Este trabajo fue apoyado por el R01 AI32556 (NIAID, Instituto Nacional de Salud). Este trabajo también fue apoyado en parte por Louisiana vacuna centro y sur de Luisiana Instituto de Investigación de Enfermedades Infecciosas patrocinada por la Junta de Regentes de Louisiana.

1. Inoculación vaginal por Candida albicans <ol><li> Tres días antes de la inoculación, mientras que la restricción de los animales para exponer el abdomen, se inyectan 100 l de aceite de sésamo contiene 0,1-0,5 mg de β-estradiol por vía subcutánea en el abdomen inferior. Introduzca la aguja de 5 a 10 mm lateral a la piel para minimizar la fuga del sitio de inyección. La administración subcutánea de estrógenos en la parte inferior del abdomen es óptimo en este modelo debido a la proximidad a la zona genital. Las dosis efectivas pueden variar según las cepas de ratón, las edades o los derivados de los estrógenos. En estudios previos utilizando CBA-J (H-2 κ), C3H/HeN (H-2 κ), C57BL / 6 (H-2 b), ratones Balb / c (H-2 d), DBA / 2 (H- 2 d), SJL (H-2 s) en ratones de 6-8 semanas de edad, 0,1 mg/100 l era eficaz evidenciado por el engrosamiento de la pared vaginal, la reducción de la mucosidad vaginal yaumento de desprendimiento de las células epiteliales. Por encima de los ratones tratados con estrógenos en esta concentración muestra la colonización vaginal consistente con Candida. Para la inoculación en ratones de otras cepas y edades, un estudio piloto se recomienda para asegurar la eficacia de los estrógenos en las condiciones modificadas y aumentar la dosis de estrógenos si es necesario. La solución de estrógeno debe estar preparado fresco cada vez que en el día de la inyección. Para asegurar la solubilidad completa de estrógeno en el aceite de sésamo, mezcle la solución con un mezclador de vórtice y el calor de manera intermitente a 37 ° C. Repetir la inyección cada semana durante el período de estudio. </li><li> Para preparar el inóculo, añadir un asa de C. albicans blastoconidia de una subcultura de preparación reciente en Sabouraud-dextrosa agar (SDA) en 10 ml de caldo de peptona-Phytone suplementado con 0,1% de glucosa. Incubar el caldo de cultivo para la fase estacionaria durante 18 horas a 25 ° C en un baño de agua agitando. </li><li> Después de la incubación, recoger ºe caldo de cultivo en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 800 xg durante 5 min. Lavar el pellet dos veces con PBS estéril. </li><li> Enumerar blastoconidia viables en un hemocitómetro de trypan exclusión del colorante azul. Ajustar la concentración de células a 2,5 x 10 6 / ml (o una concentración de inóculo deseado) en PBS estéril. </li><li> Para estabilizar el ratón, mantenga la base de la cola con dos dedos y levante las caderas hacia arriba para que la abertura vaginal se enfrenta hacia usted (Figura 1A). Lo ideal es que el ratón se coloca sobre una superficie plana integrada (por ejemplo, la jaula superior) para que el ratón puede proporcionar resistencia a la moderación cola. </li><li> Colocar 20 l (o el volumen deseado, no será superior a 20 l) de la suspensión de inóculo mediante la inserción de la punta de la pipeta unos 5 mm de profundidad en el lumen vaginal (fig. 1B). Completar este paso tan rápido y suavemente como sea posible para minimizar el estrés en el ratón. </li></ol> 2. Lavados vaginales <ol><li> La eutanasia siguiente (o la anestesia), hedad el ratón hacia abajo por la base de la cola con dos dedos para que la abertura de la vagina queda expuesta. </li><li> El lavado del lumen vaginal mediante la introducción de 100 l de PBS estéril con la aspiración repetida y agitación con una punta de la pipeta. La punta de la pipeta puede taparse con las células. Si esto ocurre, prescindir de las células obstruyendo y continuar con el resto de lavaging PBS en la vagina. Recoger el líquido de lavado dentro de un tubo de microcentrífuga. </li><li> Por otra parte, lavados vaginales se puede realizar en ratones anestesiados con anestesia inhalatoria con isoflurano. Para ello, exponer a los ratones para el isoflurano vaporizado hasta que estén completamente sedado (~ 30 seg.). Mantener a los ratones a la baja en la base de la cola y suavemente lavado el lumen vaginal con 50 l de PBS estéril. Asegúrese de evitar la agitación dura con una punta de pipeta para minimizar el trauma de la vagina durante este procedimiento. Ratones sedados debe recuperarse de la anestesia en 30 segundos de exposición al aire del ambiente. Isofluranopuede ser vaporizado con un vaporizador de isoflurano y el O 2 (preferido) o un sistema estándar de gotas anestésicas cámara cerrada sin el sistema de vaporizador (requiere una estrecha vigilancia del animal mientras está sedado para evitar la dificultad respiratoria). Lavados vaginales en ratones anestesiados debe ser el método de elección para longitudinal muestras de lavado en los mismos ratones. Lavaging consecutivos no influyen en la evaluación de la carga de hongos en el tiempo 41. </li><li> Por vía húmeda de montaje en los preparativos, la transferencia de 10 l de líquido de lavado en un portaobjetos de vidrio y observar con un aumento de 400-1000x por microscopía de luz. Además, las fracciones celulares del líquido de lavado se puede teñir para examinar las células y morfologías nucleares. De frotis, la transferencia de 10 l de líquido de lavado en un portaobjetos de vidrio y suavemente propagarse a través de la pared exterior de una punta de la pipeta. Preservar las muestras de frotis con fijador CytoPrep y manchas por la técnica de Papanicolaou estándar (prueba de Papanicolaou). Observe a un aumento de × 400 por microscopía de luz. </li></ol> 3. Cuantificación de la carga fúngica vaginal <ol><li> En un 96 y de fondo redondo de placa, transferencia del líquido de lavado en un pocillo de la fila superior y 180 l de PBS estéril en los siguientes cinco pozos de la columna (por la placa). </li><li> Hacer 1:10 diluciones seriadas de líquido de lavado vaginal mediante la transferencia de l 20 de los fluidos del pozo al lado de la columna. Mezcle bien con la aspiración de repetir antes de cada transferencia. Diluciones en serie de hasta 12 muestras de lavado (una fila horizontal completa) se pueden realizar simultáneamente con una pipeta de 12 canales. </li><li> A partir de la dilución más baja, de transferencia de 10 l de la muestra en Sabouraud-dextrosa agar (SDA). Revestimiento de hasta 36 muestras se puede realizar en un plato con SDA preparado en la plaza de placas de Petri con cuadrícula y una pipeta multicanal separación ajustable. </li><li> Enumerar las unidades formadoras de colonias (UFC) después de la incubación a 34 ° C fo 48 h. </li></ol> 4. La extracción de tejido vaginal <ol><li> Tras el procedimiento de lavado vaginal, ponga el ratón sacrificados en la espalda y saturar el área de la ingle con un 70% de etanol. Con un par de pinzas, levantar el orificio urinario hacia arriba de modo que la abertura de la vagina queda expuesta. </li><li> Insertar un par de pinzas curvas en el lumen vaginal y localizar el cuello del útero. Mientras que mantiene un agarre firme con las pinzas, extraer el cuello uterino a través de la cavidad vaginal (Figura 2A-C). </li><li> Impuestos Especiales de la vagina en la base de la abertura vaginal y luego quitar el cuello de la vagina con una tijera quirúrgica. Tenga en cuenta que el tejido vaginal se involucionado (interior del epitelio del lado de la vagina está expuesta hacia el exterior). El tejido puede ser invertida lateralmente para mantener la orientación original de la vagina o se abre en una hoja haciendo una incisión lateral. Extirpado tejido vaginal puede ser utilizado para: 1) la extracción de linfocitos collage siguientesnase la digestión (~ 1 × 10 4 / ratón) 40, 2) el aislamiento de células epiteliales después de la digestión dispasa (~ 5 × 10 4 / ratón) 28, 3) preparaciones congeladas o incluidas en parafina para el análisis histológico 25. </li></ol> 5. Linfáticos lumbares escisión nodo <ol><li> Tras el procedimiento de lavado vaginal, ponga el ratón sacrificados en la espalda y saturar el abdomen con un 70% de etanol. Haga una incisión lateral a partir de la parte inferior del abdomen hasta el pecho y exponer a los órganos internos. Con un par de pinzas en ambas manos, mueva el intestino hacia arriba de manera que los vasos sanguíneos centrales se hacen visibles. </li><li> Localizar la vena cava inferior y la aorta abdominal. Normalmente, un par de ganglios linfáticos lumbares se pueden identificar junto a la aorta abdominal, que se encuentra a medio camino entre el origen de las arterias ilíacas comunes y renal 39. Estos ganglios linfáticos se pueden distinguir visualmente a partir de tejido adiposo en la textura elásticay son más ligeros y más opaco de color en comparación con el tejido adiposo (Figura 3). Estos ganglios son perceptiblemente más grandes en los animales infectados en comparación con animales no inoculados. </li><li> Los impuestos especiales de los ganglios linfáticos mediante la colocación de microforceps en el nodo y luego tire hacia arriba suavemente para separar del tejido circundante. </li></ol> 6. Aislamiento de células linfoides en una sola célula suspensiones <ol><li> La transferencia de los ganglios linfáticos en una pantalla de malla de alambre estéril (aproximadamente 3 x 3 cm 2 en tamaño) colocado dentro de un vaso estéril placa de Petri que contiene aproximadamente 10 ml de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) (Figura 4). </li><li> Con la placa de Petri ligeramente inclinadas, de prensa de los ganglios linfáticos en contra de la pantalla con una cabeza de émbolo de la jeringa. Asegúrese de que para romper todos los ganglios linfáticos por lo que el contenido celular de los nodos pasan a través de la pantalla, mientras que los componentes no celulares de los nodos (es decir, las membranas, el estroma, la grasa) se mantienen en la pantalla. </li><li> Utilizando el mismo émbolo y la jeringa, aspire tHBSS que las células que contienen. Lavar la pantalla con ~ 5 ml HBSS y recoger el líquido que queda en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Centrifugar a 800 xg durante 10 min. Aspirar los depósitos de grasa en la parte superior del líquido con una pipeta antes de desechar el líquido. Lavar el pellet de células tres veces con HBSS. Resuspender el precipitado en 1 ml de HBSS y enumerar células viables por exclusión del colorante azul de tripano. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Las fracciones celulares del líquido de lavado vaginal de&gt; 4 días de los ratones inoculados por lo general constan de Candida, las células epiteliales y los infiltrados celulares (Figura 5). Por vía húmeda de montaje en la microscopía, la Candida puede ser identificado visualmente por la presencia de hifas y levaduras (Figura 5). Frotis de líquido de lavado vaginal puede ser teñido por la técnica de Papanicolaou para examinar las células epiteliales y la infiltración de leucocitos, de los cuales las células principales son los neutrófilos identificados por el tri-nuclear lóbulos (Figura 5). Neutrófilos muy pocos, en su caso, se detectan en los ratones inoculados (Figura 5) 41. Un ejemplo de la carga de hongos vaginales se muestra en la Figura 6. Flujo vaginal lavado recogido en momentos específicos se cultivan para el recuento de UFC (Figura 6). Colonización vaginal / infección con Candida persiste durante semanas en los pacientes tratados con estrógeno ratones inoculados (Figura 6), mientras que Candida no logra establecer la colonización vaginal no tratadas con estrógeno-ratones inoculados (Figura 6). Tratadas con estrógeno-ratones inoculados siguen siendo negativos para Candida lo largo del tiempo (datos no mostrados). Además, los lavados vaginales se puede realizar una sola vez en ratones por separado en cada momento o de forma longitudinal en los mismos ratones bajo anestesia. Los ganglios linfáticos lumbares son los principales ganglios linfáticos de drenaje de la zona genital y el sitio más relevante para evaluar la respuesta inmune sistémica a un problema vaginal. Note que estos ganglios linfáticos pueden aumentar de tamaño en los ratones inoculados, mientras que las que figuran normalmente muy pequeñas en los ratones inoculados. Leucocitos recuperaciones celulares suelen oscilar entre 8 x 10 5 / ratón inoculado con 5 × 10 6 / ratón inoculado. Además de los ganglios linfáticos lumbares, los ganglios linfáticos inguinales, poplítea y mesentérica también puede ser utilizado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig1.jpg" /> Figura 1. Inoculación vaginal con Candida. A) Un ratón restringido para la inoculación. El ratón es colocado en una jaula de alambre y de inserción en poder de la base de la cola, ligeramente hacia arriba para levantar las piernas y los exponen a la apertura vaginal. La cadera del ratón se pueden estabilizar con la misma mano en su intento de resistirse a la moderación cola. B) Presentación del inóculo en el lumen vaginal. A punta de la pipeta se introduce suavemente unos 5 mm de profundidad en el lumen vaginal. El inóculo suspensión se deposita. Figura 2. Extracción de tejido dentro de la vagina. AB) Extracción de cuello del útero. El cuello uterino se encuentra con pinzas curvas y expuestos hacia el exterior a través de la cavidad vaginal. Una vez fuera de la cavidad vaginal, el cuello del útero está más tirado hacia fuera para exponer completamente la vagina. C) La extracción de la vagina. La vagina es eliminado de la vulva con una tijera. Una vez separados, eliminar el cuello de la vagina. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig3.jpg" /> Figura 3. Identificación de los ganglios linfáticos lumbares. La ubicación de los ganglios linfáticos lumbares entre los órganos que lo rodean / vasos sanguíneos en las inmediaciones de la pelvis se indica. Una aorta abdominal. B, de la vejiga urinaria. C, la arteria ilíaca común. I, de los intestinos. L, el hígado. R, el recto. S, el bazo. U, úteros. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig4.jpg" /> Figura 4. Los ganglios linfáticos lumbares coloca en un tamiz de malla de alambre. Los ganglios linfáticos están agrupados en la pantalla colocada en una placa de Petri con HBSS. Los ganglios linfáticos se presionan contra la pantalla con un émbolo de la jeringa para obtener células linfoides en una sola célula suspensiones. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig5.jpg" /> Figura 5. Fracciones celulares de fluido vaginal lavado de los ratones inoculados. Preparaciones A) en húmedo montaje y B) la prueba de Papanicolaou de muestras de lavado vaginal recogido cuatro días después de la inoculación y C) de los ratones inoculados. Se muestran las imágenes a 1000 × (A) o 400 × (B, C) de aumento. La inserción en el B se muestra la morfología nuclear de los neutrófilos a 1000 × vaginal. Candida de la levadura (Y) e hifas (H), las células epiteliales (CE) y neutrohils (N) se indican. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig6.jpg" /> Figura 6. Detectarion de carga fúngica vaginal. A) Las colonias de C. albicans Representante crecido en una placa de SDA. Puro (N) muestras de lavado de seis ratones inoculados diferentes (fila superior) se diluye en serie y se cultivan para el recuento de UFC. B) Cuantificación de la carga fúngica vaginal de estrógeno-tratados y C) los ratones no tratados con estrógenos. UFC/100 l de líquido de lavado de los ratones inoculados se evaluó en intervalos de tiempo indicados.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+epidemiology+of+vulvovaginal+candidiasis.">Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 544, 547-547 (1988).</li><li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+treatment+of+recurrent+vulvovaginal+candidiasis.">Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis.</a> Clin. Infect. Dis. 14, S148-S153 (1992).</li><li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulvovaginal+candidiasis:+Epidemiologic,+diagnostic,+and+therapeutic+considerations.">Vulvovaginal candidiasis: Epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations.</a> Am. J. Obstet. 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Methods. 69, 5072-5072 (2001).</li><li>Yano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell-derived+S100+calcium-binding+proteins+as+key+mediators+in+the+hallmark+acute+neutrophil+response+during+Candida+vaginitis.">Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis.</a> Infect. Immun. 78 (12), 5126-5126 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Un modelo experimental de ratón de la vaginitis por Candida se ha establecido y utilizado históricamente para las últimas décadas para estudiar la respuesta del huésped a la mucosa Candida, así como para las pruebas de terapias antifúngicas 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. Los protocolos que aquí se presenta incorpora eficientes y los métodos menos mano de obra, y parece ser uno de los sistemas modelo más optimizada de Candida vaginitis descrito hasta la fecha. Estas técnicas permiten la cuantificación rápida de la carga de hongos y la recogida de muestras vaginales. Además, estudios previos de pruebas varias cepas haplotípica de los ratones (n = 13) y varios puntos de tiempo después de la inoculación mostraron niveles similares de variabilidad en la carga de los hongos y las respuestas del huésped a la colonización vaginal por Candida 2,6,41. Por lo tanto, este modelo puede ser adaptado a los protocolos existentes, sin restricciones sobre las cepas de ratón o la duración de la infección. Sin embargo, hay que reconocer que elvariabilidad en la carga de hongos vaginales pueden ser altos entre los animales que recibieron el mismo inóculo (Figura 6). Existe evidencia que apoya que la variabilidad se produce debido a diferentes grados de adhesión a principios de epitelio vaginal 41. Por lo tanto, los ratones 7-10 / grupo se sugiere para fines estadísticos. La variabilidad en la carga de hongos vaginales también se ha evidenciado entre las diferentes cepas de C. albicans, lo que sugiere que no todas las cepas de C. albicans tiene la capacidad de colonizar la vagina de manera similar ratón. Por ejemplo, C. albicans 3153A (cepa de laboratorio) que se utiliza en este protocolo se ha informado que muestran mayor colonización vaginal que SC5314 (aislado clínico), donde sería un inóculo más alto (&gt; un registro) para obtener niveles equivalentes de carga fúngica vaginal visto con 3153A 27. De hecho, una colonización vaginal muy variable con varios aislados clínicos se ha documentado 36. Por lo tanto, se debe tener Taken la hora de determinar un inóculo óptima para cada C. albicans cepa para asegurar la colonización consistente en ratones. Por lo general, la media de UFC que van de 5 x 10 4 a 5 x 10 5 / 100 l líquido de lavado deben ser detectados para la colonización consistente. Para la evaluación de la carga de hongos vaginales, la cuantificación de UFC por lavados es apropiado para este modelo como Candida blastoconidia e hifas normalmente no penetran más allá de la capa superficial del epitelio vaginal. Nuestra evaluación anterior histológico de post-lavado tejidos vaginales rara vez mostró residual Candida 25,41. Sin embargo, reconocemos la posibilidad de que las hifas podría ser contado mal a medida que crecen como una sola colonia en la placa de agar y puede no reflejar la carga de hongos precisa. Como un método alternativo para UFC enumeración, un nuevo desarrollo en la técnica de imágenes in vivo se ha reportado para evaluar con éxito la carga fúngica vaginal cuando se utiliza la ingeniería genética luminiscentes C. albicans </em&gt; 9,29. Además, el protocolo puede ser modificada para inducir C. glabrata colonización en los animales diabéticos 15,20. Hasta la fecha, los modelos de ratón para otros no-C. Albicans inducido por vaginitis no se han reportado. La administración de estrógenos es fundamental para este modelo, iniciando la colonización vaginal por Candida resistente 6,14,23. Además de la inyección subcutánea de inyección de estradiol en la suspensión de aceite de sésamo, solubles en agua implantación de estradiol en PBS e intradérmica de una liberación controlada-estradiol pellet son métodos alternativos para la administración de estrógenos y se han empleado en modelos de ratón de otras infecciones del tracto genital femenino 10 , de 35 años. Requisito de estrógeno en este modelo se puede explicar por dos factores fisiológicos. Una de ellas es que el estrógeno promueve la elevación de la estratificación del epitelio de la vagina 5,8,30. Epitelio engrosado de una mayor proliferación de células epiteliales todos puedenow Candida para obtener una mejor adherencia a la pared vaginal y la posterior colonización. En segundo lugar, las células epiteliales vaginales se sabe que tienen alto contenido de glucógeno. Un aumento del tejido resultados a nivel de estrógeno en el depósito de glucógeno en las paredes de la vagina 30. Glucógeno elevadas en el microambiente vaginal a su vez puede permitir el florecimiento de Candida por el aporte de nutrientes adicionales. Previo análisis inmunológico mostraron que el estrógeno exógeno no afectan la expresión de molécula de adhesión celular 40. Un inconveniente del tratamiento de los animales con estrógenos exógenos es que el estrógeno eleva también ha sido conocido por promover el crecimiento excesivo de la flora comensal vaginal 30. Dado que la composición de la flora pueden variar significativamente entre los animales, esto puede agregar una variable que los organismos comensales pueden influir en el crecimiento de Candida o modular las respuestas del huésped. En consideración de esta cuestión, el modelo requiere un control de estrógenos tratadas (sin inocular) los animales que se incluirán entodos los experimentos y análisis en paralelo. En este modelo de ratón, la eficacia de los agentes antihongos pueden evaluarse con precisión por los protocolos descritos en este documento, que puede proporcionar determinante de los ensayos in vivo que lleva al desarrollo de terapias potenciales para el uso clínico. De hecho, la robustez del modelo proporciona una buena información sobre la eficacia clínica. Además de la utilización de estrógenos, pH neutro vaginal en ratones promueve el crecimiento de las hifas, una forma patógena de Candida se ve en todos los ratones inoculados. Al igual que en las observaciones clínicas, la migración de neutrófilos robusta vaginal se produce en un subgrupo de ratones sin afectar la carga de hongos 31,41. La presencia de neutrófilos es prominente en las mujeres durante vaginitis sintomática y parece que los ratones después de la inoculación en paralelo 12,41. Desde otros síntomas clínicos (es decir, picor, hinchazón) no se puede medir con precisión en los ratones, la evaluación de los neutrófilos vaginalsirve como una indicación simple y confiable de la inflamación (síntomas) en este modelo. La microscopía del líquido vaginal lavado se muestra en la Figura 5 se realiza rutinariamente en nuestro laboratorio para evaluar la colonización por Candida y la inflamación vaginal. Por otra parte, anotando las hifas también se puede utilizar como una medida de la infección. A partir de entonces, las fracciones celulares y solubles del líquido de lavado se puede conservar y crio-archivados para futuros análisis. Es de destacar que una característica ventajosa del protocolo es que los lavados vaginales se puede realizar de forma longitudinal en los mismos ratones bajo anestesia. Nuestros estudios anteriores confirman que la evaluación longitudinal no influye en la evaluación de la carga fúngica vaginal. Este enfoque es particularmente ventajoso en los casos en que los análisis longitudinales de la infección son deseados. Por último, hemos desarrollado un método menos invasivo escisión de la vagina. Esta técnica rápida y eficaz no requiere una incisión enel abdomen o en cualquiera de los órganos internos, dejando el resto de los órganos genitales intactos. Otra característica útil de este modelo es la falta de necesidad de fármacos inmunosupresores para iniciar la colonización por Candida. Esto es particularmente importante, ya que mantener el estado natural de inmunidad del huésped es un aspecto crítico de los estudios inmunológicos y las respuestas del huésped a un ataque microbiano. Por lo tanto, los tejidos y las células aisladas por estos métodos pueden aplicarse en diversos ensayos in vitro inmunológico. En conclusión, ofrecemos varias características importantes y los resultados de representante de la modelo experimental de la candidiasis vaginal. Además de C. albicans inducido por vaginitis, infecciones por otros patógenos del tracto genital inferior femenino, incluyendo Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis y el virus del herpes simple han sido estudiados utilizando modelos de ratón, donde los organismos son por vía intravaginal, introducido en los ratones tratados con hormona 1,7,10,22,26,35,38. Por lo tanto, las técnicas que son útiles para estudios con Candida vaginitis puede ser aplicado a avanzar y, potencialmente, las metodologías para estudiar la patogenia y respuesta inmune de acogida para otras enfermedades infecciosas del tracto genital inferior femenino.

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Mujer CBA / J ratones </td><td> Charles River Laboratories </td><td> 01C38 </td><td> 5-6 semanas de edad </td></tr><tr><td> Candida albicans (3153A) </td><td> Colección Nacional de hongos patógenos, Reino Unido </td><td> NCPF3153 </td><td></td></tr><tr><td> Aceite de sésamo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3547 </td><td> No tiene que ser pre-esterilizados antes de su uso </td></tr><tr><td> Β-estradiol 17-valerato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1631 </td><td> 0.1-0.5mg en aceite de sésamo </td></tr><tr><td> Phytone peptona </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211906 </td><td> Suplemento con glucosa al 0,1% </td></tr><tr><td> Solución de azul tripano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Sabouraud dextrosa agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211584 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa tipo IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 0,25% </td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> Invitrogen </td><td> 17105-041 </td><td> 1,7 U / ml </td></tr><tr><td> Pantallas de malla de alambre </td><td> TWP </td><td> 060X060S0065W36T </td><td> N º 60 de malla, de acero </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hanks </td><td> Invitrogen </td><td> 24020-117 </td><td></td></tr><tr><td> CytoPrep fijador </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-570-10 </td><td> Conserva diapositivas frotis </td></tr><tr><td> Papanicolaou EA-65 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 7054X-85 </td><td></td></tr><tr><td> Tinción de Papanicolaou OG-6 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 7052X-85 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina de Harris Alum </td><td> EMD Chemicals </td><td> 638A-85 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Baxter Healthcare </td><td> NDC 10019-773-60 </td><td> Se utiliza con vaporizador isoflurano o en un sistema cerrado anestésico cámara baja </td></tr></table>

protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of candida vaginitis

Candidiasis vulvovaginal (CVV), causada por especies de Candida, es una infección micótica de la parte baja del tracto genital femenino que afecta a aproximadamente el 75% de las mujeres sanas durante sus años reproductivos 18,32-34. Los factores predisponentes son el uso de antibióticos, diabetes no controlada y la alteración en los niveles hormonales reproductivos debido al embarazo, anticonceptivos orales o terapia de reemplazo hormonal 33,34. VVC recurrente (RVVC), definida como tres o más episodios por año, afecta a un independiente de 5 a 8% de las mujeres sin factores predisponentes 33. Un modelo experimental de ratón de la CVV se ha establecido y utilizado para estudiar la patogenia y la respuesta del huésped a la mucosa Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37. Este modelo también se ha empleado para evaluar el potencial terapias antifúngicas in vivo 13,24. El modelo requiere que los animales se mantienen en un estado de pseudoestrus para optarIMAL colonización por Candida / infección 6,14,23. Bajo tales condiciones, los animales inoculados se han detectable carga fúngica vaginal durante semanas o meses. Estudios anteriores muestran un paralelo muy alta entre el modelo animal y la infección humana con respecto a las propiedades inmunológicas y fisiológicas 3,16,21. Las diferencias, sin embargo, son la falta de Candida en la flora vaginal normal y un pH neutro vaginal en los ratones. Este sentido, demuestran una serie de métodos clave en el modelo de ratón que incluyen vaginitis inoculación vaginal, rápida recolección de muestras vaginales, evaluación de la carga de hongos vaginales, y los preparativos para la extracción de tejido celular / aislamiento. Esto es seguido por resultados representativos para los componentes del flujo vaginal lavado, la carga de hongos, y el drenaje de los rendimientos de los ganglios linfáticos de leucocitos. Con el uso de anestésicos, las muestras de lavado se pueden recoger en múltiples puntos de tiempo en los mismos ratones para la evaluación longitudinal de lainfección / colonización. Además, este modelo no requiere de agentes inmunosupresores para iniciar la infección, lo que los estudios inmunológicos en condiciones de host definidos. Finalmente, el modelo y técnica de cada uno introducido aquí podría dar lugar al uso de las metodologías para examinar otras enfermedades infecciosas del tracto genital femenino (bacterianas, parasitarias, virales) y las respectivas defensas locales o sistémicas.

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Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Las principales técnicas que se utilizarán en la evaluación de<em&gt; Candida</emVaginitis&gt; en un modelo animal experimental se describen. Los métodos permitirá una rápida recolección de muestras vaginales y los linfocitos de los ganglios de drenaje linfático lumbar. Estas técnicas pueden dar lugar a modelos de ratón de otras enfermedades en el tracto genital inferior femenino.

Protocolos para la inoculación dentro de la vagina y toma de muestras en el modelo experimental de ratón de Candida Vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

32.9K vistas.  Louisiana State University Health Sciences Center. Las principales técnicas que se utilizarán en la evaluación de Candida en un modelo animal experimental se describen. Los métodos permitirá una rápida recolección de muestras vaginales y los linfocitos de los ganglios de drenaje linfático lumbar. Estas técnicas pueden dar lugar a modelos de ratón de otras enfermedades en el tracto genital inferior femenino.

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Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Investigación

Inmunología e Infección

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Preparación de inmunógeno ratón hipófisis para la inducción de la hipofisitis autoinmune experimental

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonización vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Un modelo de ratón controlado para la Sepsis Neonatal polimicrobiana

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of their morbidity. The liver immunopathology caused by HIV-1 remains elusive. Small xenograft animal models with human hepatocytes and human immune system can recapitulate the human biology of the disease&#39;s pathogenesis. Herein, a protocol is described to establish a dual humanized mouse model through human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) transplantation, to study liver immunopathology as observed in HIV-infected patients. To achieve dual reconstitution, male TK-NOG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) mice are intraperitoneally injected with ganciclovir (GCV) doses to eliminate mouse transgenic liver cells, and with treosulfan for nonmyeloablative conditioning, both of which facilitate human hepatocyte (HEP) engraftment and human immune system (HIS) development. Human albumin (ALB) levels are evaluated for liver engraftment, and the presence of human immune cells in blood detected by flow cytometry confirms the establishment of human immune system. The model developed using the protocol described here resembles multiple components of liver damage from HIV-1 infection. Its establishment could prove to be essential for studies of hepatitis virus co-infection and for the evaluation of antiviral and antiretroviral drugs.

This protocol provides a reliable method to establish humanized mice with both human immune system and liver cells. Dual reconstituted immunodeficient mice achieved via intrasplenic injection of human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem cells are susceptible to human immunodeficiency virus-1 infection and recapitulate liver damage as observed in HIV-infected patients.

Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Divulgar la colección hemolymph y la inoculación de Metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus infection in mice. As alphaherpesviruses are main invaders of the peripheral nervous system (PNS), this model is suitable to characterize the kinetics of viral replication, its spread from the PNS to CNS, and associated neuroinflammatory responses. The footpad inoculation model allows virus particles to spread from a primary infection site in the footpad epidermis to sensory and sympathetic nerve fibers that innervate the epidermis, sweat glands, and dermis. The infection spreads via the sciatic nerve to the dorsal root ganglia (DRG) and ultimately through the spinal cord to the brain. Here, a mouse footpad is inoculated with pseudorabies virus (PRV), an alphaherpesvirus closely related to herpes simplex virus (HSV) and varicella-zoster virus (VZV). This model demonstrates that PRV infection induces severe inflammation, characterized by neutrophil infiltration in the footpad and DRG. High concentrations of inflammatory cytokines are subsequently detected in homogenized tissues by ELISA. In addition, a strong correlation is observed between PRV gene and protein expression (via qPCR and IF staining) in DRG and the production of pro-inflammatory cytokines. Therefore, the footpad inoculation model provides a better understanding of the processes underlying alphaherpesvirus-induced neuropathies and may lead to the development of innovative therapeutic strategies. In addition, the model can guide research on peripheral neuropathies, such as multiple sclerosis and associated viral-induced damage to the PNS. Ultimately, it can serve as a cost-effective in vivo tool for drug development.

The footpad inoculation model is a valuable tool for characterizing viral-induced neuroinflammatory responses in vivo. In particular, it provides a clear assessment of viral kinetics and associated immunopathological processes initiated in the peripheral nervous system.

Modelo de inoculación de la almohadilla del ratón para estudiar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por el viral

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Un ensayo ex vivo para estudiar Candida albicans Morphogenesis hifal en el tracto gastrointestinal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...