Name: a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord
Uploaded: 2014-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

NOTA: El cuidado y la manipulación experimental de todos los ratones de este documento fue aprobado por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Cornell. 1. Configuración de Cirugía <ol><li> Esterilizar todos los instrumentos necesarios utilizando un autoclave o procedimientos de esterilización aprobados. Como mínimo, incluir un bisturí, tijeras, tijeras Vanna, pinzas, desarmador de joyero, hisopos de algodón, un conjunto de retractores, el implante (Figura 1A) y su sistema de entrega (Figura 1 D, E). </li><li> Limpie todas las superficies, incluyendo cualquier perillas estereoscopio, con etanol al 70% y / o desinfectantes adecuados. </li><li> Crear un campo estéril sobreponiendo el stereotax personalizado (Figura 1D) y los alrededores de sobremesa con paños estériles. Una almohadilla térmica (preferiblemente realimentación controlada) debe ser colocado en la parte superior de la stereotax y bajo los paños estériles. </li></ol> 2. Preparaciónel ratón de Cirugía <ol><li> Anestesiar un ratón debajo del 5% de isoflurano / oxígeno en una cámara de inducción hasta que la frecuencia respiratoria disminuye a aproximadamente 1 respiración / seg. </li><li> Transferencia de ratón a un área de ensayo fuera del campo estéril, usando un cono de la nariz para continuar la exposición isoflurano. Reducir isoflurano al 2%. Aplicar colirio para prevenir la sequedad de la córnea. </li><li> Administrar glicopirrolato (un fármaco anticolinérgico) a 0,05 mg / 100 g de ratón por vía intramuscular en los miembros posteriores utilizando 29-30 agujas G y 3/10 cc jeringa, la entrega de aproximadamente el 50% del volumen de inyección por extremidad. NOTA: Glycopyrrolate sirve para evitar la acumulación de líquido en los pulmones, mientras que el ratón está bajo anestesia. </li><li> El uso de máquinas de cortar eléctricos, afeitarse una porción de la cara dorsal del ratón, aproximadamente 3 cm de largo por 2 cm de ancho y centrado en el arco torácico. Limpie cualquier pelo recortado bien lejos de la zona afeitada. </li><li> Administrar las siguientes inyecciones por vía subcutánea y distal a la afeitadaparche con 29 a 30 agujas G 3/10 y jeringas CC: 1 ml / 100 g de ratón 5% de glucosa en solución salina (para la hidratación), 5 mg / kg ketoprofeno ratón (un AINE para la analgesia), 0,2 mg / kg de dexametasona ratón ( un esteroide antiinflamatorio para reducir la inflamación). </li><li> El uso de bastoncillos de algodón, realizar tres lavados alternados de yodo y etanol al 70%, 1 min de espera entre lavados. </li><li> Administrar 100 l de bupivacaína al 0,125% (un bloqueo nervioso periférico) por vía subcutánea usando 29 a 30 agujas G y 3/10 cc jeringa para el centro del parche de afeitado para reducir el dolor en el sitio de la incisión. </li><li> Transferencia de ratón para el stereotax personalizado (Figura 1D), inserte el termómetro rectal, y esperar aproximadamente 10 minutos para bupivicaína surta efecto. </li></ol> 3. Exponer y Limpie el dorsal Láminas de 3 Adyacente Vértebras torácicas <ol><li> Uso de la hoja de bisturí, crear un pequeño (5 mm o menos) de la incisión por encima de las vértebras de interés (Figura 2A). </li><li&gt; Uso de fórceps o mediante la inserción de la punta de tijeras quirúrgicas y la difusión de las asas, aumentar el tamaño de la abertura en la piel por disección roma. </li><li> El uso de un bisturí o unas tijeras quirúrgicas, disociar suavemente fascia conectivo entre la piel y el músculo subyacente. </li><li> Use retractores de contener la piel, permitiendo tan grande un área de trabajo como sea posible (Figura 2B). Tener cuidado de no aumentar la carga en el pecho y de ese modo obstruir la respiración. </li><li> El uso de un par de pinzas, agarre el rostral-más vértebra que estará expuesta a través del músculo suprayacente. Usando un bisturí, el tejido cortado a ambos lados del proceso dorsal de todo 3 vértebras (Figura 2c). </li><li> El uso de cualquier combinación de una hoja de bisturí, hisopos de algodón, y / o un raspador de hueso, eliminar todo el tejido que recubre a partir de las láminas dorsal (Figura 2D). </li><li> Con unas tijeras quirúrgicas, corte con cuidado tendones unidos a las vértebras en ambos lateral bordes de la columna vertebral (Figura 2E). </li><li> Utilizando el bisturí, eliminar suavemente mayor cantidad de tejido a partir de los bordes laterales de la columna vertebral como sea posible a fin de proporcionar una superficie de sujeción limpio. </li><li> Desbridar suavemente las vértebras de cualquier tejido blando restante usando un raspador de hueso y / o hisopo de algodón. Recorte cualquier tejido incongruente en otro lugar utilizando tijeras quirúrgicas (Figura 2F). NOTA: Es esencial tanto para sujeción y la realización de la laminectomía dorsal que las vértebras están expuestos limpiamente. A cauterizador puede ser útil en el control de la hemorragia posterior. </li><li> Shift retractores para contener el tejido que rodea la columna vertebral, además de la piel (Figura 2F). </li><li> Coloque las barras laterales de implantes a las púas en los postes de entrega y cargar estos en los post-titulares (como en la figura 1E). </li><li> Sujete el 3 vértebras usando las barras laterales, aplicando la presión suficiente para mantener securely (Figura 2G, H). El uso de fórceps para ayudar a asegurar una sujeción nivel del 3 vértebras. Tenga en cuenta que varios intentos pueden ser necesarios. Asegúrese de que las barras laterales son tanto a nivel y paralelo antes de realizar la laminectomía. </li><li> Con cuidado, limpie y seque la superficie dorsal de las vértebras sujetada mediante hisopos de algodón. </li></ol> 4. Realizar una laminectomía dorsal <ol><li> Inserte la punta de las tijeras Vannas en el espacio epidural de la vértebra sujetada medial y los apriete a la ligera; si el hueso está seca, debe grieta a lo largo de la longitud de la lámina dorsal. Repita este procedimiento en el lado contralateral para liberar la lámina. </li><li> Agarre suavemente la lámina suelta por el proceso dorsal con fórceps, cuidadosamente cortar cualquier tejido conectivo en los extremos rostral y caudal de la lámina y levante a la basura. </li><li> El uso de solución salina 0,9% y / o líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), lave la basura cualquier overlyi sangreng de la médula espinal. Use hisopos de algodón para absorber el exceso de líquido. </li><li> Con unas tijeras Vannas, recorte cuidadosamente los bordes laterales de la columna vertebral a las barras laterales del implante. Una vez más, lavar y controlar el sangrado mediante hisopos de algodón y solución salina / ACSF. </li><li> En el caso de que una parte del periostio se ha separado y se superpone a la médula espinal, eliminar suavemente este tejido usando hisopos de algodón y / o un 29 - aguja de 30 G. Tenga cuidado de no dañar la médula espinal en esta parte del procedimiento. No hay que confundir el periostio suelto con la duramadre tapados. </li><li> Con cuidado, sellar los bordes expuestos restantes del hueso con uno o ambos de acrílico y cianoacrilato dental (Figura 2I). Tenga especial cuidado de no permitir que las colas fluyan a la médula espinal expuesta. </li></ol> 5. Selle la Cámara <ol><li> Coloque la placa superior con cuidado para que las 4 ranuras se alinean con los 4 agujeros en los paneles laterales y la apertura se superpone a la vuelta expuestaal cable (Figura 1B y 2J). </li><li> Usando un destornillador de joyero, iniciar cuidadosamente el primer tornillo, estabilizando el eje del destornillador con otro par de pinzas. No apriete el tornillo en esta etapa, pero la inserta de manera que las primeras roscas están comprometidos. Repita este proceso para los otros 3 tornillos. NOTA: Es útil el uso de titanio u otros fórceps no magnetizables para ayudar a colocar los tornillos en esta etapa. </li><li> Con los 4 tornillos en su lugar, apriete cada tornillo, alternativamente, por la misma cantidad en pequeños incrementos hasta que los tornillos están bien sujetos (Figura 2C). Tenga en cuenta que no es inusual para la placa superior se flexione durante este proceso. Tenga cuidado de no apretar demasiado los tornillos, ya que la cabeza del tornillo puede romper y excesiva presión a la baja va a desalojar a la abrazadera y / o resultar en lesiones de la médula espinal. </li><li> Utilice un elastómero de silicona para llenar el espacio entre la médula espinal y la ventana de vidrio. Porque doeNO producir ácido acético durante el curado, utilice KwikSil elastómero marca y puntas de mezcla. Aplicar una porción liberal de la silicona a la médula espinal expuesta. Tenga cuidado para deshacerse de cualquier silicona que contiene burbujas de aire de la punta de mezcla antes de la aplicación a la médula espinal. </li><li> Trabajando rápidamente, presione suavemente a 5 mm # 0 cubreobjetos en la inserción en la placa superior. Aplicar suficiente presión para apretar gradualmente el elastómero líquido para rodear la médula espinal, pero no resultar en compresión de la médula espinal (Figura 2L). Ajuste de tiempo para que el elastómero es de aproximadamente 90 segundos, así que asegúrese de que el cubreobjetos se aplica rápidamente. </li><li> En el caso de un cierre fallido, espere hasta que el elastómero se ha puesto, retire con cuidado desde el implante con fórceps, y repetir 05.04 a 05.05. </li><li> Cubrir los bordes de elastómero exudado con dental acrílico / de cianoacrilato y adherirse al hueso circundante tanto como sea posible para evitar que el elastómero se desplace sobre la superficie de la médula espinal. </li><li> Retire retractores y tire de la piel alrededor del borde del implante. Uso de cianoacrilato, se adhieren a la piel a los bordes del implante (Figura 2 M, N). </li><li> Inserte # 0-80 - 1/4 &quot;set tornillos en las alas de la placa superior (Figura 1C y 2 O). </li><li> El uso de acrílico dental, sellar los huecos en las ranuras de los tornillos de la placa superior (Figura 2P). </li></ol> 6. Cuidado posoperatorio <ol><li> Retire los animales de la anestesia y el lugar en una gran jaula limpia. Asegúrese de que la jaula es suficientemente grande para que la cámara no se pega en nada (como la inmersión en forma de V para una botella de agua y / o alimentos) durante el curso de la locomoción normal a lo largo de la jaula. NOTA: Una jaula de ratas estándar es ideal. </li><li> Coloque la jaula en una superficie calentada mientras el animal se recupere. No devuelva el ratón a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. </li><li> Compruebe beha animalesVior dentro de 1 - 2 horas después de la operación para detectar signos de dolor o angustia y la integridad del implante. NOTA: En condiciones normales, el animal debe ser capaz de deambular con perturbaciones modestos a la circulación. </li><li> Continúe revisando animales cada 8-12 h durante las primeras 72 horas, la medición de peso y el monitoreo del comportamiento. Compruebe que los animales son activos y móvil durante la noche. Alimento húmedo en forma de suelo Chow mezcla con agua o geles nutricionales, pellets de perro chino, y el agua potable debe ser proporcionada a nivel del suelo. Hidratación adicional mediante inyecciones subcutáneas o intraperiotoneal debe proporcionar según sea necesario. </li><li> Administrar 5 mg / kg ketoprofeno ratón y 0,2 mg / kg por vía subcutánea dexametasona ratón a las 24 y 48 puntos de tiempo hr, después de la operación. Además, desde 0,005 hasta 0,010 mg / 100 g de ratón debe administrarse cada 8 h por inyección subcutánea durante 72 h. </li></ol> 7. En Vivo Imaging <ol><li> Anestesiar un ratón bajo5% de isoflurano / oxígeno en una cámara de inducción hasta que la frecuencia respiratoria disminuye a aproximadamente 1 respiración / seg. </li><li> Traslado del ratón a la stereotax personalizado (Figura 1D) con realimentación controlada almohadilla térmica e insertar un termómetro rectal. Reducir isoflurano al 2%. </li><li> Administrar glicopirrolato 0,05 mg / 100 g por vía intramuscular ratón en los miembros posteriores utilizando 29-30 agujas G y 3/10 cc jeringa, la entrega de aproximadamente el 50% del volumen de inyección por extremidad. </li><li> Administrar 1 ml / 100 g de ratón 5% de glucosa (para la hidratación en solución salina) por vía subcutánea una vez por hora. </li><li> Inserte los soportes de cámara roscados en los post-titulares utilizados para la cirugía (Figura 1F). Ajuste la altura y torcer los puestos en los tornillos de ajuste en la placa superior. </li><li> Con ambos titulares unidos, elevar los titulares de los puestos titulares hasta el pecho puede expandirse libremente en la inspiración. NOTA: Tanto el firme compromiso de los titulares y la libre expansión del significativos llevados pechoTLY reducir los artefactos de movimiento debido a la respiración. </li><li> Realizar las imágenes si lo deseas. </li><li> Cuando la imagen se haya completado, los puestos más bajos, retorcer, los titulares de la cámara, retire el termómetro rectal, y el lugar del ratón sobre una superficie caliente para recuperarse. No devuelva el ratón a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. </li></ol>

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K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

La técnica ha demostrado aquí permite repetida, lapso de tiempo, las imágenes en vivo del ratón dorsal SC a muchas semanas después de la operación sin necesidad de procedimientos quirúrgicos posteriores. Este procedimiento representa una mejora sustancial sobre los estudios de imagen de repetición de la cirugía o más de los enfoques histológicos portmortem, donde se pierde la información sobre la dinámica celular. Tenemos previamente 30 demostraron el valor de esta técnica para el estudio de la patología SCI en vivo. La extensión longitudinal máxima de formación de imágenes se determinó mediante el crecimiento de un tejido denso y fibroso sobre la superficie dorsal de la SC. Con el tiempo, este crecimiento resultó en la pérdida de contraste y resolución de imagen. Este crecimiento también se ha visto en las preparaciones quirúrgicas alternativas 31. Anecdóticamente, hemos observado que este crecimiento puede ser minimizado mediante el lavado cuidadosamente la superficie dorsal SC para eliminar productos de la sangre, el sellado de la superficie deel hueso cortado con cianoacrilato, sellando los bordes de la cámara de bien con elastómero de silicona, y minimizando el espacio intersticial entre el SC dorsal y el vidrio de cubierta. Recientemente, otro enfoque similar a nuestro propio uso de una cámara de policarbonato se ha demostrado 32. El uso de policarbonato es ventajoso puesto que es compatible con rayos X y las modalidades de formación de imágenes acústicas, que no es el caso para nuestras piezas de acero inoxidable. Sin embargo, con la tecnología ahora ubicua de las impresoras 3D, partes de la cámara se pueden fabricar a partir de una amplia variedad de materiales para adaptarse a necesidades específicas. Hemos impreso recientemente todas nuestras partes en un fotopolímero clara. Una desventaja clave de una cámara cerrada es la incapacidad para administrar dosis repetidas de drogas o colorantes exógenos adecuados para la formación de imágenes 34 SC. Sin embargo, mediante la capitalización de la estabilidad mecánica de nuestro sistema actual, ya hemos utilizado nuestra cámara presente para el éxitoLy anclar un catéter intratecal conectado a un puerto de inyección implantado subcutáneamente, lo que permitió la administración de fármacos en múltiples puntos de tiempo incluso en un sistema de cámara cerrada (trabajo no publicado). Además, debido a la naturaleza modular de la placa superior, las futuras versiones de esta preparación se incluir una cámara de resellable para permitir la aplicación repetida de ambos agentes terapéuticos y etiquetas fluorescentes. También es posible prever placas superiores con estuches para la grabación de electrodos, insertos ópticos y puertos para suministro de fármacos. Tales adiciones probablemente serían más difíciles de poner en práctica el uso del sistema más minimalista de Fenrich et al., 31. En conclusión, nuestro cámara proporciona una plataforma de puerta de enlace sobre el cual se pueden basar diversos experimentos.

Time-lapse en microscopía vivo en organismos intactos permite la visualización directa de los procesos biológicos complejos que son inaccesibles para el análisis tradicional punto de una sola vez, como la inmunohistoquímica. Específicamente, la microscopía de múltiples fotones (MPM) 1 permite la formación de imágenes en la dispersión de tejido, tal como el neocórtex roedor, donde se ha logrado de formación de imágenes hasta 2,3 y en exceso de 4 1 mm. Cuando se combina con las preparaciones quirúrgicas 5-7 en los que un procedimiento permite acceso óptico al cerebro durante semanas a meses, estos enfoques de microscopía se han utilizado para estudiar los procesos dinámicos en el cerebro en estados sanos y enfermos 8-11. Además, los protocolos se han desarrollado 12,13 que proporcionan para formación de imágenes in vivo en animales despiertos (es decir, no anestesiados), lo que permite la imagen funcional celular resolución durante ensayos de comportamiento. Estos protocolos se han utilizado para Comparisons de correlacionado la actividad neuronal 14, calcio astrocito señalización 15 en animales anestesiados y despiertos, la identificación de los grupos neuronales específicos de la tarea 16, y la capacidad de las neuronas para discriminar la localización de objetos a la estimulación de la barba 17. Dado el potencial de este enfoque para elucidar los mecanismos sanos y patológicos, de lapso de tiempo de imágenes in vivo se aplicó a la médula espinal de ratón (SC), lo que permite la identificación de la degeneración axonal aguda (AAD) como un mecanismo de la enfermedad 18. Estudios posteriores efectos de las lesiones periféricos en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) axón de regeneración 19, el papel de los vasos sanguíneos en la regeneración de axones 20, quimiotaxis glial en respuesta a la lesión 21, la migración de células T en la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) 22, la actividad investigados de la microglia y astrocitos 23,24 25 en respuesta a amyotrophesclerosis ic lateral (ALS), el papel de STAT-3 en crecimiento axonal después de la lesión SC (SCI) 26, y un mecanismo de pérdida de axón y recuperación de la EAE 27. A pesar del éxito de estos enfoques, todos estos estudios se limitaron a ya sea una sola sesión de imágenes, limitando así los estudios de dinámica de corto plazo, o de lo requerido repetida aberturas quirúrgicas de los animales en cada punto de tiempo de formación de imágenes, limitando el número de puntos de tiempo accesibles y el aumento de la probabilidad de artefactos experimentales de confusión. Los protocolos para estas cirugías han sido publicados anteriormente 28,29. Recientemente, publicamos una técnica 30 para la implantación de una cámara de médula crónica que permitió time-lapse de imágenes MPM en el SC ratón sobre varias semanas sin necesidad de reintervenciones. Brevemente, esta preparación quirúrgica incluyó la realización de la laminectomía en la columna torácica inferior y la implantación de una cámara de cuatro partes. La cámara incluyetres piezas a medida mecanizadas de acero inoxidable que se ligan las vértebras que rodea la laminectomía y un cubreobjetos de vidrio colocada sobre el SC y asegurado con elastómero de silicona. Esta técnica permitió la proyección de imagen de rutina a más de 5 semanas de la operación en los estados sanos y heridos sin la necesidad de reintervenciones. El número de puntos de tiempo de formación de imágenes se limita solamente por la frecuencia a la que el animal puede tolerar la inducción anestésica. Curso de la vida Imaging estaba limitado por el crecimiento de un tejido denso y fibroso sobre la superficie de la SC. Además, hemos comprobado que el implante quirúrgico no tuvo ningún efecto a largo plazo sobre la función motora. Desde nuestra publicación inicial, los enfoques alternativos que permitan también la imagen a largo plazo en el SC se han descrito en otra parte 31-33. Este protocolo demuestra nuestro procedimiento para la implantación de la cámara de la médula desarrollamos.

<table><tbody><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td></td></tr><tr><td>forceps, scissors, scalpel, etc.</td><td>Fine Science Tools</td><td>multiple&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>retractor kit -magnetic fixator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-02</td><td></td></tr><tr><td>retractor kit -retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td>other retractors may also be used</td></tr><tr><td>retractor kit -elastomer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-07</td><td></td></tr><tr><td>feedback controlled heating blanket</td><td>CWE Inc.</td><td>Model: TC-1000 Mouse&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Part No. 08-13000</td><td></td></tr><tr><td>stereotax</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber holders</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>Loctite 495</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8101</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8501</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glycopyrrolate</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Elastomer</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Mixing Tips</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIKMIX</td><td></td></tr></tbody></table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

Siguiendo el procedimiento anterior, cada etapa de la cirugía debe imitar los resultados de cada etapa de la cirugía se indica en la figura 2. Especial cuidado debe tenerse cuando se aplica el elastómero de silicona para eliminar las burbujas de aire bajo el cristal o al menos garantizar que se encuentren situado en la periferia de la zona de interés (Figura 2 l). Para un cirujano experimentado, las complicaciones quirúrgicas que requieren la eutanasia, ya sea durante la cirugía o después de la cirugía dentro de la primera 24 hr ocurren en aproximadamente el 20% de las operaciones. Estas complicaciones más frecuentemente surgen de hemorragia excesiva de tejidos blandos o el fracaso para fijar firmemente la cámara a la columna vertebral. En cámaras implantadas con éxito, la ventana permanece normalmente ópticamente transparente para varias semanas (Figura 3). A pesar de los mejores esfuerzos, una opaco, fibroso, crecimiento neoplásico a menudo se forma dentro de unos pocos días, resultando en Obscurio parcialng de la ventana (Figura 3C - F, línea discontinua negro). Estructuras fluorescentes son difíciles de ver mediante microscopía 2PEF debajo de este tejido fibroso. Nos encontramos con una distribución bimodal de los resultados, con aproximadamente el 50% de las ventanas implantados con éxito restante claro durante más de 5 semanas de la operación, y aproximadamente el 50% convirtiendo ofuscado en 1-3 semanas. Para las ventanas que quedan claras, la mayoría de los lugares dentro de la experiencia de visualización de la ventana sólo un modesto grado de neovascularización en o por encima de la duramadre (Figura 3D - F, asteriscos verde), que no obstaculice la imagen 2PEF. Nuestro estudio anterior 30 mostró un aumento en la densidad de microglia, pero no de astrocitos debajo de la ventana y las vértebras adyacentes, lo que indica inflamación leve análoga a la observada en la ventana preparaciones craneales 5. En ratones transgénicos que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) en un subconjunto de la raíz dorsal Ganglia (DRG), las neuronas (línea YFPH; Jackson Labs), los axones eran claramente distinguibles por semana después de la operación (Figura 4A y B) y hasta cuatro meses en un animal (datos no mostrados). Los vasos sanguíneos (Figura 4A y B) se hacen visibles por fluorescente retro-orbital inyección de dextrano marcado con Texas Red en el plasma sanguíneo. La microglía también se visualizaron en ratones que expresan GFP en un CX3CR1 ratón knock-in (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) cruzaron la línea YFPH (Figura 4C). Contraste y la resolución se deterioraron modestamente con el tiempo (Figura 4C) debido a la formación de un sobrecrecimiento fibroso descrito previamente 30. Rutinariamente Imaged durante 3 horas en una sola sesión y sin mortalidad y con la frecuencia que cada 12 horas. Duración de la sesión y la frecuencia está limitada por la tolerancia del animal para la inducción anestésica, concomitante con las consideraciones éticas que acompañan el dolor y la angustia de los animales de laboratorio. &lt;<html> p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> Figura 1. Una suite personalizado quirúrgica facilita la entrega de cámara durante la implantación y estabiliza la cámara durante las sesiones de formación de imágenes posteriores. Dos barras laterales y una placa superior (A) se ensamblan (B) con los tornillos pequeños en la cámara de la columna vertebral (C). Una mesa de operaciones con mensajes extensibles (D) permite la entrega y la sujeción de las barras laterales a las vértebras usando pasadores de retención (E). Sesiones de formación de imágenes posteriores en lugar de utilizar mensajes roscados internamente para adjuntar a la cámara a través de los tornillos de fijación en las alas del implante (F). El panel B de esta figura ha sido modificado desde Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 con permiso de Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> Figura 2. Una laminectomía dorsal y se realiza una cámara de imágenes crónica se implanta para proporcionar acceso óptico a la médula espinal. El procedimiento se describe en el montaje. En primer lugar, la piel (paneles A, B; secciones de protocolo 3.1 a 3.4) y los músculos (C; 3,5) se retraen para exponer las tres vértebras subyacente. Se retira el tejido que recubre estos tres vértebras (D, E, F; 03/06 a 03/10) y de los procesos laterales se raspan limpia antes de que se sujetan por ambos lados (G, H; 3,12). Con cuidado, la lámina dorsal de la vértebra central es eliminado y los bordes de la médula sellado (I </strong&gt;; 4. 6). Se aplica una placa superior (J; 5,1) y los tornillos fijado en su posición (K; 5,3) para asegurar la cámara antes de sellar la cámara con elastómero de silicona y cubierta de vidrio (L; 5,5). Después se retiran los pasadores de entrega (M; 5,8), la piel se pega a los lados de la cámara (M, N; 5,8) y los tornillos de fijación se insertan en las alas (O; 5,9). Por último, las ranuras de los tornillos están sellados con acrílico dental (P; 5.10). Y el ratón se coloca en una jaula limpia para recuperar <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> Figura 3. Una cámara espinal crónica sigue siendo ov ópticamente transparenteer varias semanas. Imágenes de luz blanca de la médula espinal, que van desde varios minutos (A) y tres semanas después de la operación (F). Hitos vasculares son identificables en todos los puntos (flechas amarillas). Pocos cambios se ve en uno después de la cirugía día (B). Sobrecrecimiento denso fibroso (C - F, delimitada por la línea discontinua en la parte inferior derecha) está presente tan pronto como tres días y los resultados en la ofuscación parcial del área de imagen. Neovascularización leve (D, E, F, asteriscos verdes) también está presente, pero no oculta la vasculatura originales con luz blanca o de imágenes 2PEF. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" /><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Figura 4. Una cámara de médula crónica permite la formación de imágenes multi-fotón repetido sin la necesidad de cirugías repetidas. de formación de imágenes repetidas de ratones transgénicos que expresan YFP en un subconjunto de los axones DRG (verde) en las funiculi dorsales de la médula espinal y la vasculatura (rojo) marcado por inyección intravascular de colorante (A, B). La actividad de la microglia (malva) también se puede seguir a través del tiempo en Thy1-YFP / CX3CR1-GFP ratones dobles transgénicos (C). Mientras que los axones y microglia permanecen visibles, contraste y resolución disminución modesta en el tiempo (C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

En este vídeo, se describe un procedimiento para la implantación de una cámara de imagen óptica crónica sobre la dorsal de la médula espinal de un ratón vivo. La cámara, procedimiento quirúrgico, y la imagen crónica son revisados ​​y demostraron.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de la médula espinal de ratón

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

14.1K vistas.  Cornell University.  En este vídeo, se describe un procedimiento para la implantación de una cámara de imagen óptica crónica sobre la dorsal de la médula espinal de un ratón vivo. La cámara, procedimiento quirúrgico, y la imagen crónica son revisados ​​y demostraron. 

Video: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Investigación

Neurociencias

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

This is a compact visual description of a combination of surgical technique and device for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. While the technique is demonstrated in the animal, the procedure is FDA-approved and currently being used for stem cell transplantation into the spinal cords of patients with ALS. While the FDA has recognized proof-of-principle data on therapeutic efficacy in highly characterized rodent models, the use of large animals is considered critical for validating the combination of a surgical procedure, a device, and the safety of a final therapy for human use. The size, anatomy, and general vulnerability of the spine and spinal cord of the swine are recognized to better model the human. Moreover, the surgical process of exposing and manipulating the spinal cord as well as closing the wound in the pig is virtually indistinguishable from the human. We believe that the healthy pig model represents a critical first step in the study of procedural safety.

Short visual description of the surgical technique and device used for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. The technique is demonstrated in the animal but is entirely translatable and currently being used for human application.

Técnica quirúrgica para la entrega de la Médula Espinal de Terapias: Demostración de Procedimiento en Göttingen minipigs

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Medicina

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimental La desmielinización y remielinización de la Médula Espinal murino por inyección Focal de lisolecitina

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Bioingeniería

In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The purpose of this method is to describe a novel mouse model of spinal implant infection (SII) that was created to provide an inexpensive, rapid, and accurate in vivo tool to test potential therapeutics and treatment strategies for spinal implant infections.
In this method, we present a model of posterior-approach spinal surgery in which a stainless-steel k-wire is transfixed into the L4 spinous process of 12-week old C57BL/6J wild-type mice and inoculated with 1 x 103 CFU of a bioluminescent strain of Staphylococcus aureus Xen36 bacteria. Mice are then longitudinally imaged for bioluminescence in vivo on post-operative days 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28, and 35. Bioluminescence imaging (BLI) signals from a standardized field of view are quantified to measure in vivo bacterial burden.
To quantify bacteria adhering to implants and peri-implant tissue, mice are euthanized and the implant and surrounding soft tissue are harvested. Bacteria are detached from the implant by sonication, cultured overnight and then colony forming units (CFUs) are counted. The results acquired from this method include longitudinal bacterial counts as measured by in vivo S. aureus bioluminescence (mean maximum flux) and CFU counts following euthanasia.
While prior animal models of instrumented spine infection have involved invasive, ex vivo tissue analysis, the mouse model of SII presented in this paper leverages noninvasive, real time in vivo optical imaging of bioluminescent bacteria to replace static tissue study. Applications of the model are broad and may include utilizing alternative bioluminescent bacterial strains, incorporating other types of genetically engineered mice to contemporaneously study host immune response, and evaluating current or investigating new diagnostic and therapeutic modalities such as antibiotics or implant coatings.

The protocol describes a novel in vivo mouse model of spinal implant infection where a stainless-steel k-wire implant is infected with bioluminescent Staphylococcus aureus Xen36. Bacterial burden is monitored longitudinally with bioluminescent imaging and confirmed with colony forming unit counts after euthanasia.

Modelo de ratón in vivo de infección por implante espinal

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The ...

Cirugía de la médula espinal e implante óptico de vástago en roedores

Implantation of Optoelectronic Devices in the Rodent Spinal Cord

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the spinal cord remains relatively unexplored. The inherently delicate and mobile spinal cord tissue imposes constraints that make the precise implantation of neural probes challenging. Despite recent advances in neuromodulation devices, particularly flexible bioelectronics, opportunities to expand their use in the spinal cord have been limited by the surgical complexities of device implantation. Here, we provide a series of surgical protocols tailored specifically for the implantation of a custom-made optoelectronic device that interfaces with the spinal cord in rodents. The steps to place and anchor an optical shank on a specific segment of the spinal cord via two different surgical implantation methods are detailed here. These methods are optimized for a diverse range of devices and applications, which may or may not require direct contact with the spinal cord for optical stimulation. To elucidate the methodology, the vertebral anatomy is referenced first to identify prominent landmarks before making a skin incision. The surgical steps to secure an optical shank over the cervical spine in rodents are demonstrated. Procedures are then outlined for securing the optoelectronic device connected to the optical shank in a subcutaneous space away from the spinal cord, minimizing unnecessary direct contact. Behavioral studies comparing animals receiving the implants to those undergoing sham surgeries indicate that the optical shanks did not adversely affect hindlimb or forelimb function seven days post-implantation. The present work broadens the neuromodulation toolkit for use in future studies aimed at investigating various spinal cord interventions.

Autor destacado: Metodología innovadora para implantar y asegurar sondas neuronales en la médula espinal de roedores

This protocol details a surgical procedure for performing spinal cord surgery and for implanting and securing an optical shank over the spinal cord in rodents.

Implantación de dispositivos optoelectrónicos en la médula espinal de los roedores

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the ...

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal

Resumen

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