hojas sueltas modular de hidrogel <ol><li> Separe cada hoja hidrogel endurecido de los moldes micropatterned mediante pipeteo PBS suavemente alrededor de la lámina de hidrogel usando una punta de pipeta 200 l. </li><li> Recoge cada hoja hidrogel flotante utilizando un 1000 l extremo de la punta de la pipeta extremo cortado. Cada lámina de hidrogel de malla-lóbulo como el hígado tiene unas dimensiones de 8 mm x 8,7 mm, y ser 100-200 m de espesor. </li><li> Transferir una sola capa de la lámina de hidrogel en 1 ml de DMEM en una placa de 12 pocillos, y cultivar las células in vitro de una manera flotante utilizando el hidrogel construir como un componente unitario en la placa de 12 pocillos durante una semana en un 5 % de CO 2 humidificado incubadora a 37 ° C. Cambie el medio de cultivo cada dos días. </li></ol> 5. Hojas de hidrogel Asamblea de múltiples capas- <ol><li> Repita los pasos 1,1 a 1,5 para producir un marco de PDMS con unas dimensiones de 18 mm x 18 mm x 4 mm (W xH x D), y que contiene estructuras de 170 m de altura de pilar en la superficie inferior. Utilice 42 g de la mezcla de PDMS y agente de curado, con la misma relación que en el paso 1.2. Coloque un molde de policarbonato especializada en la oblea de silicio para el marco de PDMS para crear un marco interior con dimensiones de 8 mm x 9 mm x 2 mm (W x alto x profundidad). </li><li> Esterilizar el marco de PDMS y 180-m-poros papeles de filtro de nylon sumergida en agua destilada y pinzas en un autoclave durante 15 min a 121 ° C. </li><li> Coloque el marco PDMS esterilizada en un cuarto de una pieza de papel de filtro de nylon (con un diámetro de 5 cm) en una placa Petri de diámetro de 60 mm. </li><li> Transferir una lámina de hidrogel modular en el interior del bastidor de PDMS usando una punta de pipeta de 1000 l final de corte. Las láminas de hidrogel utilizados para el montaje deben ser cultivadas durante al menos un día después de que fueron fabricados. </li><li> Alinee el borde de cada hoja de hidrogel modular con el marco PDMS utilizando una punta de pipeta 200 l vacío. </li><li> Repetir los pasos 5.4 y 5.5 el uso de hojas de hidrogel modulares para formar una pila de 4 - 6 capas. </li><li> Retire el medio de cultivo por que fluye hacia fuera a través de las estructuras de pilar en la parte inferior del bastidor de PDMS. A continuación, añadir 2 l de solución de alginato (2% w / v) en una esquina de la construcción multi-capa. </li><li> Pulverizar una niebla del reactivo de reticulación durante 30 segundos en la construcción de múltiples capas para fijar los bordes de cada capa con los de otro. Utilice 2 ml de niebla del reactivo de reticulación (a una velocidad de pulverización de 250 ml / h). </li><li> Enjuague la construcción de múltiples capas suavemente con 400 l DMEM y retire el marco de PDMS con unas pinzas. </li><li> Separe la construcción de varias capas de papel de filtro frotando suavemente con una célula elevador después de la adición de 4 ml de DMEM. </li><li> Transferir el de varias capas construir una placa de 6 pocillos que contiene 3 ml de DMEM usando papel de filtro, y cultivar las células in vitro de una manera flotante, con el hidrogel como construirun andamio celular multi-escala en la placa de 6 pocillos más de una semana en un incubador humidificado 5% de CO 2 a 37 ° C. Cambie el medio de cultivo cada dos días. </li></ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+effect+of+the+hydrogel+grid+structure+on+in+vitro+formation+of+homogeneous+MIN6+cell+clusters.">Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters.</a> Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).</li><li>Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+modular+tissue+construct+in+a+microfluidic+chip.">Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).</li><li>Choi, S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+photolithography+to+fabricate+multilevel+microchannels.">Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels.</a> Biomicrofluidics. 4 (4), 046503 (2010).</li><li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+formation+and+collagen-alginate+composite+encapsulation+of+pancreatic+islet+spheroids.">In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids.</a> Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).</li><li>Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. 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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo proporciona un método sencillo de fabricar láminas de hidrogel modulares, y montaje de ellos para formar andamios celulares 3D. Para construir claras estructuras modeladas de alginato en un corto tiempo, deberíamos identificar un procedimiento de reticulación que pueden crear estructuras suficientemente rígido para mantener los complejos micropatrones del molde, así como mantener la viabilidad celular y el metabolismo. Hemos desarrollado un proceso de reticulación, incluyendo una transición sol-gel, para rociar un reactivo de reticulación usando un humidificador en forma de una niebla. Sin este proceso de reticulación, los patrones de micro-escala no podrían ser generados en la forma de un hidrogel delgada construir con la profundidad limitada de difusión (100 - 200 micras), que tiene una alta permeabilidad difusiva a metabolitos y nutrientes. Además, en comparación con los métodos existentes basados ​​en la difusión, que requieren 30 - 60 min, 18 - 20 de la TI de reticulaciónyo estaba relativamente corto (3-5 minutos). Por otra parte, también era difícil de manipular las hojas delgadas de hidrogel, que eran mecánicamente estable sólo en un medio líquido. Como se muestra en la Figura 1, la estructura fina de hidrogel fue simplemente y de forma estable manejado y manipulado utilizando una punta convencional de fin de corte para transferal entre diferentes condiciones de cultivo. El uso de técnicas de generación y manipulación, podríamos proporcionar no sólo una hoja de una sola capa de una manera flotante para aplicaciones potenciales en ensayos de fármacos, pero las estructuras de múltiples capas también apilados, con aplicaciones potenciales como andamios para construcciones similar a un tejido. Arquitecturas celulares de varias capas pueden ser generados por el apilamiento de las láminas de hidrogel de una sola capa modulares (Figura 3A). Cada lámina de hidrogel modular puede contener diferentes tipos de células, y puede ser expuesta a diferentes condiciones de cultivo. Estas construcciones multi-capa puede entonces ser ASSEM selectivamentesangrado. Sin embargo, simplemente apilar hojas de hidrogel pueden conducir a la necrosis celular dentro de la estructura montada cuando la profundidad total supera la profundidad de difusión limitada (Figura 3C). Para superar este problema, sería necesario alinear los patrones de micromalla, tales como mallas-lóbulo como el hígado, cuando se ensamblan las hojas de hidrogel multi-capa. Por lo tanto, se requiere un marco de PDMS con el mismo patrón de interiores como el borde de la lámina de hidrogel para alinear las hojas de hidrogel apilados. Por lo tanto, micropatrones agujero de matriz alineados en las hojas de hidrogel de malla reunidos se podrían utilizar para formar estructuras de tuberías expandido, lo que facilita el transporte de nutrientes más eficiente para mejorar la viabilidad de las células (Figura 3B). Una limitación de esta técnica es la ausencia de interacciones célula-matriz en el hidrogel de alginato. El alginato no puede proporcionar ligandos de adhesión celular para in vivo -como interacciones célula-matriz; 21 sin embargo, lo hace fueraer efectos mecánicas y geométricas como un andamio celular que encapsula 3D con interacciones célula-célula. Para las células primarias y las células madre, alginato podría usarse siguiente modificación con péptidos que contienen RGD-21, o en combinación con colágeno o gelatina. 14,18 Otra limitación es que, una vez que las hojas de hidrogel de células embebido se fabrican con baja densidad celular por debajo 5 x 10 6 células / ml, la construcción de estructura de múltiples capas podrían causar adjuntos débiles entre las láminas de hidrogel debido a que sólo el borde de la estructura se fija mediante el uso de alginato adicional. Sin embargo, las capas pueden apilarse de forma compacta como una sola andamio a través de estructura de drenaje bajo el marco PDMS. Además, una mayor densidad de células en las hojas de hidrogel podría proliferar en la superficie así como dentro de la capa después del cultivo de un día, lo que ayudaría a uniones entre capas como se muestra en la Figura 3A. La fabrica lámina de hidrogella técnica y la manipulación se describe aquí se puede adaptar a los sistemas de cultivo in vitro y modelos celulares similar a un tejido para proporcionar un microambiente en vivo -como para aplicaciones, incluyendo ensayos celulares y órganos artificiales de ingeniería. Esta técnica podría aplicarse a los ensayos de fármacos basados ​​en células y estudios biológicos que requieren geométricamente diferente micro celular 3D y macroenvironments que incorporan diversas células o tipos de hidrogel.

Los hidrogeles son particularmente prometedores biomateriales, y se espera que ser importante en la biología básica, ensayos farmacológicos y la medicina. 1 Biofabrication de constructos celulares a base de hidrogel se ha sugerido para reducir el uso de los experimentos con animales, 2,3 reemplazar los tejidos trasplantables, 4 y mejorar ensayos basados ​​en células. 5,6 que contiene agua-(carburos) materiales viscoelásticos (geles) permiten un gran número de células a encapsular y se mantiene en una estructura de andamio para controlar el microambiente celular 3D. En combinación con la orientación de las tecnologías de microfluidos o micropatterning, la geometría de las construcciones de hidrogel puede ser controlada con precisión a escala celular. Hasta la fecha, una variedad de formas de hidrogeles, incluyendo partículas, fibras 7 - 9, 10 - 12 y hojas, 13 - 15 años han sido utilizados como unidades de construcción en apro bottom-updolores a la fabricación de escala macro arquitecturas multi-celulares. Ambas partículas y fibras a base de hidrogel se han fabricado fácil y rápidamente para aplicaciones como entornos celulares micro-escala, con controles de fluidos utilizando dispositivos de microfluidos. Sin embargo, como las unidades básicas de la ingeniería de tejidos, sería complicado para reorganizar ellos y para ampliar su volumen como construcciones a escala macro. 16 Es más difícil de lograr construcciones macro-escala que producir módulos básicos de tamaño micrométrico. Unidades similar a una lámina de construcciones a base de hidrogel pueden ser usados ​​para aumentar el volumen de los andamios a través de un proceso de montaje simple. Consecuentemente, las capas apiladas de láminas de hidrogel proporcionan no sólo un aumento volumétrico sino también una extensión geométrica en un espacio 3D. Hemos informado anteriormente de un método de fabricación de láminas de hidrogel micropatterned, 13-15 junto con su montaje en multi-layarquitecturas celulares Ered. La técnica permite micropatterning complejo y el diseño modular de los constructos celulares a través de un proceso de apilamiento de las estructuras de varias capas. A través de la fabricación de láminas de hidrogel modulares apilados, que se micropatterned, un sistema de cultivo celular 3D con un microambiente celular escala macro controlada puede ser realizado. Este protocolo de vídeo describe un método de fabricación sencilla pero potente que puede utilizarse para construir hojas de hidrogel modulares, basado en la línea celular de carcinoma de hígado humano (HepG2). Se demuestra en el presente documento sencilla manipulación de estas hojas de hidrogel modulares modelados, y su montaje en una estructura de múltiples capas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:111px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td style="width:163px;">000000000001064291</td>
			<td style="width:397px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:288px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">P2443</td>
			<td>Powdered nonionic surfactant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Alginic acid sodium salt, low viscosity</td>
			<td style="width:111px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:163px;">B25266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ultrasonic humidifier</td>
			<td style="width:111px;">MediHeim</td>
			<td style="width:163px;">MH-2800</td>
			<td>Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 mL/h</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:288px;">Nylon net filter hydrofilic, 180 &#956;m</td>
			<td style="width:111px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:163px;">NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Polycarbonate mold</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of modular hydrogel sheets for micropatterned macro-scaled 3d cellular architecture

Los hidrogeles pueden ser modelados en la micro-escala utilizando tecnologías de microfluidos o micropatterning para proporcionar una geometría de tejido vivo -como (3D) tridimensional en. Los constructos celulares a base de hidrogel 3D resultantes se han introducido como una alternativa a los experimentos con animales para estudios biológicos avanzados, ensayos farmacológicos y las aplicaciones de trasplante de órganos. Aunque las partículas y fibras a base de hidrogel pueden ser fabricados fácilmente, es difícil manipularlos para la reconstrucción de tejidos. En este vídeo, se describe un método de fabricación de láminas de hidrogel de alginato micropatterned, junto con su montaje para formar un sistema de cultivo de células en 3D a escala macro con un microambiente celular controlada. Usando una forma de niebla del agente gelificante de calcio, hojas delgadas de hidrogel se generan fácilmente con un espesor en el rango de 100 - 200 m, y con micropatrones precisas. Las células pueden ser cultivadas a continuación, con la orientación geométrica de las hojas de hidrogel encondiciones independientes. Además, las láminas de hidrogel pueden ser manipulados fácilmente utilizando una micropipeta con una punta final de corte, y pueden ser montados en estructuras de varias capas por el apilamiento de ellos utilizando un polidimetilsiloxano modelado (PDMS) marco. Estas hojas de hidrogel modulares, que pueden ser fabricados utilizando un proceso Facile, tienen aplicaciones potenciales de los ensayos in vitro de drogas y estudios biológicos, incluyendo los estudios funcionales de micro y macroestructura y la reconstrucción de tejidos.

Hemos descrito la fabricación y manipulación de láminas de hidrogel autoportante celulares. Como se muestra en la Figura 1, se han fabricado de PDMS micropatterned moldes, y de hidrogel que contiene las células se cargó sobre la superficie hidrófila de estos mohos y reticulada usando un humidificador para generar una niebla de aerosol de agente gelificante. Tras la liberación de los moldes, las células HepG2 se cultivaron en autoportante hojas de hidrogel con varios patrones (Figura 2). Por lo tanto, las hojas delgadas de hidrogel proporcionó un ambiente de cultivo 3D. Además, las hojas de hidrogel modulares se pueden ensamblar por capas de las hojas utilizando una micropipeta con una punta final de corte, y el uso de un marco de PDMS, que permite el cultivo de células a escala macro 3D (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig1.jpg" /> Figura 1. Flujo Chart Mostrando la fabricación de una lámina de hidrogel y Hojas de hidrogel de múltiples capas. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig2.jpg" /> Figura 2. independiente 3D cultivo celular in varias láminas de hidrogel. El método de fabricación de pulverización reactivo de reticulación permitido patrón preciso de hidrogel de alginato en la escala micro. Además, las láminas de hidrogel fabricados podrían ser cosechadas del molde y manipularse fácilmente en condiciones independientes. Células HepG2 eran iguales y se cultivan en una hoja de hidrogel plana (A), hojas de hidrogel con pilares hexagonales (B), de malla (C), malla-lóbulo como el hígado (D), una serie de agujeros (E), y multipl-microcomb como microfibras e (F). Las barras de escala son los siguientes:. 500 micras (A, D, F), 100 m (B, C), y 2 mm (E) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig3.jpg" /> Figura 3. Montaje de micropatterned hojas de hidrogel para constructos celulares macro escala. Varios tipos de lámina de hidrogel podría ser montado a través de apilamiento de capas por capa con la alineación, incluyendo el montaje de cinco hojas de hidrogel que contiene las células HepG2 teñidas con fluorescencia verde y las células NIH3T3 teñidas con fluorescencia roja (A). Un conjunto de hojas de hidrogel micropatterned con estructura gasoducto ampliado (B) proporciona mayor viabilidad tha celularn la de hojas de hidrogel no estampados (C) después de 7 días. La viabilidad se evaluó por tinción de las células HepG2 con calceína-AM (células vivas que se muestran como verde) y homodímero de etidio-1 (células muertas que se muestran como rojo). Las barras de escala:. 500 m (A) y 200 m (B, C) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig3large.jpg" target="_blank">​​Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Construcción de Hojas modular de hidrogel para la arquitectura celular 3D a escala macro micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K vistas.  Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment. 

Video: Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Investigación

Bioingeniería

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up cellular mimics that better represent the complexity of cellular life. To date there are a number of paths that could be taken to build compartmentalized cellular mimics, including the exploitation of water-in-oil emulsions, microfluidic devices, and vesicles. Each of the available options has specific advantages and disadvantages. For example, water-in-oil emulsions give high encapsulation efficiency but do not mimic well the permeability barrier of living cells. The primary advantage of the methods described herein is that they are all easy and cheap to implement. Transcription-translation machinery is encapsulated inside of phospholipid vesicles through a process that exploits common instrumentation, such as a centrifugal evaporator and an extruder. Reactions are monitored by fluorescence spectroscopy. The protocols can be adapted for recombinant protein expression, the construction of cellular mimics, the exploration of the minimum requirements for cellular life, or the assembly of genetic circuitry.

Herein we describe simple methods for the preparation of vesicles, the encapsulation of transcription and translation machinery, and the monitoring of protein production. The resulting cell-free systems can be used as a starting point from which to build increasingly complex cellular mimics.

La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

Gradiente de tensión Chip para estimulantes comportamientos celulares en hidrogel cargadas de celulares

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Mejora 3D hidrogel culturas de células Glial primarias para In Vitro modelado de neuroinflamación

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

Construcción de una hoja de varias capas células madre mesenquimales con un sistema de cultivo dinámico 3D

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3D impreso celulosa poroso nanocompuesto hidrogel andamios

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...