Esta investigación fue financiada por una subvención de la Fundación Bill y Melinda Gates a través de los Grandes Desafíos de la Iniciativa de Salud Mundial.

<ol>
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A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+HIV-1+DNA+using+Real-Time+Recombinase+Polymerase+Amplification.">Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).</li><li>Sollis, K. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+of+the+performance+of+HIV+viral+load+technologies+on+plasma+samples.">Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples.</a> PloS one. 9 (2), e85869 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , 1-166 (2011).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Con el fin de obtener datos significativos de cuantificación utilizando el algoritmo de MATLAB, el usuario debe seleccionar valores de entrada apropiados cuando se le solicite. Después de iniciar cada secuencia de comandos en las secciones 5 y 6, todas las variables de entrada se solicitan automáticamente en la ventana de comandos y salidas se generan automáticamente. En la sección 5.7 se pide al usuario que seleccione un umbral de pendiente. El valor del umbral de pendiente afecta al cuadrado del coeficiente de correlación (r 2) de la forma. Al utilizar datos de fluorescencia primas exportadas desde un termociclador, los valores entre 2,0 y 5,0 tienden a producir un alto coeficiente r 2. En la sección 5.8, el usuario debe indicar el número de desviaciones estándar por encima del fondo para establecer el umbral positivo. Para anotar una muestra como positiva o negativa, el script determina automáticamente la muestra diferencia Δ entre el máximo y el mínimo de fluorescencia para cada muestra utilizando los datos de fluorescencia primas exportadas de la termal ciclador. Se calcula la diferencia promedio Δ fondo y fondo estándar σ la desviación de las muestras de control de todo no-objetivo. Una muestra se considera positiva si muestra Δ es más que z × fondo σ anteriormente Δ fondo. En la Sección 5.10 que el usuario decida si desea utilizar el umbral predeterminado o establecer un nuevo umbral. Si el usuario desea establecer un nuevo umbral, determinar el nuevo umbral experimentalmente mediante la realización de 3 experimentos cada uno conteniendo 12 reacciones RPA sin ningún VIH-1 ADN presente. Establecer el umbral en el aumento promedio en la intensidad de fluorescencia a partir de estos experimentos, más 3 desviaciones estándar. Después de completar la sección 6, el guión JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m vuelve automáticamente la concentración de ADN estimado para cada reacción qRPA (en log10 copias). Si el script determina que no ADN del VIH-1 estaba presente en la muestra, la concentración estimada aparece como &quot;Necias negativas para el VIH &quot;o&quot; no válido &quot;, dependiendo de si la señal fluorescente para el control positivo interno supera el umbral (z × σ fondo + Δ fondo). Si el usuario está validando la curva estándar con concentraciones de muestra conocida, la secuencia de comandos también devolverá una tabla adicional similar a la de la Tabla 1. A fin de desarrollar un ensayo de RPA en tiempo real que proporciona la cuantificación exacta, la consistencia experimental es crucial. Por ejemplo, utilizar los mismos cebadores y sondas alícuotas tanto para la curva estándar y experimentos de validación. También evitar los ciclos de congelación-descongelación mediante el almacenamiento de las alícuotas de cebadores y sondas a 4 ° C entre los experimentos en lugar de -20 ° C. Las alícuotas de plantilla utilizados para los experimentos de curva estándar de validación y se almacenan en la misma manera. Gránulos de enzimas del EPR y reactivos del mismo lote se utilizan de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Por último, becautilizar RPA carece verdaderos «ciclos» para controlar con precisión la velocidad de amplificación, la estandarización de pasos de usuario es absolutamente imprescindible. En el montaje de las reacciones, el usuario siempre debe seguir los mismos pasos en el mismo orden, el gasto de aproximadamente la misma cantidad de tiempo en cada paso. Reacciones siempre se deben mezclar suavemente con una punta de pipeta nueva, y las burbujas siempre deben ser eliminadas. Antes de la amplificación, las reacciones deben mantenerse a una temperatura constante, y el termociclador o software microscopio siempre deben estar preparados antes de cargar las reacciones para evitar cualquier amplificación a temperaturas subóptimas que podrían influir en la cuantificación. Cualquier variación en las condiciones iniciales de la reacción puede dar lugar a la inconsistencia en los resultados experimentales. Cuando se utiliza un microscopio para recoger datos, variables adicionales deben ser controladas para minimizar la variación en la intensidad de fluorescencia. Todas las reacciones se deben colocar en la misma región en la etapa más caliente, y el microscoPE debe centrarse en la misma región del pozo para cada muestra. Incluso si se siguen estas prácticas, los datos de fluorescencia recogidos en un microscopio pueden presentar variabilidad debido a puntos brillantes locales que forman de manera natural durante las reacciones RPA, la formación de burbujas dentro de las cámaras de reacción, o fotoblanqueo resultantes de la exposición repetida a la luz de excitación. La influencia de estas variables es evidente en los datos de fluorescencia recogidos en el microscopio (Figuras 4A y 4B), que demuestran la variabilidad de referencia, picos, y depresiones. Estas características están ausentes de los datos de fluorescencia recogidos en el ciclador térmico (Figuras 3A y 3B). En última instancia, la recogida de datos en el microscopio es sólo para fines de prueba de principio y el final del ensayo se llevará a cabo en un lector de fluorescencia de campo operable con una geometría más precisa y software de control que minimiza estas variables. Otro importanteaspecto del proceso de desarrollo del ensayo qRPA es la consistencia en el procesamiento de datos. El protocolo descrito en la sección de métodos utiliza secuencias de comandos para procesar los datos de fluorescencia primas (almacenados en un archivo de hoja de cálculo) recogidos de un ciclador térmico o un microscopio. Todos los experimentos se utilizan para construir la curva estándar se deben formatear de forma idéntica. Cuando se utiliza un termociclador para recopilar datos, la misma disposición de la placa debe ser utilizado, y los datos de los pozos que no contienen reacciones RPA no debe ser exportado. Cuando se utiliza un microscopio para recopilar datos, el formato de los datos debe coincidir con el formato de los datos exportados de forma automática desde el termociclador. Por ejemplo, los datos no-control de destino deben estar en las celdas C2: C61, y los datos de aumento de las concentraciones de la plantilla debe estar en celdas D2: D61, E2: E61, etc. Si hay varias repeticiones de cada concentración en un experimento, la serie de dilución 2º replicar debe pedirse izquierda a derecha desde la ausencia de control de destino (NTC) de mayor concentración yguardado en las columnas inmediatamente a la derecha de la 1ª replicar serie de dilución. Por ejemplo, en el diseño de la placa utilizada en la Sección 1.2 con 2 repeticiones para cada muestra, los datos de fluorescencia para la primera repetición de cada muestra en la serie de dilución se deben guardar en las celdas C2: datos H61 y fluorescencia para la segunda repetición de cada muestra en la serie de dilución debe estar guardado en células I2: N61. Para el diseño de la placa utilizada en la Sección 1.2, este es el formato predeterminado al exportar datos desde el software termociclador a una hoja de cálculo. Los datos representativos proporcionados a partir de experimentos VIH-1 qRPA demostrar el apoyo de prueba de concepto de que RPA puede utilizarse para la cuantificación de la concentración de ácido nucleico en muestras desconocidas. Clínicamente útil VIH-1 pruebas de carga viral tienen un rango clínico de al menos 4 órdenes de magnitud, una precisión de 0,5 log10 copias, y un límite de detección-de-de por lo menos 200 copias 19,20. El ensayo de ADN del VIH-1 descrito cumple estos criteria y es más preciso a bajas concentraciones, como se muestra en la Tabla 1. Por lo tanto, con la inclusión de una etapa de la transcriptasa inversa, estos resultados sugieren que un ensayo de VIH-1 RT-RPA puede tener el potencial para medir el VIH-1 en la carga viral muestras clínicas. Cuando se desarrolla un ensayo de qRPA, ajustando los parámetros del algoritmo puede sintonizar el rango dinámico sensibilidad y lineal en función de las necesidades clínicas. La Figura 6 muestra que el ajuste de z (un parámetro que determina el umbral para las muestras positivas) puede influir en la sensibilidad y precisión a baja y alta concentraciones objetivo. Además, puede ser posible para aumentar la resolución y la precisión de la cuantificación mediante la incubación de las reacciones a una temperatura inferior o usando menos de acetato de magnesio, disminuyendo así la tasa de amplificación. Esta prueba de concepto qRPA ensayo se puede usar para cuantificar la concentración de las muestras que contienen el VIH-1 de ADN. El ensayo descrito en este qRPA manuscript incluye instrucciones detalladas sobre cómo montar reacciones RPA en tiempo real, desarrollar y defender un IPC, y procesar los datos de fluorescencia primas para construir una curva estándar que se puede utilizar para cuantificar muestras desconocidas. Con las instrucciones detalladas que se incluyen, este protocolo puede adaptarse para cuantificar la concentración de ADN en una amplia variedad de muestras.

Amplificación de ácidos nucleicos cuantitativa es una técnica importante para la detección del medio ambiente, transmitidas por los alimentos, y los patógenos transmitidos por el agua, así como para el diagnóstico clínico. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) es el método estándar de oro para la detección sensible, específica y cuantitativa de ácidos nucleicos, por ejemplo, para el VIH-1 pruebas de carga viral, la detección de patógenos bacterianos, y la detección de muchos otros organismos 1 - 3. Durante tiempo real qPCR, cebadores amplifican ADN del patógeno en ciclos, y una señal fluorescente que se genera es proporcional a la cantidad de ADN amplificado en la muestra en cada ciclo. Una muestra que contiene una concentración desconocida de ADN del patógeno puede ser cuantificada usando una curva patrón que relaciona la concentración de ADN inicial de muestras estándar y el tiempo en que la señal fluorescente alcanza un cierto umbral (es decir, el umbral de ciclo, o C T). <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Debido a tiempo real qPCR requiere costosos equipos de ciclo térmico y varias horas para recibir los resultados, las técnicas de amplificación isotérmica alternativos, tales como la amplificación recombinasa polimerasa (RPA), se han desarrollado 4. Estas plataformas generalmente proporcionan resultados más rápidos y amplifican los ácidos nucleicos en una, solo temperatura más baja, que se puede lograr con un equipo menos caro, más simple. RPA, que es particularmente atractivo para aplicaciones de punto de cuidado, amplifica ADN en minutos, requiere una temperatura de amplificación baja (37 ° C), y permanece activo en la presencia de impurezas 5,6. Ensayos de RPA se han desarrollado para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo el análisis de alimentos, la detección de patógenos, detección de drogas cáncer, y la detección de agentes biothreat 7-12. Sin embargo, el uso de RPA para la cuantificación de ácidos nucleicos se ha limitado 13,14. En trabajos anteriores, que era shown que en tiempo real RPA cuantitativa (qRPA) es factible 15. Aquí, se proporciona un protocolo más detallado para el uso en tiempo real RPA cuantitativa para cuantificar muestras desconocidas utilizando una curva estándar, un método que es análogo a la cuantificación mediante qPCR. Este protocolo se describe cómo realizar una reacción RPA en un termociclador para detectar el VIH-1 de ADN como prueba de concepto, así como la forma de desarrollar un control positivo interno (IPC) para asegurar que el sistema está funcionando correctamente. La recolección de datos utilizando un termociclador o microscopio y análisis de datos para la construcción de una curva estándar utilizando datos de entrenamiento también se detalla. Por último, el método para cuantificar muestras desconocidas usando la curva estándar con un script personalizado se demuestra. Esta técnica qRPA permite la cuantificación de las muestras con concentraciones desconocidas y tiene muchas ventajas sobre en tiempo real tradicional qPCR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1426">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">qRPA Assay</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Supply</td>
			<td>Vendor</td>
			<td>Part number</td>
			<td style="width:589px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HIV-1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td style="width:589px;">5&#8217;-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HIV-1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td style="width:589px;">5&#8217;-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HIV-1 probe</td>
			<td>BioSearch Technologies&#160;</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td style="width:589px;">5&#8217;- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IPC probe</td>
			<td>BioSearch Technologies&#160;</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td style="width:589px;">5&#8217;-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate</td>
			<td>TwistDx</td>
			<td>TwistAmp exo</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR tube strips</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TLS0801</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR flat cap tube strips</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TCS0803</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-seal adhesive</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>558/MJ&#160;</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFP&#916;Env&#916;Vif&#916;Vpr)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;">custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. &#38; Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118&#8211;129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human male genomic DNA</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>360486</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well cold-block</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-36700-48</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>CFX96</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiniFuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-196</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris buffer 1.0 M, pH 8.0</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>648314</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4321</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPC Development</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Supply</td>
			<td>Vendor</td>
			<td>Part number</td>
			<td style="width:589px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Cryptosporidium parvum IPC template</td>
			<td>Waterborne Inc</td>
			<td>P102C</td>
			<td style="width:589px;">It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR long forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td>5&#8217;-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR long reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom DNA oligos</td>
			<td>5&#8217;- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phusion High-Fidelty DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TAE 10X buffer</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>574797</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Supply</td>
			<td>Vendor</td>
			<td>Part number</td>
			<td style="width:589px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Imager.J1</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stage heater</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>TC-GSH</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Channel Precision High Stability Temperature Controller</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>TC-1100S</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FAM/GFP filter cube</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>filter set 38 (000000-1031-346)</td>
			<td style="width:589px;">excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEX filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49014</td>
			<td style="width:589px;">excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laser cutter</td>
			<td>Engraver&#39;s Network</td>
			<td>VLS3.60</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1/8&#34; black acrylic</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8505K113</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mm clear acrylic</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>PD-72268940&#160;</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super glue</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>Duro super glue&#160;</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR grade mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8662-5VL</td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Data Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software</td>
			<td>Vendor</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB script: &#34;JoVE_qRPA_standard_curve.m&#8221;</td>
			<td>Included in SI</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB script: &#34;JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m&#8221;</td>
			<td>Included in SI</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB script: &#34;JoVE_real_time_intensity_to_excel.m&#8221;</td>
			<td>Included in SI</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Illustrator</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JoVE_qRPA_well.ai</td>
			<td>Included in SI</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JoVE_qRPA_base.ai</td>
			<td>Included in SI</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioVision software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td>
			<td>Included in SI</td>
			<td></td>
			<td style="width:589px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a quantitative recombinase polymerase amplification assay with an internal positive control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Antes de seleccionar una secuencia para servir como el IPC en experimentos con qRPA objetivo (VIH-1) ADN, control positivo interno (IPC) candidatos se generan y se seleccionaron por su capacidad para amplificar en las reacciones qRPA sin el VIH-1 ADN presente. Candidatos IPC son más largos que el objetivo (VIH-1) DNA para prevenir la formación IPC desde fuera de la competencia del VIH-1 la formación de amplicón. Como se muestra en la Figura 2A, la generación de dos C. candidatos parvum IPC fue verificado por la presencia de 415 y 435 pb bandas utilizando electroforesis en gel. En las reacciones qRPA, el candidato IPC más corto exhibió poco de amplificación (Figura 2B), mientras que el candidato ya amplificada consistentemente cuando un total de 10 4 y 10 5 copias estaban presentes (Figura 2C). Por lo tanto, el candidato ya fue elegido para ser el IPC para los experimentos del VIH-1 qRPA. En tiempo real qRPA se puede realizar utilizando la diana de interés solo o usandotanto el objetivo y el IPC. La figura 3 muestra un experimento en el ciclador térmico utilizando tanto del VIH-1 de ADN y la C. parvum IPC. En este experimento, se añadieron 2,6 x 10 4 copias de ADN IPC a cada reacción, una concentración cerca del límite de detección de IPC, para evitar afectar el límite de detección del VIH-1 de ADN diana. Como se demuestra en la Figura 3A, que muestra datos de fluorescencia HEX correspondientes a tiempo real VIH-1 de generación de ADN, el tiempo en el que comienza la amplificación detectable es inversamente proporcional a la concentración objetivo inicial. Por lo tanto, la amplificación es evidente anteriormente para altas concentraciones de VIH-1 de ADN y más tarde para bajas concentraciones de VIH-1 de ADN. En contraste, la amplificación detectable de ADN IPC comienza en aproximadamente el mismo tiempo debido a que la concentración de partida IPC es el mismo en todas las muestras, como se muestra en la Figura 3B, que muestra datos de fluorescencia FAM correspondientes a la generación de ADN IPC durante tél mismo experimento. La tasa de generación de fluorescencia de la IPC es inversamente proporcional a la concentración del VIH-1 de ADN debido a la competencia durante la amplificación. Con el objetivo de desarrollar un lector de fluorescencia de campo operable con reacciones qRPA, experimentos qRPA pueden llevar a cabo en un microscopio de fluorescencia en posición vertical con un calentador de escenario y controlador de temperatura de 1 Canal de precisión de alta estabilidad. Figura 4A y 4B de visualización HEX y fluorescencia FAM datos recogidos en un microscopio. Los datos recogidos en el microscopio utilizando virutas de corte por láser demuestran ligera variabilidad en la fluorescencia basal y crestas y valles que pueden deberse a photobleaching. Sin embargo, el script determina el ciclo umbral utilizando la tasa de cambio de fluorescencia durante el período de amplificación inicial, que no se ve afectada por fluorescencia de línea de base o la variabilidad en la fluorescencia después de haberse producido la amplificación inicial. Como se ve en Figura 4C, la curva estándar construida a partir de este experimento tiene un coeficiente de r 2 de 0,990. Cabe destacar que el IPC se amplifica sólo para bajas concentraciones de VIH-1 de ADN. Aunque este comportamiento difiere de los experimentos realizados en el termociclador, todas las muestras se clasifican como sigue válida utilizando este método. Los datos de múltiples experimentos utilizando concentraciones diana conocidas pueden compilarse para construir una curva estándar, que puede utilizarse entonces para evaluar el rendimiento del ensayo o cuantificar las muestras con concentraciones desconocidas. Figura 5 muestra los datos de cinco experimentos y una curva estándar exponencial generados usando la secuencia de comandos &quot;JoVE_qRPA_standard_curve.m&quot;, que relaciona el VIH-1 concentración objetivo inicial a la hora a la que comenzó la amplificación detectable. Figura 5 utiliza 5 experimentos separados, cada uno conteniendo 2 reacciones qRPA a cada concentración plantilla para construir una curva estándar. Tenga en cuenta que la exponencialajuste tiene un alto coeficiente de r 2 de 0,959. A continuación, la curva estándar se utilizó para predecir las concentraciones de muestras adicionales con concentraciones conocidas para la validación de ensayo usando la secuencia de comandos &quot;JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m&quot; script. Tabla 1 muestra los resultados de la cuantificación para 5 experimentos adicionales utilizando la curva estándar en la Figura 5. Tenga en cuenta que la algoritmo clasificó correctamente todas las muestras que contienen el VIH-1 de ADN como positivos y 9 de cada 10 de las muestras de no-control de objetivo como negativas. Además, la concentración media fue predicho dentro de un orden de magnitud de la concentración correcta y la desviación estándar para las concentraciones predichas fue menos de 0,5 log10 (copias por reacción). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Diagrama de bloques de objetivos cuantitativos de ADN del EPR El QRPUn ensayo amplifica dos secuencias de ADN flanqueados por secuencias idénticas a las que se unen cebadores (&quot;RPA adelante&quot; y &quot;RPA inversa&quot;). Las secuencias amplificadas son 1) una secuencia dentro del genoma del VIH-1 (&quot;VIH-1&quot;) que se detecta con el &quot;VIH-1 de la sonda&quot;, y 2) una secuencia de control positivo interno (&quot;IPC (C. parvum)&quot;) incluyó en cada reacción que se detecta con el &quot;sonda IPC.&quot; El IPC se generó a través de PCR usando el parvum genoma Cryptosporidium como una plantilla y cebadores (&quot;PCR hacia adelante&quot; y &quot;PCR inversa&quot;) que contienen una región complementaria a C. parvum (púrpura) y una región complementaria al VIH-1 (azul). Figura originalmente publicado en Analytical Chemistry 2014, reproduce aquí con permiso 9. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig2.jpg" /> Figura 2: <strong&gt; Proyección de candidatos IPC. (A) Dos candidatos del IPC (&quot;Forward Short&quot; y &quot;Adelante Long &#39;) y una secuencia de control positivo de PCR conocido se generaron usando PCR y visualizados en un gel de agarosa, en 415 pb y 435 pb bandas eran visibles . (B) El corto candidato IPC mostró poca amplificación durante tiempo real RPA, mientras que (C) el candidato IPC ya amplificada constantemente cuando un total de 10 4 y 10 5 copias estaban presentes. Figura originalmente publicado en Analytical Chemistry 2014, reimpreso con el permiso 9. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52620/52620fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig3highres.jpg" /> Figura 3: los datos de fluorescencia prima típicos generados durante la co-amplification del VIH-1 de ADN y IPC en un termociclador. (A) para el VIH-1, el inicio de la amplificación detectable, que se muestra por una aparente aumento en la fluorescencia HEX, se produce antes de altas concentraciones de VIH-1 de ADN. (B) Para el IPC, el inicio de la amplificación detectable, que se muestra por una aparente aumento en la fluorescencia FAM, se produce en aproximadamente el mismo tiempo, independientemente de la concentración de ADN del VIH-1. Sin embargo, la tasa de generación de fluorescencia FAM es inversamente proporcional a la cantidad de VIH-1 ADN presente debido a la competencia. Figura originalmente publicado en Analytical Chemistry 2014, reproduce aquí con permiso 9. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig4highres.jpg" /> Figura 4: datos de fluorescencia en bruto típicos generados durante la co-amplificación de VIH-1 de ADN y IPC en un microscopio (A) similares a los datos generados en t.que ciclador térmico, el inicio de VIH-1 detectable de amplificación, que se muestra por una aparente aumento en la fluorescencia HEX, se produce antes de altas concentraciones de VIH-1 de ADN. (B) amplificación de IPC en el microscopio, que se muestra por fluorescencia FAM, es evidente para el VIH-1 bajas concentraciones de ADN, pero no siempre es aparente en las muestras con concentraciones de VIH-1 de ADN de alto. (C) Una curva estándar se puede construir utilizando los scripts JoVE_standard_curve.m que produce un alto coeficiente r 2. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig5highres.jpg" /> Figura 5:. Curva estándar típica para el VIH-1 Uso de la secuencia de comandos JoVE_standard_curve.m, los datos de fluorescencia HEX prima genera durante el VIH-1 de amplificación se procesa para construir una curva estándar, que puede ser utilizado para predecir el VIH-1 de la concentración de ADN desconocida muestras. Esta curva estándar (z = 1) se generó a partir de datos de 5 experimpadres, en la que 6 concentraciones fueron probados mediante 2 repeticiones a cada concentración. Todas las concentraciones se dan en log10 copias. Figura originalmente publicado en Analytical Chemistry 2014, reproduce aquí con permiso 9. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52620/52620fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Algoritmo tunability Ajuste de los parámetros del algoritmo cambia la curva estándar que se utiliza para predecir la concentración de muestras desconocidas. La secuencia de comandos JoVE_validation_and_quantification.m se utilizó para predecir la concentración de muestras desconocidas utilizando z = 1 (rojo) y z = 5 (azul). Todas las concentraciones se dan en log10 copias. Las predicciones son más precisos para las concentraciones de ADN de baja cuando z = 1; predicciones son más precisos para las concentraciones elevadas de ADN cuando z = 5. Mediante el ajuste de los parámetros del algoritmo, la curva estándar qRPA puede ser sintonizado de acuerdo con las necesidades clínicas. Figuraoriginalmente publicado en Analytical Chemistry 2014, reimpreso con el permiso 9. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Concentración de la muestra </td><td> Concentración normal prevista </td><td> Desviación Estándar </td><td> Porcentaje de muestras identificadas como positivas </td></tr><tr><td> No hay controles de destino </td><td> 0.1 </td><td> 0.3 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.9 </td><td> 0.1 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 2.2 </td><td> 0.5 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 0.1 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3.7 </td><td> 0.1 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4.2 </td><td> 0.2 </td><td> 100% </td></tr></tbody></table> Tabla 1: validación de pruebas de VIH-1 qRPA Utilizando el standa.rd curva en la Figura 4, se utilizó la secuencia de comandos JoVE_validation_and_quantification.m para predecir las concentraciones (en log10 copias) de muestras para 5 experimentos adicionales. Tabla originalmente publicado en Analytical Chemistry 2014, reproduce aquí con permiso 9.

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Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

development-quantitative-recombinase-polymerase-amplification-assay

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K vistas.  Rice University. Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Video: Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Principios de la recombinasa específica de sitio (RSS) Tecnología

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Investigación

Biología

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. 
We started with Cre, a 38-kDa recombinase, that recognizes a 34-bp double-stranded DNA sequence known as loxP. Because Cre can effectively eliminate genomic sequences, we set out to tailor a recombinase that could remove the sequence between the 5'-LTR and 3'-LTR of an integrated HIV-1 provirus. As a first step we identified sequences within the LTR sites that were similar to loxP and tested for recombination activity. Initially Cre and mutagenized Cre libraries failed to recombine the chosen loxLTR sites of the HIV-1 provirus. As the start of any directed molecular evolution process requires at least residual activity, the original asymmetric loxLTR sequences were split into subsets and tested again for recombination activity. Acting as intermediates, recombination activity was shown with the subsets. Next, recombinase libraries were enriched through reiterative evolution cycles. Subsequently, enriched libraries were shuffled and recombined. The combination of different mutations proved synergistic and recombinases were created that were able to recombine loxLTR1 and loxLTR2. This was evidence that an evolutionary strategy through intermediates can be successful. After a total of 126 evolution cycles individual recombinases were functionally and structurally analyzed. The most active recombinase -- Tre -- had 19 amino acid changes as compared to Cre. Tre recombinase was able to excise the HIV-1 provirus from the genome HIV-1 infected HeLa cells (see "HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, Germany). While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of "molecular surgery" and molecular medicine.

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of molecular surgery and molecular medicine.

Evolución molecular de la recombinasa Tre

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies primarily target virus enzymes or virus-cell fusion, suppressing the viral life cycle without eradicating the infection. Since the integrated provirus is not targeted by these approaches, new resistant strains of HIV-1 may emerge. Here, we report that the engineered recombinase Tre (see Molecular evolution of the Tre recombinase , Buchholz, F., Max Planck Institute for Cell Biology and Genetics, Dresden) efficiently excises integrated HIV-1 proviral DNA from the genome of infected cells. We produced loxLTR containing viral pseudotypes and infected HeLa cells to examine whether Tre recombinase can excise the provirus from the genome of HIV-1 infected human cells. A virus particle-releasing cell line was cloned and transfected with a plasmid expressing Tre or with a parental control vector. Recombinase activity and virus production were monitored. All assays demonstrated the efficient deletion of the provirus from infected cells without visible cytotoxic effects. These results serve as proof of principle that it is possible to evolve a recombinase to specifically target an HIV-1 LTR and that this recombinase is capable of excising the HIV-1 provirus from the genome of HIV-1-infected human cells.
Before an engineered recombinase could enter the therapeutic arena, however, significant obstacles need to be overcome. Among the most critical issues, that we face, are an efficient and safe delivery to targeted cells and the absence of side effects.

Current HIV-1 strategies act to suppress the viral life cycle but do not effectively eradicate infection. Here, we demonstrate that an engineered recombinase can efficiently excise integrated HIV-1 proviral DNA from the genome of infected cells.

Entrevista: El VIH-1 La escisión del ADN proviral uso de una recombinasa evolucionado

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Un análisis cuantitativo de la insulina que expresan la formación de colonias de progenitores

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

Un enfoque semi-cuantitativo para evaluar la formación de biopelículas Con el desarrollo de colonias arrugada

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...