This work was funded by the Whitehall Foundation and the NIH. We thank Clifford Dax (University of Oregon Technical Support Administration) for his help and expertise in designing a circuit for light delivery.

NOTA: El siguiente protocolo es de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud aprobado por la Universidad de Oregon Cuidado de Animales y el empleo Comisión. 1. Cirugía aguda <ol><li> Anestesiar al animal con un cóctel de ketamina-medetomidina, a través de inyección intraperitoneal (ip) (Tabla 1). NOTA: Los ratones utilizados en estos experimentos se generan por el cruce de una línea 10 ChR2-eYFP transgénico cre-dependiente interneurona conductor líneas (PVALB-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Entrega viral de ChR2 o opsinas relacionados debería funcionar igual de bien, en el supuesto se obtienen los niveles de expresión similares. </li><li> Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de que las exhibiciones de animales sin respuesta a una pizca dedo del pie suave. Re-administrar anestésicos durante todo el experimento como sea necesario para mantener esta profundidad de la anestesia. Si el uso de anestésicos inyectables, opcionalmente implantar un catéter para las inyecciones ip de mantenimiento. </li><li> Mantenga el animal hidratado con solución salina o solución de lactato de Ringer durante todo el experimento (aproximadamente 3 ml / kg / hr), por ejemplo mediante el uso de un cóctel anestésico diluido apropiadamente para las inyecciones de mantenimiento (Tabla 1). </li><li> Colocar el animal en un aparato de retención de la cabeza estereotáxico o de otro tipo. Asegúrese de que el cráneo está bien respaldado. Esto es esencial para el mantenimiento de registros de células individuales estables. </li><li> Aplicar ungüento opthalamic a los ojos para evitar la sequedad. Mantener la temperatura corporal a 36,5 a 37 ° C. </li><li> Realizar un desagüe de la cisterna para la estabilidad de grabación adicional. Uso de una hoja de bisturí, extirpar tejido de la cara posterior del cráneo para exponer la cisterna magna. Haga una pequeña incisión en la duramadre para drenar el líquido cefalorraquídeo. Utilice sólo la punta de la hoja, y evitar el contacto con el cerebelo o el tronco encefálico. </li><li> Utilizando el bisturí, lleve a cabo una pequeña craneotomía (~ 2 mm 2) sobre la zona cortical de interés (por auditivacorteza, aproximadamente -2.3 mm por detrás del bregma, 4,5 mm lateral de la línea media). </li><li> Retire la duramadre y cubrir la corteza expuesta con una capa de agarosa caliente 0,5-1 mm de espesor (1,5% de agarosa en solución salina, 0,9% de NaCl, aplicar a ~ 37 ° C). Mantenga la humedad de agarosa durante todo el experimento mediante la aplicación periódicamente varias gotas de solución salina. </li></ol> 2. Grabación de Set-up <ol><li> Prepare un electrodo de tungsteno (7-14 MΩ, 127 m de diámetro, 12 ° punta cónica, recubierta con epoxi). Superglue el electrodo a un tubo capilar de vidrio y agregar tubería de encogimiento de calor para un mejor agarre (Figura 1). </li><li> Montar el electrodo en un micromanipulador motorizado (o hidráulico), ajuste a viajar ortogonal a la superficie cortical. Deslice una planta de alambre debajo de la piel, contra el cráneo. Evitar el contacto con los músculos en el lado de la cabeza y la parte posterior del cuello, ya que pueden generar artefactos electromiográficos. </li><li> Amplificar la señal eléctrica de usar un amplificador extracelularli fi cador adecuado para la grabación de una sola unidad, preferiblemente equipado con un modo de comprobación de la impedancia. Supervisar la actividad de clavar en curso (banda de paso 300 - 5000 Hz) con dos osciloscopios y un conjunto de altavoces con alimentación. Aquí, los datos grabados se digitaliza continuamente a una velocidad de muestreo de 10 kHz; picos se extraen fuera de línea. </li><li> Avanzar en el electrodo a través de la agarosa hasta que la punta alcanza la superficie de la corteza. Observe este paso a través de un microscopio. &quot;Cero&quot; esta posición en el micromanipulador. </li><li> Para aproximar mejor la profundidad de la grabación, confirme visualmente que la punta del electrodo sale de la superficie cortical a una profundidad de cero al retirar el electrodo al final de una penetración. NOTA: Una discrepancia entre la lectura manipulador y la posición del electrodo observada indica que se ha desplazado con relación al tejido. Esto puede ser causado por la inestabilidad del cerebro o animal, o la deriva manipulador. <ol><li> Como una comprobación adicional para asegurar queeste conjunto de punto cero corresponde a la superficie de la corteza, controlar los potenciales de campo de estímulo-evocó mientras se avanza a través de los primeros varios cientos de micrómetros de tejido. Cuando el seguimiento de los potenciales de campo, baje el filtro de paso de banda de corte inferior del amplificador extracelular a 10 Hz. Compruebe que la polaridad del potencial de campo local invierte alrededor de una profundidad de ~ 100 m, cerca de la capa de frontera I / II 13. Este es un punto de referencia fiable para la corteza auditiva, pero puede diferir de otras áreas corticales. </li></ol></li><li> Montar una fibra óptica acoplada a una fuente de luz azul (Figura 2) sobre un micromanipulador manual. Usando el microscopio, coloque la punta de la fibra tan cerca de la superficie de la agarosa como sea posible. Centre el haz en el que el electrodo entra en el tejido. </li><li> Regular la salida de la fuente de luz con una unidad de control capaz de suministrar un TTL (lógica transistor-transistor) de tren de pulsos de anchura y duratio especificadon- por ejemplo, un Arduino (Figura 3), una tarjeta de computadora I / O (como se muestra), o un generador de impulsos disponibles comercialmente. <ol><li> Monitorear la señal en ambos osciloscopios. </li></ol></li><li> Medir la potencia total de la luz (mW) en la punta de la fibra óptica usando un medidor de potencia. Utilice este valor para calcular la irradiancia (mW / mm 2) dividiendo por el área de sección transversal del núcleo de fibra. Comenzar con un valor de intensidad en el intervalo de 10 - 15 mW / mm 2 y ajustar a la baja si es necesario, hasta que se eliminan los artefactos. </li><li> Compruebe si hay artefactos de luz con el electrodo en la agarosa, a punto de entrar en el tejido. Iniciar la búsqueda de tren de pulsos (por ejemplo, 30 pulsos de luz ms, 500 ms intervalo inter (ISI)). <ol><li> Eliminar artefactos de luz transitorios (Figura 4) por reposicionamiento de la fibra óptica con respecto al electrodo para cambiar el ángulo de la luz incidente. Si artefactos persisten, pruebe a reducir el poder de la luz. En ªe caso raro que los artefactos no pueden ser eliminados por completo (sólo minimizado), extender la duración del pulso de búsqueda. Esto puede ayudar en la identificación de verdaderos picos neuronales. </li></ol></li></ol> 3. Recta PINP-in &#39; <ol><li> Avance el electrodo lentamente a través del cerebro a una velocidad de aproximadamente 1 m / seg. Utilice un osciloscopio para monitorear la actividad en curso. Por el otro, desencadenar los pulsos de láser. </li><li> Escuchar para el &#39;de hash&#39; débiles de picos de luz evocado en el monitor de audio, que indica que el electrodo se aproxima a una célula ChR2 + y, a menudo puede ser percibido mucho antes de que la señal eléctrica es aparente en el osciloscopio. Disminuya la velocidad de avance. NOTA: Si la celda se encuentra directamente en la trayectoria del electrodo, la actividad de la luz-evocó crecerá más grande (y más fuerte). A medida que el electrodo se acerca un solo interneurona, el hash resolverá en pequeños pero bien definidos picos de tamaño uniforme y forma. </li><li> Tan pronto como lipicos GHT-evocado son lo suficientemente grandes como para desencadenar de forma individual en el osciloscopio, comienzan hacerlo. Ajuste la escala en el eje horizontal para observar la forma exacta de la forma de onda de pico. </li><li> Parar y esperar a que el tejido se asiente. Resista la tentación de mover el electrodo más cerca de la celda. Este paso es crítico para una grabación estable. Si después de varios minutos, la relación señal-ruido no ha mejorado - es decir, el tejido se ha asentado, pero no ha llevado a la celda más cerca de la punta del electrodo - avance 5 m más allá y esperar de nuevo. <ol><li> Repita este proceso hasta que el pico o el comedero del potencial de acción se pueden capturar de forma fiable con un umbral de tensión fijado muy por encima del ruido de fondo (por ejemplo, +/- 300 mV o más). NOTA: Hay poco riesgo de falsos positivos o ambigüedad cuando PINPing interneuronas inhibitorias. La mayoría de las células se pueden seguir fácilmente un tren de pulsos con una duración de 30 ms e inter-Pulintervalo de 500 ms sí, o más rápido, con un fiable primera latencia pico de 5.2 ms (Figura 5). La mayoría de las células PV +, en particular, puede sostener la cocción durante 1 seg completo (Figura 6). Porque éstas son las neuronas inhibitorias, disynaptic activación (indirecta) no es una preocupación importante. </li></ol></li><li> Durante la grabación, supervisar la actividad en curso en el primer osciloscopio. Mantenga una estrecha vigilancia sobre el tamaño y la forma de los picos utilizando el segundo osciloscopio. Tenga en cuenta la calidad de su sonido en el altavoz. <ol><li> Escuchar con atención los cambios bruscos, que indican que la célula está bien llegando demasiado cerca del electrodo (donde el riesgo de ser empalado o dañado), o se deriva. Si los picos se hacen grandes y distorsionada, retroceder; si crecen más pequeño, avanzar el electrodo. Mueva lentamente en 2 micras pasos. </li><li> Confirme la calidad de la grabación post-hoc mediante la superposición de todas las formas de onda de pico, alineados a pico o valle. Varíe los Thres tensióncelebrar. A través de una amplia gama de valores de umbral, sólo debe haber siempre una forma consistente pico de altura uniforme (Figura 5a). </li></ol></li><li> Si en algún momento la señal se contamina con los puntos de una neurona vecina, seguir adelante. Avanza lentamente, en la remota posibilidad de que el electrodo pasará fuera del rango de la celda vecina, pero permanecerá en el rango de la neurona diana. (Esto es por lo general sin éxito.) </li><li> Mueva el electrodo a través de toda la profundidad de la corteza (900+ micras) en cada penetración. Si no se encuentran las neuronas-luz de respuesta después de muchas penetraciones o, por el contrario, las grabaciones están contaminados de forma rutinaria con picos de células ChR2- vecinos, trate de un nuevo electrodo. NOTA: Incluso dentro de un solo lote, la geometría de la impedancia y la punta de electrodos individuales puede variar considerablemente. Ambos factores contribuyen a la efectiva &quot;radio de escucha&quot; del electrodo, que debe ser lo suficientemente grande para detectar picos de luz evocados while búsqueda, pero lo suficientemente restringido para permitir la grabación de una sola interneuron en el aislamiento. </li><li> Prueba de la impedancia de los electrodos si lo deseas. Para evitar dañar el tejido, hacer esto con la punta del electrodo en la parte superior de la capa de agarosa, así fuera del cerebro. Dentro de la gama de 7-14 MΩ, la impedancia exacta no es un predictor seguro de rendimiento, o el rendimiento, para esta aplicación. Dicho esto, es una aproximación razonable para el radio escucha: electrodos de baja impedancia recoger más unidades; de mayor impedancia, menos. </li><li> Al final del experimento, la eutanasia al animal por medio aprobado institucionalmente, tales como sobredosis de anestesia, o dislocación cervical bajo un plano de profundidad de la anestesia. </li></ol>

<ol>
	<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Moore, A. 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J., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+circuit+for+spatial+summation+in+visual+cortex.">A neural circuit for spatial summation in visual cortex.</a> Nature. 490, 226-231 (2012).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3, 159 (2005).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li><li>Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth-dependent+temporal+response+properties+in+core+auditory+cortex.">Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex.</a> J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).</li><li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons:+chandelier+versus+basket+cells.">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8, 70553 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Aunque PINP es conceptualmente sencillo, puede ser difícil en la práctica. Un importante factor determinante del éxito es la elección de electrodo. El radio de escucha eléctrica es el parámetro crítico. Debe ser lo suficientemente grande para detectar picos de luz evocado cuando la punta está todavía a cierta distancia de una célula ChR2 +, de modo que se puede ajustar la velocidad de avance en consecuencia. Al mismo tiempo, debe ser lo suficientemente restringido para permitir un buen aislamiento de una sola unidad. Es decir, el electrodo no debe también recoger espigas de vecinos unidades ChR2-. Encontrar el justo equilibrio en términos de radio escucha será un reto para cualquier tipo de célula específica, pero es especialmente cierto para las interneuronas inhibitorias, que son escasos, pequeños, y con frecuencia se encuentra en las proximidades de las células piramidales, las cuales que tienen comparativamente grande extracelular picos. Incluso el uso de las estrategias sugeridas aquí, el rendimiento esperado no es alto. Nuestro rendimiento típico fue 0-2 neuronas PV + / animal, dada nuestra criteria de un excelente aislamiento de una sola unidad y grabaciones que duró más de media hora. Cuando PINPing neuronas inhibidoras, disynaptic de activación (indirecta) no es una preocupación importante, porque las neuronas inhibidoras son relativamente poco probable para activar indirectamente las células postsinápticas. Para PINPing neuronas excitadoras, la activación disynaptic es común; muchas neuronas que se activan en respuesta a la luz no expresan ChR2, sino más bien reciben poderosa excitación sináptica de los que lo hacen. Estrategias para directamente- discriminante de las neuronas activadas indirectamente, se analizan en detalle en Lima et al. 1. Consideraciones de electrodos Nos sistemáticamente explorado una variedad de electrodos y las técnicas de grabación: pipetas de parche de vidrio con puntas de diferentes tamaños, que varían en microelectrodos de tungsteno impedancia y geometría de la punta, y matrices de múltiples canales (por ejemplo, tetrodos). Angular, de microelectrodos de tungsteno de alta de impedancia(Como se sugiere aquí) dio, por lejos, el mejor rendimiento. Una discusión de los problemas encontrados con cada una de estas técnicas sigue. El uso de matrices tetrodo de baja impedancia y sondas de varios canales, que hemos detectado rutinariamente picos de luz evocados; sin embargo, rara vez eran lo suficientemente grande como para ordenar de forma fiable. En otras palabras, la relación señal a ruido (SNR) era insatisfactoria. Hemos de vez en cuando recibimos excelentes grabaciones con tetrodos, pero el rendimiento fue superior asintótica con microelectrodos individuales de tungsteno, y la calidad de las grabaciones fue mucho mejor. Consejos Tetrodo son comparativamente contundente, así, que limita el número total de posibles penetraciones por animal. Los problemas que encontramos con sondas de varios canales probablemente fueron exacerbados por el uso de iluminación de superficie amplia. A diferencia específica, la estimulación de baja potencia de una fibra implantado, iluminación de superficie hará que la cocción sincrónica en ChR2 + neuronas más allá del sitio de la grabación, lo que lleva a formas de onda pico superpuestasque son más difíciles de clasificar. Electrodos de parche de vidrio, como los utilizados para las grabaciones estándar de células-adjunto sueltos, fueron también no muy adecuados para la tarea, pero por diferentes razones. Baja resistencia (&lt;5 MΩ) electrodos de parche están fuertemente sesgadas hacia las células piramidales, lo que hace difícil orientar las interneuronas inhibidoras. Si bien esto se puede corregir en cierta medida mediante el uso de una mayor resistencia (menor punta) electrodos, el mayor problema con los electrodos de parche es su radio escucha extremadamente restringido. Aunque las grabaciones de células de los parches en la máquina proporcionan una muy alta SNR, las células responde a la luz no pueden ser detectados fuera del modo celular adjunto. La estrategia con electrodos de parche es, inevitablemente, a obtener de forma aleatoria y secuencial grabaciones celulares inscritos, muy pocos de los cuales se expresan ChR2 interneuronas inhibitorias. Con electrodos de tungsteno de alta impedancia se puedetanto detectar picos de luz evocado desde la distancia, y lograr un buen aislamiento de una sola unidad. La geometría de la punta es probablemente el factor más importante. Tratamos electrodos de tungsteno a partir de dos fabricantes, con impedancias que van desde 2 hasta 14 MΩ, y los ángulos de punta 5-12 °. Se encontró que 12 ° ángulos de punta fueron superiores, pero que la impedancia precisa era menos importante, dentro de la gama de 7 - 14 MΩ. Hemos encontrado que los electrodos revestidos de vidrio eran más susceptibles a los artefactos de luz en comparación con electrodos recubiertos con epoxi, por lo que se recomienda este último. No intentamos hacer nuestros propios electrodos de tungsteno personalizado. Como con cualquier tipo de electrodo, modos comunes de fracaso son a perder el aislamiento o herir a una neurona. Diferentes parámetros de punta no parecen tener mucha influencia en esto. Más bien, a la espera de que el tejido de resolver es el factor más importante en el mantenimiento de las grabaciones de alta calidad. Entrega Luz Debido a que la luz se utiliza sólo unasa medio de identificación de células ChR2-positivos - en lugar de la regulación de su salida de una manera específica - la gama de intensidades utilizables para este experimento es muy amplia. Un límite inferior se establece por el hecho de que la intensidad debe ser suficiente para activar las células ChR2-positivos a la profundidad máxima de las células de interés. Hemos encontrado que irradiancias punta&gt; 5 mW / mm 2 (medida a 470 nm) fueron suficientes para provocar respuestas robustas de PV + células en la capa profunda 6. Irradiación a profundidades específicas dentro del cerebro se puede estimar usando una calculadora basada en mediciones directas en mamíferos tejido cerebral (por ejemplo, <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> ), pero se recomienda encarecidamente la determinación del mínimo para sus propios experimentos empíricamente, usando un microelectrodo de baja impedancia (1 - 3 MΩ, para la actividad de varias unidades). Un límite superior se establece por el hecho de que la alta intendades pueden causar artefactos de luz, que puede complicar la detección de picos evocados. En los animales transgénicos, altas intensidades también pueden causar artefactos electromiográficos mediante la activación de ChR2 en PV expuesta + muscular en el cuello y la cabeza. En la construcción de nuestro propio sistema de suministro de luz, se encontró que un acoplamiento de un LED a una fibra óptica es en última instancia más conveniente que la colocación del LED directamente sobre el cerebro. Esta última es una forma muy efectiva para entregar la luz, pero tiene algunas desventajas prácticas. La corriente que fluye a través del dispositivo produce artefactos eléctricos que deben ser blindados, y el LED genera calor considerable que debe ser disipada con un gran disipador de calor. Por otra parte, los artefactos de luz (tanto fotovoltaicos y electromiográficos) son mucho más difíciles de controlar con el amplio patrón de iluminación de LEDs. Acoplamiento de fibra resuelve todos estos problemas.

Characterizing the myriad cell types that comprise the mammalian brain has been a central, but long-elusive goal of neurophysiology. For instance, the properties and function of different inhibitory cell types in the cerebral cortex are topics of great interest but are still relatively unknown. This is in part because conventional blind in vivo recording techniques are limited in their ability to distinguish between different cell types. Extracellular spike width can be used to separate putative parvalbumin-positive inhibitory neurons from excitatory pyramidal cells, but this method is subject to both type I and type II errors2,3. Alternatively, recorded neurons can be filled, recovered, and stained to later confirm their morphological and molecular identity, but this is a pain-staking and time-consuming process. Recently, genetically identified populations of inhibitory interneurons have become accessible by means of calcium imaging or visually guided patch recordings. In these approaches, viral or transgenic expression of a calcium reporter (such as GCaMP) or fluorescent protein (such as GFP) allows identification and characterization of cell types defined by promoter expression. These approaches use 2-photon microscopy, which requires expensive equipment, and are also limited to superficial cortical layers due to the light scattering properties of brain tissue. 
Recently, Lima and colleagues1 developed a novel application of optogenetics to target electrophysiological recordings to genetically identified neuronal types in vivo, termed &#8220;PINP&#8221; &#8211; or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. Unlike many other optogenetic applications, the goal is not to manipulate circuit function but simply to identify neurons belonging to a genetically-defined class, which can then be characterized during normal brain function. The technique can be implemented with standard extracellular recording equipment and can therefore serve as an accessible and inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. Here we describe an approach to PINPing specific cell types in the anesthetized auditory cortex, with the expectation that the more general points can be usefully applied in other preparations and brain regions.
In cortex, PINP holds particular promise for investigating the in vivo response properties of inhibitory interneurons. GABAergic interneurons comprise a small, heterogeneous subset of cortical neurons4. Different subtypes, marked by the expression of particular molecular markers, have recently been shown to perform different computational roles in cortical circuits5-9. As genetic tools improve it may eventually be possible to distinguish morphologically- and physiologically-separable types that fall within these broad classes. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. This strategy was developed specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but we have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons. Although PINPing is conceptually straightforward, it can be surprisingly unyielding in practice. We learned a number of tips and tricks through trial-and-error that may be useful to others attempting the method.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1482">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:341px;">Product/Stock Number</td>
			<td style="width:708px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ChR2-EYFP Line</td>
			<td style="width:171px;">Jackson Colonies</td>
			<td style="width:341px;">12569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pvalb-iCre (PV) Line</td>
			<td style="width:171px;">Jackson Colonies</td>
			<td style="width:341px;">8069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sst-iCre (SOM) Line</td>
			<td style="width:171px;">Jackson Colonies</td>
			<td style="width:341px;">13044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cr-iCre (CR) Line</td>
			<td style="width:171px;">Jackson Colonies</td>
			<td>10774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Agarose</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:341px;">A9793</td>
			<td>Type III-A, High EEO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Micro Point (dural hook)</td>
			<td style="width:171px;">FST</td>
			<td style="width:341px;">10066-15</td>
			<td style="width:708px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:171px;">FST</td>
			<td>14084-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Scalpel</td>
			<td style="width:171px;">FST</td>
			<td>10003-12 (handle), 10011-00 (blades)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Puralube Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:171px;">Foster &#38; Smith</td>
			<td style="width:341px;">9N-76855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Homeothermic Blanket</td>
			<td style="width:171px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:341px;"><a name="RANGE!C11">507220F</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tungsten Microelectrodes</td>
			<td style="width:171px;">A-M Systems</td>
			<td>577200</td>
			<td>12 M&#937; AC resistance, 127 &#956;m diameter, 12&#176; tapered tip, epoxy-coated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Capillary Glass Tubing</td>
			<td style="width:171px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:341px;">G150TF-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Heat Shrink Tubing</td>
			<td style="width:171px;">DigiKey</td>
			<td>A332B-4-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Zapit Accelerator</td>
			<td style="width:171px;">DVA</td>
			<td style="width:341px;">SKU ZA/ZAA</td>
			<td>Use with standard Super Glue.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Microelectrode AC Amplifier 1800</td>
			<td style="width:171px;">AM Systems</td>
			<td style="width:341px;">700000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">MP-285 Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:171px;">Sutter</td>
			<td style="width:341px;">MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">4-channel Digital Oscilloscopes</td>
			<td style="width:171px;">Tektronix</td>
			<td style="width:341px;">TDS2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Powered Speakers</td>
			<td style="width:171px;">Harman</td>
			<td>Model JBL&#160;Duet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">Manual Manipulator</td>
			<td style="width:171px;">Scientifica</td>
			<td style="width:341px;">LBM-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">800 &#181;m Fiber Optic Patch Cable</td>
			<td style="width:171px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:341px;">FC/PC BFL37-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Power Meter</td>
			<td style="width:171px;">ThorLabs</td>
			<td>PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:263px;">475 nm Cree XLamp XP-E</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND</td>
			<td>LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Arduino UNO</td>
			<td style="width:171px;">DigiKey</td>
			<td>1050-1024-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to in vivo single-unit recording from optogenetically identified cortical inhibitory interneurons

Un reto importante en la neurofisiología ha sido caracterizar las propiedades de respuesta y función de los numerosos tipos de células inhibitorio en la corteza cerebral. Estamos aquí compartimos nuestra estrategia para obtener, bien aisladas grabaciones de una sola unidad estables de interneuronas inhibitorias identificados en la corteza del ratón anestesiado utilizando un método desarrollado por Lima y sus colegas 1. Las grabaciones se realizaron en ratones que expresan canalrodopsina-2 (ChR2) en subpoblaciones neuronales específicas. Los miembros de la población se identifican por su respuesta a un breve destello de luz azul. Esta técnica - denominada &quot;PINP&quot;, o identificación asistida Fotoestimulación de poblaciones neuronales - se pueden implementar con equipos estándar de grabación extracelular. Puede servir como una alternativa económica y accesible para imágenes de calcio o parches visualmente guiada, con el fin de apuntar a registros extracelulares a las células genéticamente identificados. HERE proporcionamos un conjunto de directrices para la optimización del método en la práctica cotidiana. Nosotros refinamos nuestra estrategia específicamente para atacar a las células parvalbúmina-positivo (VP +), pero hemos encontrado que funciona para otros tipos de interneuronas, así, como (CR +) interneuronas calretinin expresan somatostatina-expresión (SOM +) y.

Estamos aquí compartimos nuestra estrategia para la obtención de grabaciones de una sola unidad de interneuronas inhibitorias genéticamente clasificados en la corteza del ratón anestesiado, utilizando un método de optogenética desarrollado por Lima et al. Tabla 1 detalla el cóctel anestésico sugerido, ketamina-medetomidina-Acepromazina (1. &quot; KMA &quot;). La Figura 1 representa un microelectrodo de tungsteno, preparado para la grabación. La Figura 2 contiene un diagrama de circuito de una unidad de control LED simple. La Figura 3 contiene la configuración y el código para conmutar la salida de luz con un microcontrolador Arduino. La Figura 4 muestra un ejemplo de los artefactos eléctricos inducidos por la luz discuten en el Protocolo. Los artefactos se encuentran de vez en cuando (panel izquierdo), pero fácilmente corregidos (panel derecho). La figura 5 muestra ejemplos de las grabaciones a partir de tres tipos de interneuronas ópticamente identificados (PV +, CR + y + SOM). El pa la izquierdanel muestra rastros de tensión prima y formas de onda alineadas, representante de la clase de relación señal a ruido se puede esperar obtener con esta estrategia. Picos son capturados de forma fiable con un umbral de tensión fijo de varios cientos de microvoltios. Una parcela de trama (panel derecho) muestra la latencia corta y la fiabilidad de respuestas de la luz evocada, que permiten la identificación inequívoca de interneuronas ChR2-positivos. La Figura 6 muestra el voltaje de huellas de tres PV + interneuronas, en respuesta a un pulso de luz 1 seg. La mayoría de las células fotovoltaicas + puede mantener de alta frecuencia para disparar cientos de milisegundos, lo que son especialmente fáciles de identificar. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51757/51757fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Preparación de un electrodo. &#160; (A) Diagrama de un electrodo preparado. El electrodo es Affifijado a un tubo capilar de vidrio utilizando dos pequeñas gotas de pegamento y una cantidad mínima de acelerador (tales como Zap-It). Tubería de encogimiento de calor se añade para mayor agarre, con muy pocas calorías. Los electrodos envían normalmente con un pin conector armada previamente. (B) Fotografía de un microelectrodo de tungsteno preparada montado en un soporte del electrodo. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51757/51757fig2highres.jpg" width="600" /> La Figura 2. Esquema de conexiones para una unidad de control LED. Un circuito sencillo y de bajo costo para la entrega de la luz. Un LED super brillante (475 nm) se une a un disipador de calor y acoplado al otro extremo de un cable de fibra óptica (800 m de diámetro). La salida del LED está cerrada con un pulso TTL. La unidad de control incorpora una fuente de alimentación de modo de tensión por la intensidad de luz ajustable. 2K POT: potenciómetro para controlar la intensidad de la luz. P / S: supl alimentación de CC<html> mente (por ejemplo, cargador portátil). TIP 122: Darlington transistor. 4N35: aislador óptico. Las piezas que se indican aquí cuestan &lt;$ 10. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51757/51757fig3highres.jpg" width="600" /> La Figura 3. Código y la configuración Arduino. Un tren de pulsos TTL para conmutar la salida de luz se pueden generar utilizando un microcontrolador Arduino. El programa especifica una duración de pulso y el ISI para un tren de pulsos de bucle. Las instrucciones para cargar el programa en la placa se pueden encontrar en la página &quot;Getting Started&quot; de Arduino ( <a href="http://arduino.cc/en/Guide/HomePage" target="_blank">http://arduino.cc/en/Guide/HomePage</a> ). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51757/51757fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> igura 4 &quot;fo: contenido-width =&quot; &quot;src =&quot; 6 pulgadas / archivos / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; . Figura 4. artefacto Luz electrodos de metal son susceptibles a artefactos de luz, presente en el inicio y el desplazamiento de los impulsos (panel de la izquierda, la señal filtrada, 300 - 5000 Hz). Por lo general, se pueden eliminar por completo (panel de la derecha) mediante el reposicionamiento de la fibra óptica con respecto al electrodo para cambiar el ángulo de la luz incidente, y / o disminuyendo la potencia de la luz. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51757/51757fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5. Ejemplo células. (A) ejemplo grabaciones típicas de interneuronas ópticamente identificados, PV + (púrpura), CR + (verde), SOM + (rojo). Las células responden a la búsqueda de tren de pulsos (duración del pulso de 30 ms, 500 ms ISI) con una ráfaga fiable de los picos. El panel de la derecha muestra 100 picos cilindro-alineados y. la forma de onda promedio interpolado (10x sobremuestreo de una velocidad de muestreo de 10 kHz) (B) parcelas de mapa de bits para los mismos archivos muestran la latencia corta (~ 2 - 5 mseg). y el tiempo coherente de picos de luz evocado (C) y Mean desviación estándar de las latencias de primer pico (5-10 pulsos) para una muestra de 44 PV + interneuronas (media promedio y desviación estándar: 3,4 +/- 2,6 ms). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51757/51757fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51757/51757fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6. Ejemplos de respuestas sostenidas Uno puede ser especialmente confianza en la identificación de PV + interneuronas ya que la mayoría de ellos puede sostener de alta frecuencia de disparo para cientos de milisegundos -. Reminiscencia de sus respuestas a actualinyección in vitro 14. Tres células ChR2 / PV que responden a los impulsos de luz 1 seg: dos que disparan regularmente a lo largo de toda la duración del pulso, y un ejemplo inusual de una célula que no lo hace (&lt;10% de las células encontradas). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> KMA (20,0 ml) </td></tr><tr><td> 2 ml de 100 mg / ml de ketamina (10 mg / ml, una vez diluida) </td></tr><tr><td> 0,4 ml de 1 mg / ml DEXDOMITOR (medetomidina; 0,02 mg / ml, una vez diluida) </td></tr><tr><td> 0,05 ml de 100 mg / ml acepromazina (0,25 mg / ml, una vez diluida) </td></tr><tr><td> 17,55 ml de solución salina al 0,9% </td></tr><tr><td> Dosificación, ratón adulto (15-40 g) </td></tr><tr><td> Knock-down: 0,012 ml / g * de masa corporal (ketamina = 120 mg / kg) </td></tr><tr><td> Mantenimiento: 0,0025 ml / g * de masa corporal (= ketamina 25 mg / kg) </td></tr></tbody&gt; </table> Tabla 1. La ketamina-medetomidina-Acepromazina (&quot;KMA&quot;). Knock-down y dosis de mantenimiento de un ratón adulto, diluido para mantener la hidratación. El cóctel se vuelve a administrar cada 40 a 90 minutos, según sea necesario.

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A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Una guía para<em&gt; En vivo</em&gt; Single-unidad de grabación de Optogenetically Identificado cortical inhibitorio interneuronas

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

a-guide-to-vivo-single-unit-recording-from-optogenetically-identified

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

19.0K vistas.  University of Oregon. Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. 

Video: A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

Una sola unidad En vivo Grabaciones de la quiasma óptico de la rata

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Investigación

Neurociencias

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Grabación de las respuestas de comportamiento a la reflexión en el cangrejo de río

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

La implantación quirúrgica de electrodos neuronales crónicas para registrar la actividad y señales de una sola unidad electrocorticográfica

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracelular de grabación, Sensorial Asignación de campos, y el cultivo de neuronas identificadas en el Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Un procedimiento para la implantación de matrices Organizados de Microhilos para grabaciones de una sola unidad en Awake, Comportarse Animales

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.