Name: whole animal perfusion fixation for rodents
Uploaded: 2012-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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Este trabajo fue financiado por el Centro de Tecnología de Comunicación Neural (CNCT), un Centro de Recursos P41 financiado por el Instituto Nacional de Bioingeniería e Imágenes Biomédicas (NIBIB, P41 EB002030) y apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

1. Preparar Fijador (Ver tabla de fijador y tampones.) 2. Preparar los búferes de perfusión (Ver tabla de fijador y tampones.) 3. Preparar Aparatos y Anestesia <ol><li> Usando el baño de agua, tampón de perfusión caliente a 37 ° C. Colocar la válvula de salida en un vaso lleno con tampón. Llenar una jeringa de 50 ml con tampón y se conecte a un tubo fijador. Lave la tubería en varias ocasiones por la expulsión y retirada del tampón. </li><li> Borrar la línea con el tampón hasta que todas las burbujas de aire en la tubería se eliminan. Es crucial para el éxito de una perfusión no tener burbujas de aire en cualquiera de las líneas. </li><li> Retirar la jeringa y conectar el fijador de paraformaldehído al 4% (temperatura ambiente) el contenedor. Para evitar burbujas de aire en el extremo del tubo, apretar el tubo, mientras que la colocación del tubo en el recipiente de manera que una gota de tampón sobresale desde el extremo to ponerse en contacto con la superficie del fluido dentro del contenedor. </li><li> Cierre la puerta de salida (extremo de la aguja). Gire la válvula de amortiguación (azul) a la misma posición que la válvula de fijador (blanco). Esto permitirá que el flujo desde la línea de tampón solo. </li><li> Abra la puerta de salida y repita el paso A1 a A3 para el llenado de la línea de amortiguación. Después de que todas las burbujas de aire se eliminan cerrar el orificio de salida, retire la jeringa y conectar el recipiente tampón, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la tubería. </li><li> Sistema de prueba para la capacidad de mantener la presión de bombeo del blub manómetro de goma. Normalmente existe una cierta resistencia debido a la compresión de aire en el sistema. </li><li> Instalación de herramientas de la cirugía con el fin de de fácil acceso. Llenar aguja de perfusión con tampón para eliminar la posibilidad de burbujas de aire. </li><li> Antes de la cirugía, una mezcla de ketamina / xilazina (hasta 80 mg / kg de peso corporal y ketamina 10 mg / kg de peso corporal xilazina) se administra mediante inyección intraperitoneal (27 aguja de calibre y jeringa de 1 cc). La administración adicional de anestésico se llevará a cabo según sea necesario durante el curso de cada operación para mantener un plano quirúrgico de anestesia. </li></ol> 4. Perfusión Cirugía <ol><li> Una vez que el animal ha llegado a un plano quirúrgico de anestesia, colóquelo en la bandeja poco profunda llena de hielo picado. (Use dedo pizca de respuesta el método para determinar la profundidad de la anestesia. Animal debe ser que no responde antes de continuar). </li><li> Haga una incisión 5-6 cm lateral a través del tegumento y la pared abdominal justo debajo de la caja torácica. Con cuidado, separar el hígado a partir del diafragma. </li><li> Haga una pequeña incisión en la membrana con las tijeras curvas, romas. La posición y la presión del dedo puede ayudar en la capacidad de cortar el diafragma. </li><li> Continuar la incisión diafragma a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural. </li><li> Coloque las tijeras curvas, romas a un lado de las costillas, el desplazamiento de cuidado de los pulmones, y hacer un cuT a través de la caja torácica hasta la clavícula. Haga un corte similar en el lado contralateral. </li><li> Elevación del esternón de distancia, recortar cuidadosamente cualquier tejido que lo conecta con el corazón. Sujetar la punta del esternón con la pinza hemostática y colocar la pinza hemostática sobre la cabeza. Cuando se hace correctamente, el timo se levanta desde el corazón, junto con el esternón, que proporciona una visión clara de los grandes vasos. </li><li> Hacer una pequeña incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo con unas tijeras iris. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <ol start="8"><li> Pasar una aguja de calibre 15-perfusión romo o de oliva con punta-a través del ventrículo corte en la aorta ascendente. La punta debe ser visible a través de la pared de la aorta, y no debe llegar al arco de la aorta en las arterias braquial y carotídeo divergen. </li><li> Utilizar una pinza hemostática para sujetar el corazón, esto asegura la aguja y evita la fuga. Si se desea, el hemostato modificado puede ser utilizado para sujetar la aorta alrededor de la punta de la aguja (estas hemostatos permanecer en su lugar hasta que comienza la disección, pero se omiten las ilustraciones futuras para mayor claridad). </li><li> Por último, hacer una incisión a la aurícula derecha del animal con unas tijeras iris para crear una toma de corriente tan grande como sea posible sin dañar la aorta descendente. En este punto el animal está listo para ser perfundido. </li></ol> 5. Perfusión <ol><li> Abrir y conectar el puerto de salida a la aguja de la base con cuidado de no introducir burbujas de aire. </li><li> Sube el manómetro de la bombilla a una presión de 80 mm Hg con rapidez y de manera uniforme. Mantener esta presión durante todo el período de infusión de amortiguamiento. Inicie el temporizador. </li><li> Ajuste el ángulo de la aguja. El ángulo de la aguja es crítica para la consecución de una tasa máxima de flujo (observar el cambio de flujo con ajuste del ángulo). </li><li> Cambie el beneficioER válvula (azul) una vez tampón está casi terminado (200 ml). El líquido debe estar en ejecución claro. La limpieza del hígado es un indicador de una buena perfusión. El hígado debe ser clara en este punto. Indique el tiempo para sus registros. </li><li> Temblores de fijación deben ser observadas en cuestión de segundos, lo que debería ser considerado como el verdadero tiempo de la fijación. Indique el tiempo para sus registros. </li><li> La presión puede ser gradualmente aumentar hasta un máximo de 130 mm de Hg 2 para mantener un caudal constante. </li><li> Cierre la válvula de salida una vez que el fijador está casi terminado. Indique que termina el tiempo para sus registros. </li><li> La rata debe ser rígida en esta etapa. </li><li> El paraformaldehído se ha de recoger y almacenar para su eliminación de acuerdo a los reglamentos de su institución. </li></ol> 6. Disección de 4,11 <ol><li> Retire el cabezal con un par de tijeras. </li><li> Hacer una incisión a lo largo del tegumento desde el cuello hasta la nariz y exponer lacráneo. </li><li> Se quita el músculo del cuello que queda para que la base del cráneo está expuesto; eliminar cualquier muscular residual con tijera o gubias. </li><li> Coloque el extremo afilado de un par de tijeras iris en el agujero magno en un lado, cuidadosamente deslizando las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo. </li><li> A continuación, hacer un corte que se extiende hasta el borde distal de la superficie del cráneo posterior. Haga un corte idéntico en el lado contralateral. Utilice las gubias para despejar el cráneo por el cerebelo. </li><li> Deslice cuidadosamente las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo como la punta se desplaza desde la esquina posterior dorsal distal al borde distal frontal del cráneo, levantando la hoja a medida que se corte para evitar daños en el cerebro. Repita para el lado opuesto. </li><li> Usando pinzas para pelar la superficie dorsal de la cabeza fuera del cerebro. Recorte los lados del cráneo usando pinzas también. </li><li> Usando una espátula, cortar los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosociones a lo largo de la superficie ventral del cerebro. </li><li> Suavemente se burlan de el cerebro lejos de la cabeza, el recorte de cualquier duración que aún conecta el cerebro con el cráneo con unas tijeras iris. </li><li> Quitar el cerebro y lo coloca en un vial de fijador líquido que contiene por lo menos 10 veces el volumen del cerebro mismo. Agitar el vial de vez en cuando. </li></ol> 7. Posterior a la fijación y almacenamiento <ol><li> Mantener el cerebro en fijador durante 24 horas a 4 ° C, agitando de vez en cuando. </li><li> Después de 24 horas, lave el cerebro con tampón fosfato salino mediante el intercambio de los medios de comunicación 3 veces y girando cada vez. </li><li> Los cerebros se pueden almacenar en tampón fosfato salino o HBHS con azida de sodio y se mantuvo a 4 ° C. </li></ol> 8. Los resultados representativos Un primer indicador del éxito de la perfusión es la limpieza de las extremidades, tales como la nariz, orejas y patas y los órganos internos tales como la glándula del timo y el hígado (IHC Mundial).Inspección macroscópica del cerebro revela el vacío vaso sanguíneo de la sangre (de color blanco a la apariencia de color amarillo pálido). Esto será cierto también en secciones de tejido destinar para la tinción e inmunohistoquímica. El indicador final de los resultados de la perfusión es la condición de la ultraestructura en el tejido. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Preparar Fijador: </td></tr><tr><td> Preparar un 8% de valores paraformaldehído </td></tr><tr><td><ol><li> Añadir 40 g de paraformaldehído y 500 ml de dH 2 O. Calentar la solución a 60 - 65 ° C mientras se agita (no superar los 65 ° C, ello puede afectar negativamente el éxito del procedimiento de inmunohistoquímica). </li><li> Para borrar la solución, reduzca el fuego y agregue 3.2 ml de NaOH 1,0 M con un gotero. </li><li> Filtrar y guardar a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparar 0,2 M tampón fosfato de sodio, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Para el fosfato de sodio monobásico de archivo, añadir 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O a 1 L dH 2 O. </li><li> Para el fosfato sódico dibásico de stock, añadir 28,4 g de Na 2 HPO 4 a 1 L dH 2 O. </li><li> Añadir 810 ml de la población monobásico a 190 ml de la población dibásico. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparar un 4% paraformaldehído fijador </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> Agregar a partes iguales el 8% de acciones de paraformaldehído buffer fosfato de sodio 0,2 M </li><li> Nota: esta revisión está mejor preparado fresco, no más de 72 horas de antelación. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparar la perfusión y tampones de almacenamiento: </td></tr><tr><td> Preparar tampón fosfato salino pH, 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 L DH 2 O </li><li> 9 g de NaCl </li><li> 144 mg de KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg de Na 2 HPO 4 </li><li> Verificar el pH </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES buffer Hanks solución (HBHS) con un pH de 7,4 Azida sódica </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml de H2O </li><li> 7,5 g de NaCl, </li><li> 0,3 g de KCl </li><li> 0,06 g KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g de dextrosa / glucosa </li><li> 2.4 g 10 mm Hepes </li><li> 0,1 g de MgCl 2 6 partes de dH 2 O </li><li> 0,05 g MgSO4 7 partes dH 2 O </li><li> 0,165 g de CaCl2 2 partes DH 2 O </li><li> 90 mg NaN 3 </li><li> Verificar el pH </li></ol></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Preparación del fijador y tampones. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Figura 1. </strong&gt; aparato de perfusión con componentes etiquetados. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Figura 2. Preparación de la perfusión Aparato I. Comienza con la línea de fijador. Lavar el tubo de burbujas de aire y llenar con tampón por rápidamente expulsar o retirar el tampón en la jeringa ya través de la línea. Cerrar la válvula en el extremo de la aguja fuera. Coloque la línea de fijador en la botella de fijador sin introducir burbujas de aire. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> Figura 3. Preparación de la perfusión Aparato II. 1. Abrir la válvula en el extremo de la aguja. 2. Gire la válvula de amortiguación (azul) en la posición de flujo. 3. Lavar el tubo de burbujas de aire y llenar con tampón por rápidamente expulsar o retirar el tampón con la jeringa. 4. Cerrar la válvula en el extremo de la aguja. Coloque el tubo en la botella de amortiguación. Presión de prueba para asegurarse de que el sistema está sellado correctomente por el bombeo de la bombilla manómetro y observa el manómetro. El aparato está ahora listo para el procedimiento de perfusión. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> Figura 4. Aparato de perfusión en la posición para la entrega de amortiguación. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Figura 5. Perfusión Cirugía I. a) Haga una incisión lateral a través del tegumento y la pared abdominal. b) Hacer una incisión en el diafragma y cortar a través del diafragma exponer el corazón. Hacer cortes paralelos a cada lado de las costillas hasta la clavícula. c) sujetar la punta del esternón con la pinza hemostática y colocar la pinza hemostática sobre la cabeza. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Figura 6. Perfusión Cirugía II. a) Se pasa la aguja de perfusión a través del ventrículo corte en la aorta ascendente. b) Fijar ella aguja de perfusión uso de un conjunto de pinzas hemostáticas para poner freno al corazón. Un segundo conjunto de una pinza hemostática modificada también se puede utilizar para sujetar la aorta alrededor de la punta de la aguja para evita la fuga. Con unas tijeras iris hará una pequeña incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Figura 7. Perfusión con bomba en el búfer de la bombilla de manómetro para crear presión en la línea. Abra la válvula (1) y conectar a la base de la aguja. Es fundamental asegurarse de que no queden burbujas de aire introducido. Sube el bulbo manómetro a una presión de 80 mm Hg y mantener esta presión durante todo el período de infusión tampón. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Figura 8. De perfusión con tampón de Fijación vez está casi terminado (200 ml) conmutar la válvula de tampón (1) para permitir la fijación al flujo. La presión se puede aumentar gradualmente hasta unmáximo de 130 mm de Hg. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> I. En la figura 9. La disección a) quitar de la cabeza con un par de tijeras. b) hacer una incisión en la piel a lo largo de la línea media desde el cuello hasta la nariz y exponer el cráneo. c) cortar el músculo del cuello restante de modo que la base del cráneo está expuesto. Sostenga la cabeza de modo que la gran abertura en la superficie del cráneo (foramen magnum) es accesible. Con cuidado, inserte la punta de unas tijeras iris en el foramen magnum y haga un corte. Repita la misma maniobra en el lado contralateral. Utilice las gubias para despejar el cráneo por el cerebelo. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Figura 10. Disección II. a) deslice cuidadosamente las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo. Levante la punta a medida que se corte para evitar daños en el cerebro. Repita el mismo paralado opuesto. Utilizar gubias pelar el cráneo fuera del cerebro. b) ilustración con el cráneo removido y expuesto el cerebro. c) utilizar una espátula para cortar los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosas en la zona más anterior del cerebro. Guíe con cuidado la punta de la espátula a lo largo de la parte inferior del cerebro para separar las conexiones para facilitar su eliminación. Retire el cerebro y lo coloca en un vial de fijador.

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	<li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections.">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li><li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats:+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion.">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li><li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li><li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain.">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li><li>Jung-Hwa, T. a. o. -. C. h. e. n. g., Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A, ., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain.">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li><li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li><li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+fine+structure,+and+immunostaining+for+neuropeptides:+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus.">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry.">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li><li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues.">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li><li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate dissection. , (1980).</li><li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Neurotrauma.">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Notas adicionales para una operación exitosa: <ol><li> Una vez que el diafragma se rompe, precede rápidamente a medida que la hipoxia y la hipercapnia iniciará irreversibles los cambios fisiológicos que pueden confundir el análisis posterior. </li><li> Cuando se inserta la aguja y se sujeta en su lugar, la presión residual empujar la sangre a la base de la aguja (flashback). De hecho, los animales más grandes con fuerza puede expulsar sangre. Es crítico que la sangre por lo menos llegar a la base de la aguja para evitar la introducción de burbujas de aire que se presentan un obstáculo para completar la perfusión. Si no se observa sangre en la base de la aguja, retire la aguja y vuelva a llenar con el tampón de su anexión al puerto de salida de la torre de la perfusión. Una vez búfer se ha ejecutado a través de la punta de la aguja puede ser reinsertada en el corazón. </li><li> La colocación correcta de la aguja dentro de la aorta es crítico, no debe llegar tan lejos como el arco aórtico. </li><li> Si perfusiones múltiples están llevando a cabo no es necesario to la instalación desde el principio cada vez. El usuario debe tener el volumen adecuado, tanto para el buffer y fijador en cada botella (200 ml animal / solución). Las botellas también se puede rellenar si es necesario. El aspecto más importante a considerar es el lavado de la línea de perfusión que va desde la configuración para el animal (la válvula de salida). Después de la terminación de una perfusión, esta línea tendrá paraformaldehído al 4% en el mismo. Retirar el tubo de la botella de tampón y utilizar una jeringa de 50 ml lleno de agua para enjuagar el fijador. Asegúrese de que la válvula de salida se coloca en un vaso de recogida de residuos para su eliminación adecuada de la paraformaldehído. Repita esto tres veces. Rellene con buffer usando el mismo método que se muestra en la 2.3. </li><li> Este método para la fijación es altamente adaptable con la capacidad de cambiar tanto tampón y fijadores otros fijadores (tales como los utilizados para EM) de acuerdo con los requisitos del experimento. </li><li> El sistema también se utiliza frecuentemente para la extracción de tejido vivo. Por estaun proceso simplemente utiliza la entrega de tampón solo (la botella de tampón, mientras que todavía unido a todo el sistema se coloca en un cubo de hielo y la botella fijador esté preparada como vacío pero sellado). Esto asegura una perfusión tampón frío a la presión óptima. Desde aquí, el sistema puede ser adaptado a la infusión de colorantes fixable por cualquiera de añadir el colorante directamente a la memoria intermedia (si la cantidad no es un problema) o utilizar una jeringa con una cantidad mínima de tampón / solución de colorante en el tampón de entre - paso fijador. </li><li> En el caso de colada vascular, la monitorización de la presión paso tampón es crucial sin embargo debido a la viscosidad y solidificando la naturaleza de la solución de colada o bien una jeringa 50ml debe ser utilizado para la entrega directa o un accesorio desechable secundaria al aparato (tubos, válvulas y manteniendo contenedor) hecho a la interfaz con el sistema actual se utilizará. Nuestros laboratorios de fundición vascular precedió al diseño y fabricación del aparato de perfusión. Por lo tanto no podemos ST al hacerlecomió que las mediciones de la presión será una medición exacta en el sitio de entrega. Los números pueden tener que ser ajustados para conseguir un suministro exitoso de fluidos viscosos. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anestésico: </td></tr><tr><td> La ketamina / xilazina mezcla (Anestesia pueden variar según el laboratorio / institución) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 ml frasco </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Cirugía: </td></tr><tr><td> Punta de la aguja, 27 x 1,25 GA &quot; </td><td> Servicios de material </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Grandes romas / romas tijeras curvas (aproximadamente 14,5 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Recta tijeras iris </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Norma pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Par de fino (Graefe) pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 pinza hemostática grandes - curvas o rectas (~ 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2 pinzas de hemostato estándar - recta dentada (14 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> Una pinza hemostática modificada (con orificio de calibre 15 presentada por la punta) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15-calibre de la aguja con punta roma o de oliva-(aguja de perfusión) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusión: </td></tr><tr><td> HyPerfusion sistema o equivalente &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tamponada con fosfato salino pH, 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> De vidrio poco profundo o una bandeja de plástico, de aproximadamente 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hielo picado </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baño de agua (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Temporizador </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml de jeringa </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> La disección: </td></tr><tr><td> Pensilvaniair de la norma tijeras rectas, rectas / romas (~ 12 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Medio gubias curvas o rectas (14-16 cm) o pinzas de hueso del cráneo de eliminación </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Recta tijeras iris (~ 9 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-espátula (2 dobles &quot;extremos planos, uno redondeado, cónico uno a 1/8&quot;) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Posterior a la fijación y el almacenamiento: </td></tr><tr><td> 50 ml frasco de vidrio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml de HEPES-Buffered Hanks Solución (HBHS) con azida de sodio (90 mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

El objetivo de la fijación es preservar rápida y uniformemente tejido en un estado de vida similar. Mientras que la colocación de tejido directamente en obras fijador bien para pequeños trozos de tejido, los especímenes más grandes como el cerebro intacto plantean un problema para la fijación de inmersión porque el fijador no llega a todas las regiones del tejido a la misma velocidad 5,7. A menudo, los cambios en respuesta a la hipoxia comenzar antes de que el tejido se puede conservar 12. La ventaja de la fijación directa perfusión a través del sistema circulatorio es que el producto químico puede llegar rápidamente a todos los rincones del organismo a través de la red vascular natural. A fin de utilizar el sistema circulatorio más eficaz, se debe tener cuidado para que coincida con presiones fisiológicas 3. Es importante señalar que las presiones fisiológicas son dependientes de la especie utilizada. Las técnicas para la fijación de perfusión varían en función del tejido a ser fijado y cómo el tejido será procesado posterior a la fijación. En este vídeo, Se describe un bajo costo, procedimiento rápido, fijación controlada y uniforme usando 4% de paraformaldehído perfundido a través del sistema vascular: a través del corazón de la rata para obtener la mejor conservación posible del cerebro para inmunohistoquímica. La principal ventaja de esta técnica (vs alimentada por gravedad sistemas) es que el sistema circulatorio se utiliza más eficazmente.

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Aquí se describe un bajo costo, procedimiento rápido, fijación controlada y uniforme usando 4% de paraformaldehído perfundido a través del sistema vascular: a través del corazón de la rata para obtener la mejor conservación posible del cerebro.

Animal entero fijación por perfusión de los roedores

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

381.2K vistas.  University of Michigan. Aquí se describe un bajo costo, procedimiento rápido, fijación controlada y uniforme usando 4% de paraformaldehído perfundido a través del sistema vascular: a través del corazón de la rata para obtener la mejor conservación posible del cerebro.

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2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2 vasos Oclusión / Hipotensión: un modelo de rata de isquemia cerebral global

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Investigación

Medicina

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Caracterización histológica de avería Microdevices Brain-implantado y el tejido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Neurociencias

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Nuevo pasivo claro los métodos para la producción rápida de transparencia óptica en todo el tejido del SNC

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

Un método basado en el Micro-CT para caracterizar las lesiones y la localización de electrodos en cerebros de animales pequeños

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific genes. Multiple means of assessing non-coding DNA and various chromatin states have proven useful in predicting the presence of enhancer sequences in the genome, but validating the activity of these sequences and finding the organs and developmental stages they are active in is a labor-intensive process. Recent advances in adeno-associated virus (AAV) vectors have enabled the widespread delivery of transgenes to mouse tissues, enabling in vivo enhancer testing without necessitating a transgenic animal. This protocol shows how a reporter construct that expresses EGFP under the control of a minimal promoter, which does not drive significant expression on its own, can be used to study the activity patterns of candidate enhancer sequences in the mouse brain. An AAV-packaged reporter construct is delivered to the mouse brain and incubated for 1-4 weeks, after which the animal is sacrificed, and brain sections are observed under a microscope. EGFP appears in cells in which the tested enhancer is sufficient to initiate gene expression, pinpointing the location and developmental stage in which the enhancer is active in the brain. Standard cloning methods, low-cost AAV packaging, and expanding AAV serotypes and methods for in vivo delivery and standard imaging readout make this an accessible approach for the study of how gene expression is regulated in the brain.

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

This protocol describes a novel rAAV-based transient enhancer-reporter assay. This assay can be used to induce enhancer-driven expression in vivo in the mouse brain.

Despliegue de AAV de construcciones de expresión basadas en potenciadores in vivo en cerebro de ratón

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small size of mouse organs, ex vivo perfusion of bone, bladder, skin, prostate, and reproductive organs is challenging or not feasible. Here, we report for the first time an in situ lower body perfusion circuit in mice that includes the above tissues, but bypasses the main clearance organs (kidney, liver, and spleen). The circuit is established by cannulating the abdominal aorta and inferior vena cava above the iliac artery and vein and cauterizing peripheral blood vessels. Perfusion is performed via a peristaltic pump with perfusate flow maintained for up to 2 h. In situ staining with fluorescent lectin and Hoechst solution confirmed that the microvasculature was successfully perfused. This mouse model can be a very useful tool for studying pathological processes as well as mechanisms of drug delivery, migration/metastasis of circulating tumor cells into/from the tumor, and interactions of immune system with perfused organs and tissues.

A protocol is described for in situ perfusion of the mouse lower body, including the bladder, the prostate, sex organs, bone, muscle and foot skin.

Establecimiento de la perfusión de circuito cerrado en situ de órganos abdominales inferiores y extremidades traseras en ratones

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Inmunotinción flotante de cerebros de ratón

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To maintain the morphology of these delicate tissues, it is routine to administer a chemical fixative such as paraformaldehyde via cannulation of the heart in anesthetized animals (transcardial perfusion). Transcardial perfusion of the mouse heart has traditionally relied on the use of peristaltic pumps or air pressure to deliver both the saline and fixative solutions necessary for this process. As an easily accessible alternative to these methods, this work demonstrates the use of a gravity-fed method of perfusate delivery that uses materials available in most hardware stores. 
To validate this new perfusion method, this work demonstrates all the subsequent steps necessary for the sensitive detection of phosphorylated &#945;-synuclein in both the brain and spinal cord. Included in these steps are the dissection of the fixed brain and spinal cord tissues, rapid freezing/embedding and cryosectioning of the tissues, and immunofluorescent staining. As this method results in whole-body delivery of the fixative, it may also be used to prepare other non-neuronal tissues for histologic analysis.

A convenient gravity-fed perfusion method for histological analysis of the mouse central nervous system is presented. Immunofluorescent detection of phosphorylated &#945;-synuclein is demonstrated in a mouse model of Parkinson's disease. This work also comprehensively describes the transcardial perfusion, dissection, tissue freezing/embedding, and frozen sectioning steps.

Un método de perfusión transcárdica alimentado por gravedad para el análisis histológico del sistema nervioso central del ratón

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo para el análisis de la columna dendrítica con Neurolucida 360

Dendritic Spine Quantification Using an Automatic Three-Dimensional Neuron Reconstruction Software

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed on dendritic spines. Dendritic spines are structures of great interest in research centered around synaptic plasticity, neurodevelopment, and neurological and psychiatric disorders. Dendritic spines undergo structural modifications during their lifespan, with properties such as total spine number, dendritic spine size, and morphologically defined subtype altering in response to different processes. Delineating the molecular mechanisms regulating these structural alterations of dendritic spines relies on morphological measurement. This mandates accurate and reproducible dendritic spine analysis to provide experimental evidence. The present study outlines a detailed protocol for dendritic spine quantification and classification using Neurolucida 360 (automatic three-dimensional neuron reconstruction software). This protocol allows for the determination of key dendritic spine properties such as total spine density, spine head volume, and classification into spine subtypes thus enabling effective analysis of dendritic spine structural phenotypes.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Optimización del análisis de la columna dendrítica para una evaluación manual y automatizada equilibrada en las dendritas apicales CA1 del hipocam

Dendritic spines are post-synaptic compartments of most excitatory synapses. Alterations to dendritic spine morphology occur during neurodevelopment, aging, learning, and many neurological and psychiatric disorders, underscoring the importance of reliable dendritic spine analysis. This protocol describes quantifying dendritic spine morphology accurately and reproducibly using automatic three-dimensional neuron reconstruction software.

Cuantificación de la columna dendrítica mediante un software automático de reconstrucción de neuronas tridimensional

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed ...