El proyecto que se describe fue apoyado por el premio número R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) del Instituto Nacional de Salud Mental. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud Mental o el Instituto Nacional de Salud.

El siguiente protocolo describe el procedimiento estándar para aislar el ARN de CSF y de perfil microRNAs utilizando placas PCR listos. Tenga en cuenta que la extracción en fase orgánica es opcional, y que un ARN transportador se añade a la muestra durante la extracción asegurar la recuperación máxima de ARN. En consecuencia, no hay necesidad de cuantificar el ARN. En general, un promedio de 6-8 placas se puede ejecutar en un día si el ADNc se sintetiza el día antes (aproximadamente 2 horas). Análisis de los datos se realiza cuando todas las muestras se han perfilado y se cargan en el software. Dependiendo del número de muestras / grupos o su combinación para la comparación, el análisis de datos puede requerir de una a varias horas. 1. La extracción de RNA La extracción de ARN se realizó a partir de muestras de LCR, se almacenaron congeladas a -80 ° C en alícuotas hasta su análisis. Para este procedimiento se utilizó el kit de aislamiento mirVana París, siguiendo instrumento del fabricantecciones para el aislamiento de ARN total. Tenga en cuenta que, a pesar de enriquecimiento para las pequeñas especies de ARN es posible con este equipo, este paso no se hace y el procedimiento de extracción de ARN se terminó después de la etapa de aislamiento total de ARN. Además, aunque el kit de aislamiento de mirVana París (al igual que otros kits de aislamiento de ARN disponible comercialmente) no requiere la extracción de orgánicos, un protocolo para este procedimiento se puede encontrar a continuación. El protocolo para la extracción de ARN consta de dos pasos: 1.1. Extracción Orgánica (no es necesario si se utiliza el kit de extracción de RNA mirVana Paris) 1.2.2. Aislamiento de ARN total 1.1. Extracción orgánica 1.1.1. Preparar reactivos <ol><li> Añadir 375 l de 2-mercaptoetanol a 2x solución desnaturalizante, y almacenarlo a 4 ° C. </li></ol> 1.1.2. Prepare el CSF <ol><li> Descongele cada alícuota de CSF en hielo antes de la extracción de RNA. Añadir 1 g de ARN portador MS2 a 0,5 ml de LCR descongelado y suavementemezclar. Tenga en cuenta que si la extracción orgánica se omite, se añadirá el portador MS2 a la muestra de aislamiento de ARN antes descrito en 1.2.2.1 a continuación. </li><li> Mezclar 0,5 ml de 2x solución desnaturalizante a temperatura ambiente a la LCR. </li><li> Añadir 1 ml de ácido-fenol: cloroformo a la CSF más la solución desnaturalizante 2x: asegúrese de retirado la fase inferior que contiene ácido-fenol: cloroformo, no el tampón acuoso que se encuentra en la parte superior de la mezcla. Además, tenga en cuenta que el ácido fenol: cloroformo contiene fenol, que es un veneno y un irritante, use guantes y otros equipos de protección personal cuando se trabaja con este reactivo. </li><li> Vortex durante 30-60 segundos para mezclar. Por conveniencia, los 2 ml de muestra / solución desnaturalizante / ácido-fenol: cloroformo mezcla se dividen en dos tubos Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar durante 5 min a velocidad máxima (10.000 x g) a temperatura ambiente. </li><li> Retire con cuidado la fase acuosa (superior) sin perturbar la fase inferior o la interfase y transferirlo a untubo fresco. Tenga en cuenta el volumen recuperado. </li></ol> 1.2. Aislamiento de ARN Se recomienda contar con un banco dedicado, juego de pipetas y bastidores para el manejo de muestras de ARN. La zona de trabajo y herramientas se descontaminan utilizando aerosol RNasa Zap y toallitas antes de cada experimento. 1.2.1. Preparar reactivos: <ol><li> Añadir 21 ml de etanol al 100% a los genes miARN Solución de lavado 1 y 40 ml de etanol 100% a la solución de lavado 2/3. Tenga en cuenta que miRNA Wash Solution 1 contiene tiocianato de guanidina que es una sustancia potencialmente peligrosa. </li></ol> 1.2.2. Aislamiento de ARN total <ol><li> Añadir 1,25 volúmenes de temperatura ambiente 100% de etanol a la fase acuosa de la extracción orgánica y mezclar bien. </li><li> Coloque un cartucho de filtro en uno de los tubos de recogida. </li><li> Pipeta no más de 700 l de la mezcla de lisado / etanol en el cartucho del filtro. </li><li> Centrifugar durante 30 segundos a máximavelocidad. Aplique la mezcla superior a 700 l en aplicaciones sucesivas con el mismo filtro. Deseche el flujo continuo después de cada centrifugación y guardar el tubo de recogida para los pasos de lavado. </li><li> Aplicar 700 l miRNA Wash Solution 1 para el cartucho del filtro y centrifugar durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. </li><li> Aplicar 500 l Solución de lavado 2/3 y se centrifuga durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. Aplique una segunda 500 l Solución de lavado 2/3 y se centrifuga durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. Girar el conjunto durante 1 min a velocidad máxima para eliminar el líquido residual desde el filtro. </li><li> Transferir el cartucho de filtro en un tubo de recogida fresco. Aplicar 100 y mu; L de precalentado (a 95 ° C) de nucleasa libre de agua para el centro del filtro, y cerrar la tapa. Centrifugar durante 30 segundos a la velocidad máxima para recuperar el ARN. </li><li> Recoger el eluido que contiene ARN y almacenarlo a -80 ° C para aplicaciones posteriores. </li><li> Cuantificar 1 l de ARN utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000c. Tenga en cuenta que la cuantificación del ARN se puede omitir si un portador de ARN se añade a la muestra durante la extracción de RNA. En ese caso 8 l de ARN se sometió a síntesis de ADNc como se detalla a continuación. </li></ol> 2. miRNA Perfil: Protocolo QRT-PCR El protocolo para miARN perfiles consta de dos pasos: <ol><li> Síntesis de ADNc de primera cadena </li><li> La amplificación por PCR en tiempo real </li></ol> 2.1. Síntesis de ADNc de primera cadena 2.1.1. Diluir ARN molde <ol><li> Ajustar cada una de las muestras de ARN plantilla a una concentración de 5 ng / l utilizando nucleasa libre de agua. Si elARN no ha sido cuantificada (véase el paso 1.2.2.9), a continuación, 8 l de ARN se utilizan para la síntesis de ADNc </li></ol> 2.1.2. Preparar reactivos <ol><li> Descongelar suavemente el tampón de reacción 5x y nucleasa libre de agua, y colocar inmediatamente en hielo. </li><li> Mezclar por agitación. Resuspender la espiga-en añadiendo 40 l de nucleasa libre de agua al tubo y mezclar mediante agitación ARN; dejarlo en hielo durante 15 a 20 min. Inmediatamente antes de su uso, retire la mezcla de enzimas del congelador, se mezcla con un movimiento rápido de los tubos y colocar en hielo. Centrifugar todos los reactivos. </li></ol> 2.1.3. Configuración reacción de transcripción inversa <ol><li> Preparar la cantidad requerida de solución de trabajo de RT en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, o equivalente (en las proporciones indicadas en la Tabla 1, a excepción de la plantilla de ARN), mezclar mediante agitación (1-2 segundos a velocidad máxima), girar brevemente abajo ( utilizamos un mini centrífuga Eppendorf con velocidad fija, 10 seg) y colocarlo en hielo. Tenga en cuenta que la espiga ARN UniSp6-En se añade a la muestra antes de la reacción de RT (ver Tabla 1). </li><li> Vierta la solución de trabajo RT en tubos para PCR libre de nucleasa. </li><li> Dispensar plantilla de ARN en cada tubo. Nota: recuerde que debe calcular 10% de exceso de volumen / cada reactivo para pipetear y / o volumen muerto robótica. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Panel I Volumen (l) </td><td> Panel I + II Volumen (l) </td></tr><tr><td> Tampón de reacción 5x </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> Libre de nucleasa agua </td><td> 9.9 </td><td> 19.8 </td></tr><tr><td> Mezcla de enzimas </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 ARN Punto-en la plantilla </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> ARN total plantilla (5 ng / l) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr&gt; <tr><td> Volumen Total </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Invierta configuración reacción de transcripción. </li></ol> 2.1.4. Mezclar y centrifugar reactivos <ol><li> Mezclar la reacción por suave (1-2 segundos) vórtex para asegurar que todos los reactivos se mezclan a fondo. Después de mezclar, centrifugar (mini centrífuga Eppendorf con velocidad fija, 10 seg). </li></ol> 2.1.5. Incubar e inactivar el calor <ol><li> Programar una máquina de PCR de la siguiente manera: </li><li> Incubar durante 60 min a 42 ° C </li><li> Calor-inactivar la transcriptasa inversa durante 5 min a 95 ° C </li><li> Enfríe inmediatamente a 4 ° C </li><li> Almacenar a 4 ° C o congelación Nota: el protocolo se puede interrumpir en esta etapa. El cDNA diluido se conserva a -20 ° C durante un máximo de 5 semanas (tiendas opcional a 4 ° C durante un máximo de 4 días). </li></ol><pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. La amplificación por PCR en tiempo real 2.2.1. Preparar los reactivos para la PCR en tiempo real <ol><li> Coloque cDNA (del paso 2.1.5) en hielo. </li><li> Agua libre y Master PCR mix nucleasa Descongelar en hielo. Proteja los viales mezcla maestra de PCR de la luz cubriéndolos con papel de aluminio. Inmediatamente antes de su uso, mezclar la mezcla maestra de PCR por agitación 1-2 seg en una mini centrífuga y centrifugar a 1500 xg durante 1 min. </li></ol> 2.2.2. Combine la mezcla SYBR verde master, agua y cDNA y agregar a las placas PCR Se recomienda el siguiente procedimiento para evitar bajas concentraciones de cDNA se adhiera a la superficie del tubo: <ol><li> Antes de retirar la junta de la placa, girar brevemente abajo de la placa (s) en una centrífuga refrigerada a 1500 xg durante 1 min. </li><li> En un tubo cónico de 15 ml, combinar 2x PCR Master Mix y agua. Panel I: 2.000 l 2x mezcla maestra y 1.980 l de agua; Panel I + II: 4.000 l 2x mezcla maestra y 3960 μ; L de agua. </li><li> Añadir 20 l cDNA (panel I) o 40 l cDNA (panel I + II) y mezclar. </li><li> Mezclar suavemente por agitación 1-2 segundos y girar en una centrífuga refrigerada a 1500 xg durante 1 min. </li><li> Coloque la PCR Master Mix / cDNA mezcla en un depósito pipeta multicanal. Puede que tenga que identificar a un depósito que tiene la longitud de la pipeta multicanal. Esto mantiene el nivel de volumen lo suficientemente alto como para permitir alícuotas iguales de volumen en todo el multicanal. Esto es crítico hacia los últimos alícuotas. </li><li> Dispensar 10 l Master mezcla PCR / cDNA mezcla a cada pocillo de la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta de 16 canales. </li><li> Sellar la placa con sellado óptico. </li><li> Girar la placa brevemente en una centrífuga refrigerada (1500 xg durante 1 min), para mezclar las soluciones y eliminar las burbujas de aire. Nota: el experimento se puede detener en este punto. Guarde las reacciones protegidos de la luz a 4 ° C durante un máximo de 24 horas. </li></ol> 2.2.3. Real-Time PCR Realizar la amplificación por PCR en tiempo real y análisis de curva de fusión después de los parámetros que se detallan en la Tabla 2. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Paso del proceso </td><td> Configuración, Roche LC480 </td></tr><tr><td> Polimerasa de activación / Desnaturalización </td><td> 95 ° C, 10 min </td></tr><tr><td> Amplificación </td><td> 45 ciclos de amplificación en 95 ° C, 10 seg 60 ° C, 1 min -Tasa de rampa 1,6 ° C / seg Lectura óptica </td></tr><tr><td> Análisis de la curva de fusión </td><td> Sí </td></tr></tbody></table> Tabla 2. En tiempo real las condiciones del ciclo de PCR utilizando el Roche LightCycler 480. 2.3. Análisis en tiempo real de datos de PCR En tiempo real el análisis de datos de PCR se realiza con la Exiqon de GenEx profesional 5.0, siguiente trecomendó instrucciones. El manual de GenEx paso a paso se puede descargar en <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> El análisis de datos se compone de tres pasos: <ol><li> Importación de datos </li><li> Preprocesamiento de los datos </li><li> El análisis estadístico </li></ol> 2.3.1. Importación de datos <ol><li> En la Roche LightCycler 480 seleccionar el método de análisis nd derivado 2 y calcular los valores Cq. Los datos se exportan en forma de tabla y se guardan como archivos de texto. </li><li> Para importar los datos, abierta de GenEx y haga clic en el botón Asistente de importación Exiqon y haga clic en &quot;Inicio&quot;. Siga las instrucciones para seleccionar el formato, el instrumento y archivo de diseño de placa (s). Tenga en cuenta que los archivos de diseño de placa (excel) son descargados desde el sitio web Exiqon ( <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a> ). </li><li> Import Paneles I y II, y haga clic en &quot;Siguiente&quot;. </li><li> La tabla generada después de archivo de importación contiene columnas predefinidas. Nombres de muestras se pueden editar y columnas de clasificación se pueden agregar o quitar en este paso. Haga clic en &quot;Siguiente&quot; cuando haya terminado. </li><li> Guarde los datos y cargar a Editor de datos. </li></ol> 2.3.2. Preprocesamiento de los datos <ol><li> Según lo recomendado por Exiqon y de GenEx, al comparar múltiples placas lo primero que debe hacer es calibrar los datos entre las placas por la elección de calibración entre plato en el menú pre-procesamiento. </li><li> Se recomienda ejecutar arrays miARN en carreras por triplicado. Si un miARN no está presente en al menos dos de cada tres réplicas que se establecerá como nonexpressed. </li><li> En el siguiente paso en el procesamiento previo, establecer un punto de corte. Definición de un valor de corte indica que los datos con un ciclo umbral (C t) superior a este valor se descartan. En los presentes experimentos utilizando muestras de líquido cefalorraquídeo, el valor de corte se fijó en 39. Therntes, se descartarán todas las muestras con una C t por encima de 39 en las tres réplicas. Si un miARN tiene una T C&gt; 39 para una sonda (una réplica de tres), que la lectura será reemplazado con el promedio de la C t para los otros dos sondas, siempre que sean tanto por debajo de 39. </li><li> Definir los genes de referencia. De GenEx Professional tiene la opción de utilizar geNorm y / o NormFinder para identificar genes de referencia. Seleccione una lista de miRNAs que tienen valores similares en todos Cq muestra y se ejecutan geNorm y / o NormFinder. De acuerdo con este análisis, en el ejemplo dado aquí, miR-622 y miR-1266 tuvieron los valores más uniformes a través de las muestras y fueron elegidos como los genes de referencia (Figura 1). </li><li> A continuación, los datos se normalizaron utilizando los genes de referencia y los valores obtenidos se corresponden con el t? C </li><li> Si se realizaron reacciones de síntesis de ADNc por triplicado, en este momento los valores deben promediarse. </li><li> Validar la hoja para volvermover las columnas vacías y casi vacías. En la ventana de procesamiento previo, seleccione &quot;Validar hoja&quot; y que se aplican en la línea de las columnas vacías Remove. En la línea de abajo, elegir el porcentaje deseado de datos válidos y haga clic en Aplicar. Por ejemplo, seleccione 100% si desea comparar sólo miRNAs comunes a todas las muestras. </li><li> Manipular los datos que faltan. Seleccione &quot;Datos que faltan&quot; en el menú de preprocesamiento y eligió una de las opciones para manejar los datos faltantes. Este paso es necesario. Tenga en cuenta que de GenEx te dará error si intenta cargar archivos que contengan datos que faltan no controladas. </li><li> Determinar la cuantificación relativa entre los grupos de muestras (es decir. Experimento frente al control). Cuantificación relativa entre los grupos se calcula utilizando el método ΔΔ C t. En de GenEx, haga clic en la pestaña de procesamiento previo y seleccione la cuantificación relativa. En la ventana de seleccionar el grupo de referencia y pulse Aplicar. Tenga en cuenta que para representaciones gráficas y / o para otros análisis estadísticos, exprEssion datos deben ser convertidos a una escala logarítmica. En el menú de procesamiento previo, seleccione Log2. </li></ol> 2.3.3. Análisis estadístico Software de GenEx permite una amplia gama de análisis estadísticos, entre ellos T-test y ANOVA. <ol><li> Cargue el archivo mdf final al de GenEx y gestor de datos abierta. Es fundamental para seleccionar las muestras correctas o grupos de muestras para las que se realiza el análisis estadístico. </li><li> Seleccione &quot;Estadísticas&quot; y elegimos el icono correspondiente a la prueba deseada. </li><li> Haga clic en &quot;Ejecutar&quot; en la ventana del panel de control. Guardar los resultados como Excel o archivos mdf. </li></ol> 2.3.4. De perfiles de expresión Los microARNs y muestras se pueden clasificar, agrupar, y visualizados a fuego mapas y dendrogramas, de la siguiente <ol><li> Cargue el archivo mdf final al de GenEx y gestor de datos abierta. Utilice esta ventana para seleccionar y crear grupos de muestras o miRNAs. Haga clic en &quot;Aplicar&quot; cuando haya terminado. </li> &lt;li&gt; En la esquina izquierda selecto grupo superior y haga clic en el icono de mapa de calor </li><li> En la ventana Panel de control, haga clic en &quot;Ejecutar&quot;. El mapa de calor se puede guardar en varios formatos como tiff o bmp, sino que también puede copiar y modificar, según sea necesario. </li></ol>

<ol>
	<li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis.">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders.">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li><li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer.">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+in+body+fluid:+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis.">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA:+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer.">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids.">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li><li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs.">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los microARNs son pequeños RNAs no codificantes que regulan la expresión génica mediante la inhibición de la traducción y / o la promoción de la degradación del mRNA 2. Debido a su alta estabilidad en condiciones libres de células, los microRNAs se han detectado en muchos fluidos corporales. Además, el perfil de expresión distinta de microRNAs se ha correlacionado con la etapa y / o la progresión en una variedad de cánceres humanos 3-9. Hay varias herramientas disponibles para perfilar microRNAs, incluyendo arrays de chips clásicos o de la última tecnología de secuenciación profunda. Sin embargo, se optó por utilizar una plataforma altamente sensible qPCR 10, 11, que tiene la ventaja adicional de requerir una cantidad mínima de RNAs. El protocolo miRCURY LNA universal RT PCR microRNA está optimizado para utilizar 20 ng de ARN total por 20 l cDNA reacción de síntesis, 40 ng de la matriz de dos panel completo. Teniendo la opción de usar una pequeña cantidad de ARN es muy importante cuando se trata con valuabl<html> electrónico y muestras clínicas de difícil obtención, como CSF o tejidos embebidos en parafina fijado en formol 1. Es importante destacar que la utilización de bajas cantidades de ARN minimizar la concentración de posibles inhibidores presentes en la muestra. Fuera de los valores de Ct rango para la espiga-en probablemente indicar la presencia de algunos inhibidores en la muestra. Sondas espiga-en se pueden comprar por separado para analizar las muestras para determinar la presencia de inhibidores antes de miARN perfiles. Para esta prueba, la PCR en tiempo real solo se llevan a cabo utilizando concentraciones crecientes de ARN (si ng o l). En el presente protocolo, se presenta la extracción en fase orgánica antes del aislamiento de ARN. Cabe señalar que muchos kits nuevos de extracción de ARN no requieren este procedimiento. Por ejemplo, hemos perfilado con éxito miRNAs de plasma utilizando los biofluidos kit de aislamiento de ARN miRCURY para la extracción de ARN directamente a partir de 200 l de plasma (datos no mostrados), sin extracción con fenol / cloroformo. _content &quot;&gt; En general, es importante diseñar el experimento de antemano a fin de determinar el número apropiado de repeticiones necesarias para obtener resultados estadísticamente significativos. El número de repeticiones puede depender del número de muestras a analizar y puede depender de la variaciones dentro de las muestras o grupo de muestras. Para nuestro estudio, para lo cual se utilizó un número relativamente bajo de las muestras, 20 en total, se decidió crear la reacción de síntesis de ADNc por triplicado. Consultar con un experto en bioestadística antes de configurar los experimentos pueden ser una buena opción y es muy recomendable. Definición de la C t valor de corte es importante y depende del tipo de muestras, porque miRNAs altamente expresados ​​que se puede ajustar entre 25 a 35, pero para miRNAs expresadas bajas, como nuestras muestras de LCR, puede ser mayor. Otro paso crítico cuando se trata de análisis de datos es la elección de gen (s) de referencia. Para algunos datos sólidos (tales como miARN perfiles en células cultivadas) agnormalización lobal, que representa la C t promedio de todas las muestras, se puede utilizar. Sin embargo, esto no es una opción para muestras como CSF ​​que presentan variaciones. Del mismo modo, no podríamos utilizar como referencia genes esos miRNAs que generalmente se consideran sin cambios en los fluidos corporales. En lugar de ello, se seleccionaron todos los miRNAs que mostraron similares C t en todas las muestras, incluyendo las réplicas, y corrimos el análisis geNorm disponible en de GenEx (Figura 1). Los resultados indicaron miR-1266 y miR-622 como los miRNAs menos expresados ​​de diversas formas y que se utilizaron como referencia genes. Comparación de la expresión de miRNAs entre grupos se puede determinar utilizando la herramienta de cuantificación relativa en de GenEx, que sigue la fórmula estándar de 2 - (Ct-Ctrel). Finalmente, los resultados se pueden visualizar como diagramas de mapa de calor, bares gráficos u otros tipos de parcelas, como el diagrama de caja en la Figura 2. Otros tipos de visualización disponibles en de GenEx incluyen agrupación jerárquica,Auto-Organizada mapa (SOM), y Análisis de Componentes Principales (PCA). Además de miRNAs, el software de GenEx se puede utilizar para el análisis de otros tipos de matrices, tales como los ARN no codificantes largas (lncRNAs) de perfiles. El diseño de la placa se puede importar en el formato de Excel y los datos se pueden manejar como se ha descrito para el análisis de miRNA. De hecho, hemos perfilado lncRNAs de ratón neuronas corticales embrionarias primarias utilizando el kit de aislamiento mirVana miRNA como se describe en los pasos anteriores y hemos analizado los datos usando de GenEx (resultados no publicados). En resumen, se describe un protocolo para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo. Con algunas modificaciones relacionadas con la extracción de RNA, este procedimiento puede ser adaptado al perfil miRNAs en otros fluidos corporales y / o otro tipo de tejidos. Tenga en cuenta que en el procedimiento descrito aquí, una etapa de extracción orgánica se lleva a cabo antes del aislamiento de ARN. En general, esto no es necesario cuando el uso de kits disponibles comercialmente, tales como el ext mirVana Parískit raction. Además, cuando la extracción de ARN a partir de fluidos corporales y un ARN transportador se añade a las muestras que no hay necesidad de cuantificar el ARN y 2-8 l de ARN se sometió a síntesis de ADNc. Desde nuestra experiencia y teniendo en cuenta los altos costos relacionados con este tipo de experimentos, recomendamos probar algunas muestras primero, y luego de consultar con un experto en estadística para el número de muestras / réplicas para ser perfiladas con el fin de obtener resultados estadísticamente significativos.

Los microARNs pertenecen a la familia de pequeñas (21-23 nt de longitud) RNAs no codificantes que regulan la expresión de genes después de transcriptionally. microARNs pueden secretarse en el espacio extracelular donde parecen ser relativamente estables. Si bien la determinación de los cambios en la expresión de miRNA puede ser un paso importante hacia la identificación de biomarcadores, la realización de perfiles de miARN y el manejo de una gran cantidad de datos puede ser intimidante. Aquí se describe un protocolo para determinar los cambios en la expresión de miRNA en el líquido cefalorraquídeo (aplicable a otros fluidos corporales) por un tiempo real sensibles PCR. También describe el uso de software para análisis de datos, incluyendo el análisis estadístico y representación gráfica de los resultados. Todo el procedimiento es relativamente fácil y sencillo y, en función del número de muestras que se perfilados y el número de máquinas de PCR en tiempo real disponibles, también relativamente rápidos. La parte experimental requiere precisión en el manejoARN y el pipeteo en placas de 384 pocillos, mientras que la sección de análisis de datos utilizando de GenEx requiere algunos conocimientos básicos en informática y estadística.

Table III. List of equipment
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:27px;">
			Equipment
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:27px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:27px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finnpipette Novus Multichannel Pipetter
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			HH05279
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finntip Pipette Tips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			9400613
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermal Cycler C1000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0801
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Flat Cap Strips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0803
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Real-Time PCR System
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Sealing Foil
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			04 729 757 001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Refrigerated Centrifuge 5804R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Swing-bucket Rotor, 4-place
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			A-4-44
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Mini Centrifuge
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			05-090-100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			02-681-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Matrix Reagent Reservoir, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			8093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermomixer Confort
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Velp Scientifica
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			F202A0173
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table IV. List of reagents
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:25px;">
			Reagents
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:25px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203300
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203400
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203608
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			mirVana&#8482; miRNA isolation Kit, 40 isolations
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM1556
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MS2 RNA carrier
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10165948001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			2Betamercaptoethanol 98%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Sigma Aldrich
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			M3148-25ml
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ethanol 100%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Carlo Erba
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			64-17-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Nuclease free water
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Qiagen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			1039480
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			RNAse Zap&#174;
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM9780
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr

<html> Los microARNs (miRNAs) constituyen una capa potente de la regulación de genes guiando RISC en los sitios diana situados en ARNm y, por consiguiente, mediante la modulación de su represión de traducción. Cambios en la expresión de los genes miARN se han demostrado estar involucrados en el desarrollo de todas las principales enfermedades complejas. Por otra parte, los recientes hallazgos mostraron que los miRNAs pueden ser secretadas al medio extracelular y entran al torrente sanguíneo y otros fluidos corporales en los que pueden circular con alta estabilidad. La función de dicho miRNAs circulantes permanece en gran medida difícil de alcanzar, pero los enfoques de alto rendimiento sistemáticas, tales como arrays miARN perfiles, han llevado a la identificación de los genes miARN firmas en varios estados patológicos, incluyendo los trastornos neurodegenerativos y varios tipos de cánceres. En este contexto, la identificación de perfil de expresión de los genes miARN en el líquido cefalorraquídeo, como se informa en nuestro estudio reciente, hace miRNAs candidatos atractivos para el análisis de biomarcadores. _content &quot;&gt; Hay varias herramientas disponibles para crear perfiles de microRNAs, como microarrays, cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR), y la secuencia de profundidad. A continuación, describimos un método sensible para perfilar microRNAs en líquido cefalorraquídeo por cuantitativa en tiempo real PCR. Nosotros utilizado los Exiqon microARN PCR paneles humanos-listas para usar I y II V2.R, que permite la detección de 742 microARNs humanos únicos. Realizamos los arrays en carreras por triplicado y se procesaron y analizaron los datos utilizando el software de GenEx Professional 5. El uso de este protocolo, se ha perfilado con éxito microRNAs en diversos tipos de líneas celulares y células primarias, CSF, plasma y tejidos embebidos en parafina fijado en formol.

Los resultados de este estudio han sido publicados anteriormente 1. Figura 1 muestra los resultados del análisis de microRNAs de referencia candidatos usando la aplicación geNorm. En consecuencia, dos microARN, miR-622 y miR-1266, fueron identificados como genes de referencia y se utilizaron para normalizar los valores de miRNA. Para el estudio del LCR teníamos tres grupos de muestras: VIH (n = 10), HIVE (n = 4), y VIH + sin Encefalitis (VIH +, n = 5). Los dos grupos, HIVE y VIH +, se compararon con el VIH-grupo de control. Tras el análisis estadístico (apartado 2.3.3) niveles de expresión de microRNAs once se encontró significación estadística 1. Figura 2 representa un diagrama de caja de este once microARN, miR-1203,-1224-3p, -182 *,-19b-2 *, -204,-362-5p, -484, -720, -744 *, -934, y -937. Cada columna muestra la distribución de datos a través de las muestras dentro del grupo (verde para la colmena y rojo para VIH + sin renciaphalitis). Bigotes indican la mediana, el 1 (Q1) y 3 ª (Q3) cuartil, y el máximo y nonoutliers mínimos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51172/51172fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51172/51172fig1.jpg" /> Figura 1. Barra gráfico que muestra los resultados de la aplicación geNorm dentro de GenEx. Diez microRNAs se analizaron como posibles genes de referencia y los resultados indican miR-622 y miR-1266 (barras rojas) como los miRNAs más estable expresó. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51172/51172fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51172/51172fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51172/51172fig2.jpg" /> Figura 2. Diagrama de cajas que muestra la distribución de los datos de fo cada uno de los once miRNAs dentro de los grupos de HIVE (verde) y VIH + sin encefalitis (VIH +, rojo). Los bigotes en cada columna indican la mediana, 1 º (Q1, parte inferior de la caja) y 3 ª (Q3, top de la caja) cuartiles, los valores máximos y mínimos que son nonoutliers (líneas negras). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51172/51172fig2highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande.</a>

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Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

cerebrospinal-fluid-microrna-profiling-using-quantitative-real-time

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K vistas.  LSU Health Sciences Center.  Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido. 

Video: Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Investigación

Medicina

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

Movimiento de Reconversión utilizando información en tiempo real del rendimiento

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

En tiempo real de imágenes de rayos X de los pulmones de volúmenes de líquido en pulmón de ratón neonatal

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Real-time Pressure-volume Analysis of Acute Myocardial Infarction in Mice

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any potential therapeutic approach directed against acute left ventricular (LV) dysfunction. Current imaging modalities (e.g., echocardiography and magnetic resonance imaging) have several limitations since data on LV pressure cannot directly be measured. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion could serve as a novel method for a real-time evaluation of LV function.
At the beginning of the procedure, mice were anesthetized followed by endotracheal intubation. For LV catheterization, the right carotid artery was exposed via middle-neck incision. The catheter was introduced and placed into the LV cavity. Left thoracotomy was conducted and the left main coronary artery (LCA) was ligated. To induce reperfusion, the suture was released after 45 min. Pressure-volume data was recorded at all times.
Ligation of the LCA caused a decrease in LV systolic function as evidenced by a 30% reduction in stroke volume, LV ejection fraction (EF), and cardiac output. Maximum dP/dt as a parameter for LV contractility was also significantly reduced and diastolic function was severely impaired (minimum dP/dt -40%). Reperfusion over a period of 20 min did not lead to a complete recovery of LV function.
Real-time pressure-volume analysis served as a valid procedure for monitoring cardiac function during acute myocardial infarction in mice. Maintaining stable anesthesia and a standardized surgical approach was crucial to ensure valid results. As the early phase of acute myocardial infarction is critical for morbidity and mortality, the delineated method could be beneficial for preclinical evaluation of new strategies for cardioprotection.

Acute myocardial infarction in mice induces acute but incompletely characterized changes in left ventricular (LV) function. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion serves as a novel method for a real-time evaluation of LV function.

Análisis en tiempo real de presión-volumen del infarto agudo de miocardio en ratones

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any ...