Los autores agradecen a Adeline Dolly por las fotos de explante de fibronectina, Eric Theveneau útil para los debates y el Fondo para los Animales del Instituto Curie. CM es un becario postdoctoral de la Región Ile de France (Domaine d&#39;Interet Majeur vástago Pole), Université Paris Sud (Attache Temporaire d&#39;Enseignement et de Recherche) y la Agence Nationale de la Recherche. Este trabajo fue financiado por la Universite Paris Sud (Attractivite 2011), el Centre National de la Recherche Scientifique (Programa de Acción Thematique et incitativo sur), la Asociación pour la Recherche contre le cáncer de Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cáncer, y la Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programa Blanc).

Los experimentos cumplen con la reglamentación nacional y europea relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos y con los principios establecidos a nivel internacional de sustitución, reducción y refinamiento. 1. Preparación de platos recubiertos con fibronectina 14 <ol><li> Pipetear 500 ml de 10 mg / ml de fibronectina de grado cultivo diluido en 1x tampón fosfato salino (PBS) en una placa de Petri estándar de plástico (Ø 40 x 11 mm). Incubar a 37 ° C durante 1 hora. Nota: si usa platos de cristal o cubreobjetos de vidrio para la imagen posterior, utilice una solución de fibronectina 100 mg / ml. </li><li> Enjuague tres veces con PBS 1x. </li><li> Reemplazar PBS con 500 ml de 1x PBS/0.1% albúmina de suero bovino (BSA). Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Enjuague tres veces con PBS 1x. </li><li> Llenar con 1x PBS y se mantenga a 4 ° C hasta su uso (por lo general de 24 a 48 h). </li></ol> 2. La disección de los explantes NC &lt;ol&gt; <li> Preparar 3/4 normal Anfibio Medio (NAM) (NaCl 110 mM, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO3) 2, 1 mM de MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM de NaHCO3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml gentamicina 10,15). No guardar más de 1 semana para la disección, se almacenan a 4 ° C. NAM Mayor se puede utilizar para la preparación de platos de disección de agarosa recubiertas con (abajo). </li><li> Preparar 60 mm placas de Petri para la disección, recubiertas con 10 ml de agarosa al 2% en 3/4 de NAM. </li><li> Recoger herramientas de disección: pipetas Pasteur de plástico, una mejor pasador de insecto montado sobre soporte de pasador (ver tabla materiales para la referencia), un &quot;cuchillo de la ceja&quot; (hecho con pelo de las cejas incrustado en parafina en la punta de una pipeta Pasteur de vidrio 16), dos fina pinza de disección, pipeta P1000 y consejos, un estereoscopio binocular con aumento de 8-40X y 50, una fuente de luz brillante con fibras ópticas guías. Todas las herramientas de disección deben mantenerse limpios, después de cada experimento, enjuagarlos dos veces con agua destilada, una vez with etanol al 100% y dejar secar. Almacene lejos del polvo. </li><li> Llene el plato de disección con NAM fresca casi hasta la cima. </li><li> Obtener X. laevis embriones de acuerdo con los procedimientos estándar 10 y ellos envejecer hasta que alcanzan Néurula etapa 16 (de acuerdo con Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo 17). </li><li> Coloque etapa 16 embriones en el plato de disección utilizando la pipeta Pasteur de plástico. </li><li> Llevar a cabo todos los pasos subsiguientes en el marco del alcance binocular. Retire la membrana vitelina con dos pares de pinzas. Tenga cuidado de no dañar la parte dorsal de los embriones. </li><li> Espere hasta que los embriones han llegado a la etapa 17 para iniciar la disección. Etapa 17 es apropiado, ya que la cresta neural está claramente separado del tubo neural, en contraste con las etapas anteriores. Después de la etapa 17, se inicia la migración de Carolina del Norte y mezclándose con el mesénquima circundante. </li><li> Cavar un agujero pequeño en la agarosa con pinzas para hacer un hueco para los embriones con el fin de mantenerdurante la disección. Coloque un embrión dorsal hacia arriba. Nota: el modelado de la arcilla puede ser usado para mantener los embriones en lugar de excavación de un agujero en la agarosa. </li><li> Hacer una incisión en la parte lateral del pliegue neural anterior con el cuchillo de la ceja y el pasador de insectos. Tenga cuidado de no ir demasiado profundo en el embrión: tratar de cortar a través de 2-3 capas de células (nunca llegar tan profundo como el archenteron!). Durante todo el proceso de disección, nunca permitir que los tejidos disecados para entrar en contacto con la interfaz aire-líquido desde X. tejidos embrionarios laevis se lisan por la tensión superficial. </li><li> Haga una segunda incisión paralela en la parte más dorsal del pliegue neural utilizando los mismos instrumentos. </li><li> Si es necesario, gire el plato alrededor de 90 °. Hacer tercera incisión perpendicular con el cuchillo de la ceja y la clavija de insecto, en el lado posterior de las dos primera incisiones. La NC es una gruesa masa de células por debajo de la capa externa pigmentada del ectodermo, lateralpara el tubo neural. </li><li> Utilice la punta de la cuchilla de cejas para separar la capa de ectodermo pigmentada de la NC subyacente, a partir de la tercera borde de la incisión. </li><li> Utilice el lado de la cuchilla de cejas para separar el tejido NC a partir de la tercera incisión. El tejido NC es más bien gris, mientras que el mesodermo cefálico subyacente es blanco. Separe con cuidado la Carolina del Norte a partir del mesodermo. </li><li> Separe el tejido NC anterior de la vesícula óptica, y cortar en este nivel para liberar el explante. Como control para la primera experimentos, comprobando la expresión Snail2 (un marcador canónica Carolina del Norte) en algunos explantes por hibridación in situ se recomienda. </li></ol> 3. Plating explantes de fibronectina <ol><li> Rellena el plato fibronectina recubierto con Modificada Danilchick Medio (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO 3 5 mM, K Gluconato 4,5 mM, Na Gluconato 32 mM, MgSO4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA al 0,1%, se ajusta el pH a 8.3 con 1 M Bicina <sup&gt; 18). </li><li> La transferencia de los explantes en el plato fibronectina recubierto con una pipeta P1000. Nunca permita que los explantes para tocar la interfase aire-líquido. En primer lugar, la pipeta un poco de líquido en la punta, a continuación, los explantes, a continuación, algunos de nuevo líquido. No permita que el aire en la punta durante la transferencia de los explantes en el plato recubiertos de fibronectina. Una vez que la punta está dentro del líquido del plato fibronectina recubiertos, dejar que los explantes lentamente bajan por gravedad, o empujar con mucha suavidad. Evitar la expulsión de los explantes demasiado rápido. </li><li> Coloque 10-30 explantes en el plato con el cuchillo de la ceja. Evitar los lados del plato, que no son adecuados para la formación de imágenes posterior. </li><li> Trate de no mover el plato hasta que los explantes se han unido a la fibronectina (se tarda unos 15-30 minutos). Si es necesario, mueva el plato con mucho cuidado. </li><li> Coloque el plato en un incubador refrigerado (entre 15-20 º C, para la tabla de temperaturas ver 17). Cuando se coloca a 15 ° C, las células are suele migrar de manera eficiente y dispersando después de 6 horas de incubación (el tiempo puede variar entre los experimentos). </li></ol> 4. Injerto explantes en embriones de acogida <ol><li> Cortar un cubreobjetos de vidrio fina en piezas muy pequeñas utilizando fórceps gruesas. El tamaño de las piezas debe ser de aproximadamente 1,5 mm 2. Sumergir los trozos en una placa de Petri que contiene de 3/4 NAM o PBS usando fórceps. </li><li> Preparación del embrión de acogida: diseccionar la NC anfitrión en 3/4 NAM como se describe en 3) con especial cuidado de no dañar el embrión de acogida mientras se quita la membrana vitelina y la disección de la NC. La tensión del tejido tiende a aumentar el tamaño de la ablación: dejar que el embrión de acogida curar parcialmente, mientras que la disección de la embrión donante. </li><li> En otro plato de agarosa recubiertas con o en otra parte del mismo plato, diseccionar el explante NC del embrión donante como se describe en el Protocolo 3. Transferir el injerto de Carolina del Norte en el plato que contiene el host con cuidado, como se describe enProtocolo 3. </li><li> Colocar inmediatamente el explante NC a la zona de ablación host utilizando fórceps. El explante debe adjuntar parcialmente. Ponga un pedazo de cubreobjetos de vidrio sobre el embrión injertado para mantener el injerto en su lugar. Elige un pedazo de vidrio más grande que el embrión para evitar dañarla. El embrión será un poco aplanada. </li><li> Espere por lo menos 15 a 20 minutos, luego retire suavemente el cubreobjetos. Deje que el embrión se recuperan durante otros 10 minutos y la pipeta con cuidado en un plato limpio lleno de 3/4 NAM, utilizando la pipeta Pasteur de plástico. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe una técnica fácil de explante premigratorio craneal NC en embriones de X. laevis. Los embriones utilizados para dichos experimentos deben ser robustos y sanar bien. Deseche cualquier lote de embriones saludables. Además, crecer los embriones a diferentes temperaturas (de 12 a 18-20 ° C), con el fin de escindir la cresta neural en la etapa 17 y no más tarde. Después de la etapa 17, la cresta neural se puede mezclar con mesodermo cefálico y no se puede eliminar completamente. Tejidos de Xenopus se curan rápidamente y luego pierden su adhesión a otros tejidos. Es importante trabajar rápidamente y colocar los explantes de la cresta neural en el huésped tan pronto como se escindió del donante. En cuanto a los experimentos in vitro, placas de cultivo fibronectina pueden contaminarse con bacterias u hongos después de un par de días. Utilice materiales y soluciones de antibióticos y limpio o estéril tan a menudo como sea posible. Este procedimiento se optimiza fo de la cresta neural craneal. De hecho, esta población celular está bien definido y localizado en la etapa 17 embriones de Xenopus. Desafortunadamente, este modelo no es adecuado para llevar a cabo tales experimentos en el tronco NC. Embriones de aves son más adecuados para aquellos que estén interesados ​​en la manipulación de dicha población de células tronco NC. Los explantes se describen en este protocolo se puede utilizar para estudiar diversos aspectos del comportamiento NC, tanto in vivo como in vitro. El programa de desarrollo molecular NC se conserva en gran medida en los vertebrados 19. El desarrollo de la rana es un poderoso modelo para estudiar los vertebrados NC EMT, la migración y la diferenciación. X. células embrionarias laevis contienen suficiente yema para permitir su supervivencia in vitro durante varios días sin la adición de cualquier nutriente externa. Por lo tanto, los estudios in vitro pueden probar los efectos de varios factores de crecimiento o compuestos químicos, en un medio de cultivo simple y totalmente controlada. Tales experimentos han sidodiseñado para analizar EMT y la migración, incluyendo el estudio de los efectos de la quimio-atrayentes o repelentes de quimio-, de la activación o el bloqueo de las vías de señalización, etc 14,20-24 Este enfoque también se puede utilizar para diseñar protocolos de diferenciación NC dirigidas mejoradas. En el contexto de la elaboración de protocolos para la medicina regenerativa, la obtención de diversos tipos de células derivadas NC in vitro podrían ser utilizados en la detección de drogas para la comprensión y el tratamiento de neurocristopathies 25,26. Desarrollo NC está orquestada por una compleja interacción entre las normas y señales autónomas de células de los tejidos circundantes. Manipulaciones experimentales de la expresión génica, ya sea en el donante Carolina del Norte o en el embrión huésped, permiten discriminar células autónoma de aspectos autónomas noncell de desarrollo Carolina del Norte. La combinación de ganancia de función y knock-down se acerca a este protocolo para el cultivo in vitro e in vivo el injerto ha sido utilizar con éxitod 14,21,23,27-36. Esta técnica se puede adaptar para injertar otros tejidos en embriones de acogida y probar por sus potenciales de migración y diferenciación. Por ejemplo, se ha utilizado el ectodermo del techo blastocele pluripotentes (el &quot;casquillo animal&quot;) para buscar un interruptor transcripcional mínimas para el desarrollo de NC. Se ha estudiado el efecto de dos factores de transcripción, PAX3 y zic1, sobre el compromiso NC y el desarrollo posterior. Tapas en animales con PAX3 y zic1 ganancia de función se sembraron en fibronectina in vitro o backgrafted en embriones de acogida. Encontramos que las células Pax3/Zic1-induced migran y se diferencian como bona fide NC células tanto in vitro como en embriones de acogida 12. Numerosos mecanismos moleculares que rigen NC EMT y la migración también están involucrados en la diseminación metastásica en el cáncer 37. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar un simple, barato y efficiherramienta ent para los biólogos del desarrollo y otros investigadores para explorar los mecanismos fundamentales de estos comportamientos celulares clave.

La cresta neural (NC) es una población de células embrionarias transitoria que emerge del tubo neural en el extremo del tubo neural en embriones de vertebrados. Los eventos de señalización y genéticos que controlan la especificación NC comenzar tan pronto como la gastrulación. La NC se especifica en la frontera entre el ectodermo neural y no neural por las señales de los tejidos que rodean dorsales. Al final de la neurulación, NC células se someten a una transición epitelio-mesénquima (EMT) y migran extensamente en el embrión siguientes rutas estereotipadas de responder a las señales de guía circundante. Una vez que han llegado a su destino final, se diferencian en una amplia gama de derivados, por ejemplo, neuronas, células gliales, huesos, cartílagos y células pigmentadas 1-5. Debido a su contribución a muchos tipos de células y tejidos embrionarios, defectos en cualquier trámite del desarrollo de células NC, desde la inducción de la diferenciación final, puede causar síndromes congénitos con nombre neurocristopathies 6. Emanipulación Xperimental del NC en desarrollo en diferentes etapas - de especificación, EMT, migración y diferenciación - mejorará nuestra comprensión de neurocristopathies y permitir el diseño de estrategias terapéuticas potenciales. El embrión de Xenopus laevis es un modelo de elección para estudiar el desarrollo de NC. Un gran número de embriones son fáciles de obtener, y la fertilización externa da acceso a las primeras etapas de desarrollo. Muchas herramientas están disponibles para manipular experimentalmente X. laevis desarrollo embrionario. Ganancia de función y derribo Gene son fáciles de realizar mediante la microinyección de células individuales de primeros blástulas. Tejidos embrionarios pueden ser cortados para la reasociación in vitro o ensayos de 7-11 back-injerto 12,13. En este protocolo, se describe cómo diseccionar premigratorio NC craneal en X. laevis neurulas tarde, antes de la migración. Estos explantes se pueden cultivar en fibronectina-Coated placas para estudiar la migración y la diferenciación en controladas en condiciones experimentales in vitro. Explantes NC también se pueden injertar en embriones normales o manipuladas de acogida para estudiar su migración y diferenciación in vivo.

<table><tbody><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F4759-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, Fraction V</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-C</td><td>Lower quality grade may&amp;nbsp; be suitable for this application</td></tr><tr><td>Stainless Steel Insect Pins, Size 000</td><td>FST</td><td>26001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation

La cresta neural (NC) es una población de células dorsal del tubo neural transitoria que sufre una transición epitelio-mesénquima (EMT) al final de la neurulación, migra ampliamente hacia diversos órganos, y se diferencia en muchos tipos de derivados (neuronas, neuroglia, cartílago y hueso, células pigmentadas y endocrinos). En este protocolo, se describe la forma de diseccionar la premigratorio craneal NC a partir de embriones de Xenopus laevis, con el fin de estudiar el desarrollo de NC in vivo e in vitro. El modelo de la rana ofrece muchas ventajas para estudiar el desarrollo temprano; abundantes lotes están disponibles, los embriones se desarrollan rápidamente, ganancia in vivo y la pérdida de las estrategias de función permiten la manipulación de la expresión génica antes de la disección NC en donante y / o embriones de acogida. Los explantes de NC se pueden sembrar en fibronectina y utilizados para estudios in vitro. Ellos pueden cultivarse durante varios días en un medio definido libre de suero. También describe cómo injertar explantes NC espaldaen embriones de acogida para el estudio de NC migración y diferenciación in vivo.

Cuando chapada en fibronectina, los explantes de la cresta neural se adhieren rápidamente (15-30 min) y el explante se extiende plana dentro de 2 horas (Figura 1A). Después de 3-6 células hr comienzan a dispersarse. En 24 horas a 15 ° C, muchas células han comenzado a migrar fuera del explante (figuras 1B y 1C). Yema hace que las células muy brillante bajo contraste de fase (Figura 1B). Protuberancias celulares (filopodes y lamellipodes) son claramente visibles después de phalloidin tinción del citoesqueleto de actina (Figura 1C). Para el experimento de injerto ortotópico, los embriones donantes fueron inyectados con ARNm de GFP con el fin de seguir las células injertadas en el embrión de acogida no marcado. La craneal NC se realizó ablación en un lado de la máquina; 30-60 min después de la cirugía del injerto se ha curado, la sustitución de la ablación de acogida craneal NC (Figura 1D, 2 horas después del injerto). Unas horas más tarde, las células GFP-positivas han emigradofuera del explante y siguió las rutas de migración de las células NC estereotipadas hacia lugares craneofaciales ventral (Figura 1E). En los renacuajos, las estructuras craneofaciales NC-derivados han desarrollado (Figura 1G). Cuando craneal NC se realizó ablación, estas estructuras habían desaparecido, dando como resultado una cara más corta con el ojo adyacente a la glándula de cemento (Figura 1H, flechas rojas). En renacuajos injertados, las células NC donantes han aportado a las estructuras craneofaciales, lo que resulta en una cara morfología normal (Figuras 1F y 1I, flechas verdes). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51118/51118fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51118/51118fig1.jpg" /> Figura 1. In vitro y el comportamiento in vivo de explantado NC craneal. CA) &#160; Premigratorio NC se disecóa partir de un embrión neurula etapa 17 y se colocaron en una placa de fibronectina recubierto. A) 2 h después de la siembra, el explante se adjunta y se propague. B) 24 horas después de la siembra, las células han emigrado de manera eficiente en la fibronectina. C) lamellipodia y filopodios se ve claramente en la migración de las células NC marcadas con phalloidin (verde) etapa DI) neurula 17 GFP + etiquetada premigratorio NC fue tomado de un embrión de GFP-inyectado y back-injertado en un embrión de acogida, de la que craneal NC, se obtuvo en la etapa 17. - 18. D) Dos horas después del injerto, el explante se haya curado. células EF) Grafted NC han emigrado activamente y poblada de la corriente de la mandíbula, como se muestra en la etapa de renacuajo 31 y 41. etapa G) Control de 41 de renacuajo. H) ablación de la NC ha dado lugar a un dramático fracaso de la cara y el desarrollo del ojo (H: tenga en cuenta que el glan cementod desarrolla adyacente a la vista, debido a la falta de células NC pueblan las áreas de la mandíbula, flechas rojas. . Comparar controlar renacuajo en G) F, I) En contraste, las células injertadas NC han restaurado los ojos y el desarrollo de estructuras craneofaciales (F, I, flechas verdes) de CA, barras de escala = 100 mm;. DI, Barra de escala = 1 mm . D, vista dorsal. EI, vistas laterales. Esta cifra ha sido modificado de Milet et al. 12 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51118/51118fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Este protocolo describe cómo diseccionar la cresta neural craneal premigratorio (NC) de neurulas Xenopus laevis. Estos explantes se pueden sembrar en fibronectina y cultivadas in vitro, o injertados en embriones de acogida. Esta técnica permite el estudio de los mecanismos de la NC transición epitelio-mesénquima, la migración y la diferenciación.

La disección de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest para<em&gt; In vitro</em&gt; Explante cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trasplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

13.2K vistas.  Centre Universitaire.  Este protocolo describe cómo diseccionar la cresta neural craneal premigratorio (NC) de neurulas Xenopus laevis. Estos explantes se pueden sembrar en fibronectina y cultivadas in vitro, o injertados en embriones de acogida. Esta técnica permite el estudio de los mecanismos de la NC transición epitelio-mesénquima, la migración y la diferenciación. 

Video: Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Neurociencias

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Disección, cultivo y análisis de células de cresta neural craneal primarias de ratón para el estudio de la delaminación y migración de células de cresta neuronal

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

Preparación y análisis morfológico de cultivos de células de cresta neural craneal de pollo

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Biología

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Explant Culture of Neural Tissue

The intricate structure of the vertebrate nervous system arises from a complex series of events involving cell differentiation, cell migration, and changes in cell morphology. Studying these processes is essential to our understanding of nervous system function as well as our ability to diagnose and treat disorders that result from abnormal development. However, neural tissues are relatively inaccessible for experimental manipulations, especially in embryonic mammals. As a result, many scientists take advantage of explant culture in order to study neurodevelopmental processes in an &#8220;organotypic&#8221; environment, meaning that the tissue is removed from the organism but its complex cellular architecture is maintained. Generally, explant cultures are created by careful dissection of neural tissue that is then submerged in carefully designed growth media and cultured in vitro.
This video will first provide a brief overview of neural explant culture, including its advantages over other in vitro methods and important considerations for maintaining healthy tissue. Next, a general protocol will be provided for setting up an explant culture from embryonic mouse brain, outlining the isolation of embryos from the mother and dissection of the brain. The presentation also includes an overview of slice culture, in which thin sections of nervous system tissue are generated for improved visual access to the developing cells. Lastly, a few applications of these techniques will be provided to demonstrate how they can be used to answer important questions in the neurodevelopmental field.

Cultivo de explantes de tejido Neural

The intricate structure of the vertebrate nervous system arises from a complex series of events involving cell differentiation, cell migration, and ...

La disección de

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Celular-como Stem

Los cultivos neuronales de explantes de

Disección, Cultura y Análisis de