. Este trabajo fue apoyado por una beca de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá Kim Gilbert mantiene una beca de Fonds de la recherche du Québec - Santé.

Los animales son manejados de acuerdo con la regulación del Comité de Cuidado de Animales local, de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. Las ratas se alojan individualmente bajo condiciones constantes (temperatura de 21-22 ºC y una humedad del 40-50%), incluyendo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, comenzando a las 08:00 am. Pellets de Chow y agua corriente están disponibles ad libitum durante todo el estudio. Se permite un período de aclimatación de 3 días después de la entrega por el proveedor antes del experimento. Ratas macho Sprague-Dawley con un peso de 300-800 g entre han sido utilizados rutinariamente con este protocolo. 1. MI Cirugía <ol><li> Inducir la anestesia con inyecciones intraperitoneales de ketamina 60 mg / kg y xilazina 10 mg / kg. Confirme anestesia adecuada por la ausencia de reflejos cuando se pellizcan las zarpas. </li><li> Afeitado sitio quirúrgico. Intubar rata con un tubo endotraqueal: catéter (16G 1,77 pulgadas) y colocar los animales en decúbito lateral. Coloque los animales en una almohadilla térmica para mantener la temperatura alrededor de 37 ° C. Conecte el tubo endotraqueal al isoflurano 2%. </li><li> Preparar sitio quirúrgico con gluconato de clorhexidina y alcohol isopropílico. Durante la cirugía, use guantes estériles e instrumentos esterilizados. Aplicar pomada oftálmica de ambos ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Ponga campo estéril en los animales y los instrumentos sobre otro campo estéril al lado del animal. </li><li> Incisión de la piel con hoja de bisturí # 10. Despegar el tejido muscular con una pinza hemostática. Colocar el animal en decúbito ventral. Pared torácica abierta con una pinza y la posición de retracción torácica hemostático. Pericardio abierto con una pinza hemostática. </li><li> Para producir la oclusión coronaria, un bucle de 360 ​​mm de largo sutura de seda de 4-0 alrededor de la arteria coronaria descendente, pasa a través del tejido miocárdico contigua. Inserte ambos extremos de la sutura de seda en una 14G, tubo de plástico largo 1,25 cm. </li><li> Tire de ambos extremos de la sutura de seda y push el tubo hacia abajo contra la arteria para ocluir que, por 40 min. Oclusión Secure sujetando el tubo de plástico con una pinza hemostática. </li><li> Después de 40 min, liberar la oclusión por la liberación de la pinza hemostática, seguido de la eliminación del tubo flexible de sutura y seda. Nota: el control de ratas Sham someten al mismo procedimiento quirúrgico menos la oclusión de la arteria coronaria. </li><li> Antes de cerrar la pared torácica, colocar un catéter flexible (18G, 4,5 cm) a través de la cavidad torácica para extraer el aire fuera del tórax con una jeringa de 5 ml para prevenir el neumotórax. </li><li> Cerrar cavidad torácica con 2-0 sutura, puntada del músculo con 4-0 sutura de seda y la piel con sutura de seda 3-0. </li><li> Antes de cerrar el último punto de la piel, de nuevo extraer el aire fuera del tórax con 5 ml jeringa a través del catéter colocado previamente en la cavidad del tórax. </li><li> Suturar último punto de la piel. Deje de ventilación isoflurano. </li><li> Monitorear el despertar de la rata. No deje a un animal sin vigilancia hasta que tenga regained conciencia suficiente para mantener decúbito esternal. </li><li> Tratar rata cada 8 h durante 24 h con un analgésico (buprenorfina, 0,05 mg / kg ip) y con un antibiótico (una dosis única de duplocillin, 0,2 mg / kg ip). </li><li> Después de la cirugía, las ratas de la casa de forma individual hasta la hora del sacrificio, es decir, 3 días después de la MI. </li><li> El tamaño del infarto, principalmente necrosis, se expresa como el porcentaje de tejido infartado en el área en riesgo del ventrículo izquierdo. Esto puede medido utilizando la coloración de trifeniltetrazolio 11. </li></ol> 2. amígdala Aislamiento <ol><li> Coloque la cabeza del animal por primera vez en una bolsa en forma de cono, con su nariz que sobresale de la abertura de extremo estrecho. Rata seguro para evitar cualquier movimiento. Coloque la cabeza apropiada en la guillotina, entre las hojas de las tijeras. Decapitar a los animales. </li><li> Coloque la cabeza de la rata en un plato mantuvo en hielo picado. Realizar todos los procedimientos para el aislamiento de tejido en hielo picado (4 ° C). </li><li> Sk abierta Cortarull con tijeras, separar cuidadosamente envolturas óseas con gubia ósea tirando hacia arriba y evitar la mutilación de los tejidos debajo. </li><li> Coloque la punta plana de una espátula entre la parte inferior del cráneo y la superficie ventral posterior del cerebro y separar cuidadosamente cerebro de cráneo empujando suavemente la cuchilla hacia adelante a lo largo de la parte inferior del cráneo hasta que el cerebro puede ser levantado lentamente fuera de la cráneo. Deseche el cráneo. </li><li> Coloque el cerebro en su superficie dorsal. Identificar hipotálamo (estructura en la parte delantera del cerebelo) y cortar el cerebro coronal delante de su extremo anterior y detrás de su extremo posterior; descartar las partes anterior y posterior del cerebro si no es necesario para otros usos. </li><li> Visualice las amígdalas como pequeñas esferas debajo de los lóbulos temporales, de forma bilateral, justo al lado del hipotálamo. </li><li> Da la vuelta al cerebro plana en su extremo frontal, superficie dorsal de distancia del experimentador. </li><li> Comience con el lado izquierdo o derecho del cerebro. Separar el hemiesferas y luego la corteza de la amígdala contigua. Cortar manera alrededor de 8 mm de esta corteza floja para permitir el aislamiento de la amígdala. Cortar la amígdala con el bisturí. </li><li> Aislar la parte basolateral de la amígdala de su parte centromedial cortando a lo largo de la sutura oscura que corre a través de ella, casi mitad y mitad. Esta estructura no siempre es fácil de identificar. </li><li> Ponga subpartes amígdala en viales identificados por separado y mantener en hielo picado. </li><li> Procedimiento de disección Repita con el otro hemisferio. </li><li> Sumergir viales en nitrógeno líquido durante 1 min. Mantenga vial en -80 ° C congelador hasta que se necesite. </li></ol> 3. actividad caspasa-3 <ol><li> Preparar tampón de lisis con 0,32 M de sacarosa, 1% de Triton-X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético, 2 mM de ditiotreitol, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mg / l de leupeptina , 10 g / l de pepstatina A y 10 g / l de aprotinina. </li><li>Añadir 150 ml de tampón de lisis a cada muestra (5-10 mg). Mantenga en hielo. Sonicar cada muestra en hielo durante 5 segundos a intensidad máxima (40 W). Incubar el tejido en tampón de lisis en hielo durante 30 min. Vortex cada muestra durante 5 min. </li><li> Realizar ciclos de 3 de congelación / descongelación colocando alternativamente muestras en nitrógeno líquido y en una placa de calefacción controlada por termostato a 37 ° C. Centrifugar a 13000 tejido g (4 ° C) durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante y mantener en el tubo en hielo. </li><li> Preparar las concentraciones de proteína estándar entre 0 y 10 mg / ml con albúmina de suero bovino. Preparar espacios en blanco con solamente búfer. </li><li> Añadir 200 l de reactivo de Bradford a cada norma. Leer estándar a 595 nm. Para los niveles de proteína, añadir 5 l de muestra de sobrenadante a 795 l de agua destilada y 200 l de reactivo de Bradford. Lea cada muestra a 595 nm y cuantificar la proteína con la curva estándar. </li><li> Preparar tampón de reacción con 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM de MgCl de 2 &lt;/ sub&gt;, 1 mM de ácido tetraacético etilenglicol, 0,1% de 3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato y 1 mM de ditiotreitol. </li><li> Añadir 25 g de proteína a sustratos de tampón de reacción y la caspasa-3 para obtener muestras de reactivos positivos y negativos. Para las muestras negativas, añadir tampón de reacción, 25 g de proteína, 0,4 l de Ac-DEVD-CHO 800 mM y 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Para las muestras positivas, añadir 25 g de proteína al tampón de reacción y 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Procesar todas las muestras negativas y positivas por triplicado. Completar el volumen final de cada muestra hasta 200 l mediante la adición de tampón de reacción. </li><li> Producir controles negativos mediante la adición de 188,7 l de tampón de reacción a 0,5 l de Ac-DEVD-CHO 800 M, 0,8 l Ac-DEVD-AMC 10 mM y 10 l de tampón de lisis. Para los controles positivos, añadir 189,2 l de tampón de reacción, 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM y 10 l de tampón de lisis. </li><li> Incubar las muestras ycontroles en la oscuridad durante 3 horas a 37 ° C </li><li> Detener la reacción con 600 l de glicina 0,4 M y NaOH 0,4 M (pH 10) en cada muestra y control. </li><li> Cuantificar la fluorescencia por espectrofluorometría en la excitación de longitud de onda de 365 nm de longitud de onda y la emisión de 465 nm. Añadir 2 ml de agua destilada a la reacción en cubeta de vidrio. Leer los controles y las muestras durante 10 segundos con 1 punto en cada seg. </li><li> Cuantificar la actividad específica en cada muestra: ((La fluorescencia de las muestras negativas, menos la fluorescencia de las muestras positivas) x volumen de 2,8 ml) dividido por (tiempo de incubación de 3 horas x cantidad de proteína de 25 mg). </li></ol>

<ol>
	<li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+keys+in+the+ignition+of+cell+death.">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li><li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors:+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway.">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala.">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li><li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R., Lakshmanadoss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19,+Post-Myocardial+Infarction+Depression.">Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression.</a> Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . , 333-362 (2012).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li><li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model.">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li><li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression.">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li><li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction.">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li><li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion.">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li><li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D1,+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid,+decreases+post-myocardial+infarct+depression.">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction:+effects+of+sertraline.">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, 451-459 (2009).</li><li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+re-visited:+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues.">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li><li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Killing+the+blues':+a+role+for+cellular+suicide+(apoptosis)+in+depression+and+the+antidepressant+response.">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li><li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+pathways:+paper+wraps+stone+blunts+scissors.">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestra experiencia con este protocolo en los últimos 10 años llevó a la identificación de las cuestiones metodológicas críticos. En primer lugar, la disección rápido del cerebro en un plato de Petri en hielo picado es importante para mantener la calidad de preparación. En segundo lugar, debe tenerse en cuenta que la sonicación tejido es más corto para la amígdala cerebral en comparación con otros tipos de tejidos, tales como el corazón (10 seg) o riñones (20 seg). En tercer lugar, el gran cuidado se debe tomar para mezclar cuidadosamente el sustrato antes de añadir a las muestras. Nos encontramos con señales variables cuando la secuencia de mezcla era inadecuada. En cuarto lugar, no hay burbujas deben estar presentes en la celda de cuarzo cuando se leen las muestras. De lo contrario, la señal podría ser alterado. Hicimos un cambio en los últimos años para aumentar la reproducibilidad de los resultados: el aumento de volumen de sustrato para evitar el volumen de menos de 1 l. Sin embargo, las pequeñas variaciones pueden ocurrir entre ensayos sucesivos, y al menos 3 muestras de control deben ser usado paracontrol para variaciones. Medidas de fluorescencia de estos controles se promedian y la media se fija en el 100%. Medidas de fluorescencia en las muestras experimentales se transforman en porcentaje de las muestras de control. Otra limitación de la técnica es que sólo se utiliza una porción de tejido y, por lo tanto, la caspasa-3 actividad podría ser subestimada. De hecho, la ventana de tiempo de la apoptosis es corto en cualquier célula dada y podría perderse a pesar de que se produce en las zonas vecinas en el momento de muestreo 1,4,15. Lo contrario también es posible: la apoptosis podría ser particularmente intensa en porciones de tejido, dando lugar a una sobreestimación de la caspasa-3 actividad. Se recomienda el uso de los tejidos restantes (la amígdala) para técnicas complementarias, tales como ensayos TUNEL o relación Bax / Bcl2 (véase la Introducción). Espectrofluorometría tiene al menos dos ventajas sobre la transferencia Western. En primer lugar, se genera directamente datos cuantitativos. En segundo lugar, mide enzimática unsí mismo en lugar de proteína o la expresión del ARN, que puede ser no relacionado, y se sabe que la expresión de proteínas se puede aumentar sin ningún cambio en la actividad enzimática ctividad. Por otra parte, espectrofluorometría se puede realizar en otros tejidos o con diferentes especies de animales y se puede ajustar para otros subtipos de caspasas, con diferentes sustratos, por lo que las comparaciones de seguros puede ser hecho. En conclusión, este documento demuestra el uso de espectrofluorometría para medir la caspasa-3 actividad en la amígdala, proporcionando evidencia de que la apoptosis se produce en esta región del sistema límbico 3 días después de un IM.

Las caspasas o aspartato proteasas dirigida cisteína-dependientes son una familia de enzimas que están implicadas en diversos homeostasis processess 1. Las caspasas pueden clasificarse ampliamente en función de sus roles en la apoptosis o la inflamación. Caspasa-1, -4, -5 y -12 están involucrados en la inflamación, mientras que quienes se dedican a la apoptosis puede ser sub-clasificado como caspasas iniciadoras (caspasa-8 y -9) y caspasas verdugo (caspasa-3, -6 y -7 ). Las caspasas desempeñan papeles importantes en muchas patologías, principalmente en trastornos en los que la apoptosis puede ser excesivo, como se observa después de un infarto de miocardio (MI) o isquemia cerebral. En el modelo de rata del síndrome post-MI utilizado en nuestro laboratorio, se establece que se activa la caspasa-3 no sólo en el miocardio 2, sino también en el sistema límbico que está implicada en el control del estado de ánimo y emociones 3-6. También se ve que se activa la caspasa-3 en diferentes regionesdel sistema límbico, como la amígdala y el hipocampo, y esta activación picos alrededor de 3 días después de la lesión isquémica 4. Curiosamente, la caspasa-3 actividad se correlaciona con el post-MI alteraciones de comportamiento y su atenuación mediante intervenciones farmacológicas y nutricionales reduce estas lesiones, lo que sugiere una posible relación entre la caspasa-3 y post-MI depresión 7-12. Caspasa-3 de activación se puede medir mediante diversas técnicas. Western Blot comprueba las propiedades enzimáticas de las caspasas y puede detectar enzimas activas, así como sus formas pro-enzima. Western Blot, sin embargo, es semi-cuantitativa, y pequeñas variaciones se puede perder por la debilidad de la relación señal-ruido de 13. Una mejor técnica se basa en la escisión de un sustrato (DEVD-AMC) por la caspasa-3 que libera un compuesto fluorogénico y se puede medir por espectrofluorometría. Caspasa-3 de activación es un marcador fiable de la apoptosis. Medición de la apoptosis can ser inestable debido a que la ventana de tiempo de ocurrencia es corto, y las células vecinas pueden fagocitar cuerpos apoptóticos o células 14. La apoptosis se puede confirmar más mediante otras técnicas, tales como Terminal desoxinucleotidil transferasa dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) de ensayo, que detecta la fragmentación de ADN resultante de las cascadas de señalización de apoptosis 6, o la relación de las proteínas pro / anti-apoptóticos, tales como Bax / Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Spectroflurometer</td><td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>with DeltaRAM&amp;nbsp; Random Access Monochromator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>small animal ventilation</td></tr><tr><td>Glass cuvette</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&amp;nbsp; series</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

El infarto de miocardio (IM) tiene a medio y largo plazo consecuencias dramáticas en los niveles fisiológicos y de comportamiento, pero los mecanismos involucrados aún no están claros. Nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo de rata de síndrome post-MI que muestra alteraciones funcionales cardíacas, pérdida neuronal en el sistema límbico, déficits cognitivos y conductuales signos de depresión. A nivel neuronal, la caspasa-3 de activación media post-MI apoptosis en diferentes regiones límbicas, como la amígdala - alcanzando un máximo de 3 días después de la MI. Alteraciones cognitivas y conductuales aparecen 2-3 semanas después de la MI y éstas se correlacionan estadísticamente con medidas de actividad caspasa-3. El protocolo descrito aquí se utiliza para inducir MI, recoger el tejido de la amígdala y medir actividad caspasa-3 utilizando espectrofluorometría. Para inducir la MI, la arteria coronaria descendente se ocluye durante 40 min. El protocolo para la evaluación de la caspasa-3 de activación empieza 3 días después de MI: las ratas se sacrificaron y se aisló la amígdala RAPIDLY desde el cerebro. Las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80 ° C hasta su análisis real. La técnica que se realiza para evaluar la activación de la caspasa-3 se basa en la escisión de un sustrato (DEVD-AMC) por la caspasa-3, que libera un compuesto fluorogénico que se puede medir por espectrofluorometría. La metodología es cuantitativa y reproducible pero el equipo requerido es caro y el procedimiento para la cuantificación de las muestras consume mucho tiempo. Esta técnica se puede aplicar a otros tejidos, tales como el corazón y los riñones. DEVD-AMC puede sustituirse por otros sustratos para medir la actividad de otras caspasas.

La amígdala fue aislado en 8 simulado (control) y 8 ratas MI tres días después de la inducción del protocolo de isquemia / reperfusión. Caspasa-3 se midió la actividad en este tejido usando un fluorocromo que se puede escindir por la caspasa-3 activa y se detecta por espectrofluorometría. Medidas positivas y negativas (consulte los pasos 3.11, 3.12 y 3.16) se realizaron por triplicado y se midieron durante 10 seg, con 1 punto en cada seg. Se calcularon las diferencias entre los controles positivos y negativos y el promedio de las diferencias para todo el tejido simulado realizado durante este experimento se fijó en 100%. Los resultados de las ratas MI fueron escalados de acuerdo con esta referencia y Figura 1 ilustra los resultados finales: indica una actividad significativamente mayor en ratas MI en comparación con simulado (p &lt;0,05). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Figura 1. La caspasa-3actividad en la amígdala de ratas MI, expresado como porcentaje de la actividad media de controles simulados, se establece en 100% (8 ratas por grupo). * Indica diferencia significativa entre los grupos (p &lt;0,05). Los datos se expresan como media ± SEM.

Watch this Scientific Journal Video about Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction at JoVE.com

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspasa-3 La actividad en la amígdala de rata Medido por espectrofluorometría Después de Infarto de Miocardio

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K vistas.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Video: Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Infarto agudo de miocardio en ratas

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Investigación

Medicina

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Bioquímica

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

La cuantificación histológica de miocardio infarto crónico en ratas

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial infarction (MI). However, the disadvantages of this model include high mortality rate after ligation and larger variations both in the infarct size and the degree of impaired cardiac function. In addition, a ventilator or exteriorization of the heart is indispensable for the previous models, which complicates the procedure during the ligation. In this study, we developed a reliable and reproducible model without the ventilator or exteriorization of the heart by ligating the LAD coronary artery. Four weeks after the procedure, we found that the serum concentrations of CK-MB, NT-proBNP, and Renin, which were used to assist diagnoses of MI and HF, were significantly higher in the MI group compared to the sham group. In contrast, the value of left ventricle ejection fraction (LVEF) in the MI group was obviously less than in the sham group. Furthermore, the infarct size and cardiac fibrosis area were individually confirmed and quantitatively analyzed by TTC staining and Masson's trichrome staining. Smaller variations were found in either infarct size or fibrosis area in the MI group, which helped to develop a reliable and reproducible model of HF post-MI. This new model of HF post-MI in the rat is vital for studying the potential mechanisms of MI and HF. This new method can be used to develop the new drug for treatment of MI and HF in rats by using pharmacological strategies.

We successfully developed a reliable and reproducible model of heart failure post-myocardial infarction in the rat without ventilation or exteriorization of the heart. This simplifies the procedure and benefits the further studies about the potential mechanisms behind the heart failure.

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Un modelo de roedor isquémico de pericardio intacto

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Tinción de inmunofluorescencia para estudiar la muerte celular en modelos de accidente cerebrovascular de ratas con MCAO

Evaluating Cell Death Signaling by Immunofluorescence in a Rat Model of Ischemic Stroke

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery (MCA). Current pharmacological approaches for the treatment of ischemic stroke are limited; therefore, novel therapies providing effective neuroprotection against ischemic injury following stroke are urgently needed. In the brain tissue following ischemic stroke, the area of the ischemic penumbra is salvageable but at risk of progressing to irreversible damage. The penumbral area surrounding the infarcted core is a conceptual target for neuroprotection. Since the blood flow is partially maintained in the penumbral area, neuronal and non-neuronal cells in this area transiently survive after stroke, and these cells that are still viable may be rescued by appropriate medical interventions. Understanding the pathophysiology of the penumbra is important in the development of neuroprotective therapies because the cell death pathways activated in the ischemic penumbra may indicate therapeutic targets, such as RUNX1 and cathepsins. These protein targets functioning as mediators of programmed cell death can be further exploited in translational research. With moderate size and similarity to the human brain, the in vivo rat model of MCA occlusion (MCAO) mimics the human ischemic stroke and offers an applicable tool to investigate the penumbral pathology, examine the cell death signaling, and evaluate the effects of potential targets in the context of MCAO. Here, we describe how to induce MCAO in rats and how to perform immunofluorescence staining for the detection of cell death signaling in the rat brain following MCAO.

<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de la señalización de la muerte celular por inmunofluorescencia en un modelo de rata de accidente cerebrovascular isquémico

Rat in vivo models are indispensable tools to investigate the pathological mechanisms and therapeutic targets for ischemic stroke. This work will describe performing immunofluorescence staining in infarcted brain slices following middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats.

Evaluación de la señalización de la muerte celular por inmunofluorescencia en un modelo de rata de accidente cerebrovascular isquémico

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery ...

Caspasa-3 La actividad en la amígdala de rata Medido por espectrofluorometría Después de Infarto de Miocardio

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

Infarto agudo de miocardio en ratas

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

La cuantificación histológica de miocardio infarto crónico en ratas

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Un modelo de roedor isquémico de pericardio intacto

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Evaluación de la señalización de la muerte celular por inmunofluorescencia en un modelo de rata de accidente cerebrovascular isquémico

Evaluación de la señalización de la muerte celular por inmunofluorescencia en un modelo de rata de accidente cerebrovascular isquémico