Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust (WT 0.795.880).

El protocolo siguiente se describe el estudio de la invasión de las células endoteliales por S. aureus, pero en teoría puede ser utilizada para estudiar la invasión celular por cualquier bacteria cultivables. Etapas específicas de S. Las células endoteliales aureus y se indican. 1. Preparación de las bacterias <ol><li> Cultura S. por cepas de Staphylococcus 04.16 h (en función de la fase de crecimiento es necesario) en 10 ml de infusión cerebro-corazón (BHI) caldo de cultivo a 37 ° C en el aire con agitación a 200 rpm. Estas condiciones de crecimiento son específicos para S. aureus y pueden necesitar ser adaptado para otras bacterias. </li><li> Lávese las bacterias en tres ocasiones en la Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Invitrogen) por rondas alternas de centrifugación a temperatura ambiente (5.000 x g, 10 min), la eliminación del sobrenadante del cultivo y la resuspensión del sedimento bacteriano en un volumen equivalente de DMEM. Medir la densidad óptica de la suspensión resultante de bacterias que se pueden ajustar según sea necesario. Para S. aureus, preparamos una suspensión a OD 600 = 1, que corresponde a ~ 10 9 ufc ml -1. </li></ol> 2. Cultivo de células endoteliales <ol><li> La cultura de la línea de células endoteliales EA.hy926 1 en DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS; 10%) y L-glutamina (2 mM) a 37 ° C en CO2 al 5%. Por otra parte, se agruparon las células humanas primarias endoteliales de vena umbilical (HUVEC) se pueden adquirir de Lonza (Basilea, Suiza) y se cultivaron en un medio endotelial basal suplementado con FBS al 2%, extracto de cerebro bovino (incluida la heparina), el factor humano de crecimiento del endotelio y la hidrocortisona a 37 ° C en 5% de CO 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Lonza). Estas condiciones de crecimiento son específicos para estas células y pueden necesitar ser adaptados para otros tipos de la célula huésped. </li><li> Se cultivan las células endoteliales en frascos T75 para completar la confluencia, verificado por los ojos. </li><li> Preparar las placas de 24 pozos para la inserción de los cubreobjetos. Pinzas finas (llama esterilización) se necesitan para mover el cubreobjetos, que tienen una superficie brillante y opaco uno. Cubreobjetos a cabo en los pozos de la placa de 24 pocillos con la superficie opaca hacia arriba para permitir la adhesión celular. </li><li> Liberar a las células del frasco T75 con 3 ml de tripsina-EDTA (0,25%) y añadir 10 ml del medio de cultivo correspondiente. </li><li> Añadir 500 l de células se resuspendió en 24 y placas que contienen cubreobjetos Thermanox vidrio. Un frasco T75 confluentes de células proporcionan suficientes células por dos placas de 24 pozos, lo que resulta en aproximadamente 5 × 10 5 células por pozo (en 500 l medio). </li><li> Incubar las placas durante 48 horas como se describe anteriormente, y verificar 100% de confluencia de células al microscopio de luz invertida. </li><li> Dip de lavado cubreobjetos en PBS y añadir nuevas placas de 24 pocillos que contiene 490 l MEDM con 10% de SFB en cada pozo. </li><li> Para examinar el papel de determinados procesos metabólicos en la invasión celular, los inhibidores se pueden añadir a las células cultivadas 1 h antes de la adición de las bacterias y las concentraciones de mantener durante el ensayo. Por ejemplo, para determinar el papel de la reorganización de la actina en S. aureus invasión de las células endoteliales, 50 M citocalasina D se pueden añadir, o para el papel de caveolas, 5 mM metil-β-ciclodextrina se puede añadir. </li></ol> 3. La invasión de ensayo <ol><li> Añadir 10 l de bacterias lavado (aproximadamente, 2 x 10 7 ufc ml -1 S. aureus) a cada pocillo con un cubreobjetos se lavaron con una capa confluente de células endoteliales en 490 l DMEM con 10% de SFB. </li><li> Incubar durante 15-90 minutos a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Para medir el número total de bacterias asociadas con las células (adherente e internalizado), baño de lavado de los cubreobjetos tres veces en PBS y se añade a los pozos nuevos con 500 l 0,5% de Triton X-100 en PBS. Para asegurarse de que las células totalmente lisis y la liberación de todas las bacterias internalizadas, pipeta varias veces, señalando que la punta de la pipeta directamente en la superficie del cubreobjetos. </li><li> Enumerar las bacterias en placas de la suspensión líquida (o diluciones de esta en caso necesario) sobre la superficie de las placas de TSA. Desde TX-100 se lisar muchas bacterias Gram-negativas, la saponina se puede utilizar en lugar de dos. </li><li> Para medir el número de bacterias internalizadas, separar el sobrenadante de cultivo de cada bacteria no consolidados y que contiene y reemplazar con 500 l de FBS DMEM/10% suplementado con 200 mg ml -1 gentamicina. Nosotros usamos la gentamicina en lugar de lysostaphin aquí, ya que es más barato y nos permite cambiar entre los experimentos con diferentes tipos de bacterias (por ejemplo, los estafilococos y Lactococci) sin tener que cambiar el protocolo experimental. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C en 5% CO 2 durante 60 minutos para matar todas las bacterias extracelulares. </li><li> Lave cubreobjetos 3 veces en PBS,lisis y enumerar en placas TSA a la descrita para el ensayo de adhesión anteriormente. </li><li> En algunos casos puede ser preferible contar visualmente el número de bacterias mediante microscopía de luz. En este caso, y específico para S. aureus invasión celular, el uso lysostaphin (10 mg ml -1) en lugar de gentamicina para destruir físicamente las bacterias extracelulares. </li><li> Incubar cubreobjetos de 20 minutos a 37 ° C en CO 2 en la solución de lysostaphin, luego enjuague y fijar con Cytopath (Cellpath). </li><li> Inundar el cubreobjetos con cristal violeta (0,5% w / v) durante 5 minutos. </li><li> Dip-enjuague con agua, aire seco y montaje en portaobjetos de vidrio. El número de bacterias por mm 2 de las células endoteliales confluentes se puede cuantificar mediante microscopía de luz. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Expresión de proteínas de unión a la fibronectina (FnBPA y FnBPB) en la superficie de S. aureus confiere la capacidad de invadir las células endoteliales. Un trabajo reciente ha redefinido el dominio de unión a fibronectina de FnBPA 3. De tipo salvaje (WT) S. aureus 8.325,4 invade las células endoteliales con una alta eficiencia, mientras que una cepa que carecen de ambos FnBPA y B (Δ FNB) mostraron niveles significativamente reducidos de internalización (Figura 1). Complementación del mutante con un plásmido que codifica una FNB menos el dominio de unión a fibronectina (pFnR0) no promover la invasión (Figura 1). Por el contrario, la complementación de los mutantes con un plásmido que codifica la FNB todo un gen (pFnBA4) restauró la invasión de los niveles de WT (Figura 1). El papel de FnBPA en la invasión de las células endoteliales también se puede demostrar utilizando la expresión heteróloga Lactococcus lactis anfitrión. Expresión de plásmidos codifican FnBPA en L. lactis (pRM9 9) no mejoran significativamente la adhesión a células endoteliales en comparación con las bacterias que expresan no FnBPA (CTL) (bares abiertos, Figura 1B). Por el contrario, FnBPA expresan L. lactis invadido las células endoteliales a niveles significativamente más altos que la cepa no expresa (bares cerrados, Figura 1B). Los experimentos se llevaron a cabo cuatro veces por duplicado y la media ± desviación estándar se presenta. * Representan los datos que son estadísticamente significativa (p = &lt;0,05) de los valores de WT o CTL. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La invasión de EA. Hy926 las células endoteliales de S. aureus (A) o L. lactis (B).

<ol>
	<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li><li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells.">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li><li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper.">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li><li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics.">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria.">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes.">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li><li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells.">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li><li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li><li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA.">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li><li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li><li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells.">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li><li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis.">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li><li>Schr&#246;der, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells.">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li><li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells.">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li><li>Eiff, C. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+small+colony+variants:+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians.">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li><li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells.">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li></ol>

<html> El ensayo se describe se basa en el ensayo de protección de la gentamicina, que se ha utilizado ampliamente para estudiar la invasión de las células huésped por las bacterias. Las observaciones de la incapacidad de los antibióticos gentamicina y otros para matar las bacterias intracelulares se utilizaron en los primeros estudios sobre la invasión de las células huésped por 4-8 bacterias. El uso de 24, 48 o incluso 96 y placas permite la generación de grandes cantidades de datos cuantitativos y reproducibles en un corto período de tiempo ya un costo relativamente bajo. El ensayo también es atractivo porque no requiere de equipos especializados, que pueden ser adaptados para trabajar con varias bacterias y células, y puede ser utilizado para estudiar el papel de los procesos celulares bacterianas y de acogida en la invasión 9. De hecho, desde los primeros experimentos, el ensayo de protección de la gentamicina se ha empleado ampliamente para medir la invasión de la célula huésped por una serie de diferentes bacterias o incluso combinaciones de bacterias 10,11. Si bien los principios básicos son las mismas variaciones, muchas sutiles en el método se han reportado. En este artículo hemos descrito nuestra versión e indicó que las modificaciones que sean necesarias para otras bacterias o las células huésped. Al diseñar un experimento para medir la invasión de la célula huésped utilizando este enfoque, hay una serie de puntos importantes a considerar: Sensibilidad bacteriana a la gentamicina. Esto puede parecer obvio, pero es importante asegurarse de que la bacteria se está estudiando es susceptible a la gentamicina a la concentración, la temperatura y el tiempo de duración que se utilizará. En el caso de falta de sensibilidad, puede ser posible usar otros antibióticos 5. Un enfoque alternativo puede ser el uso de enzimas líticas (lysostaphin, mutanolisina, lisozima) 12. La incubación y el inóculo. Al realizar esta prueba por primera vez es importante para establecer los tiempos de incubación óptimo y inóculo bacteriano que se utilizará. Por lo tanto, los experimentos iniciales debe examinar tanto la adherencia y la invasión a través del tiempo (5 min a un máximo de 6 h). También es importante para evaluar la invasión se ve afectada por la multiplicidad de infección (MOI, el número de bacterias por célula). En general, lo mejor es utilizar el menor número de bacterias es posible ya que esto reducirá el daño a las células cultivadas. Importantes diferencias entre las cepas se puede perder si durante largos períodos de incubación o inóculos grandes se utilizan 9,13. El daño celular. Es importante lavarse las bacterias antes de su uso. Sin embargo, el daño celular no se limita a la producción de toxinas. La invasión bacteriana, la inducción de la apoptosis y la alteración de las funciones celulares pueden causar daño celular. Esto puede llevar a la penetración de la gentamicina en la célula, matando a las bacterias internalizadas y dando la impresión de que la invasión no se ha producido 14. Las condiciones de incubación. La temperatura y la composición del medio de cultivo puede tener un impacto significativo en la invasión. Por ejemplo, la invasión de las células HeLa por Streptococcus pyogenes depende de la presencia de fibronectina soluble, la cual está normalmente presente en el suero 15. Otra consideración es el crecimiento de bacterias en el medio de cultivo durante el transcurso del experimento. Cultura y cuantificación de bacterias intracelulares. A pesar de TX-100 no puede matar a las bacterias intracelulares, que pueden inhibir su crecimiento. Como tal, es importante comprobar la replicación bacteriana en el medio sólido en presencia del detergente. Cuando existan, puede ser posible utilizar concentraciones más bajas del detergente o usar una alternativa como la saponina. Una de las ventajas de la protección de ensayo gentamicina sobre el cristal violeta y el ensayo de microscopía es que es menos mano de obra, y permite la detección y diferenciación de las sub-poblaciones de bacterias internalizadas. Por ejemplo, S. aureus puede producir un tipo de colonia normal (NCT), o la variante pequeña colonia (SCV) 16, que no se distinguiría por microscopía de las células bacterianas individuales. Una de las ventajas de la tinción de cristal violeta y el ensayo de microscopía en el ensayo de protección de la gentamicina es aglutinación de células pueden ser tenidos en cuenta y que las bacterias intracelulares que introducir una &quot;viables pero no cultivables&quot; voluntad estatal se detectaron 17. Examinar el papel de los procesos de la célula huésped en la invasión bacteriana. Muchos estudios han utilizado inhibidores de la función de la célula huésped, como la citocalasina D, que interfiere con la reorganización de actina. Estos estudios también pueden incluir anticuerpos que se dirigen a los receptores de la superficie celular y caída siRNA de genes específicos 18. Es de vital importancia para garantizar que estos tratamientos no afectan a la viabilidad o la unión de las células cultivadas o tener efectos tóxicos sobre las bacterias. Orientación futura: CONTENIDO &quot;&gt; Debido a que este ensayo se realiza típicamente en múltiples placas de cultivo celular, es teóricamente posible adaptarlo a una operación de selección de alto rendimiento, lo que podría implicar el examen de las bibliotecas de los posibles inhibidores de la función celular, antiinfecciosos o antibióticos diseñados para atacar las bacterias intracelulares. Por otra parte, este enfoque podría utilizarse para detectar bibliotecas mutantes para identificar genes implicados en la adhesión, la invasión o la supervivencia intracelular. En algunos casos puede ser deseable incluir las fuerzas de corte (de flujo) en el sistema modelo, por ejemplo, cuando se modela el endotelio, para imitar más de cerca el ambiente en vivo. Los avances actuales en el diseño y la fabricación de celdas de flujo y sistemas de cultivo celular de microfluidos ofrecer la posibilidad de emplear el ensayo de protección de la gentamicina en huésped-patógeno modelos que incorporan las fuerzas de cizalla. En resumen, el protocolo descrito aquí se basa en métodos similares usados ​​durante muchos años. Que es ampliamente aplicable a muchos tipos de células cultivadas y especies de bacterias y puede generar grandes cantidades de datos de forma rápida ya un costo relativamente bajo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Brain heart infusion</td><td>BioChemika</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;tal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial basal medium</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3121</td><td></td></tr><tr><td>Bovine brain extract (including heparin)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092</td><td></td></tr><tr><td>Human endothelial growth factor</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4017C</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4035C</td><td></td></tr><tr><td>GA-1000</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092C</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Lysostaphin</td><td>AMBI</td><td>LSPN-50</td><td></td></tr><tr><td>Thermanox coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TKT-210-330P</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Cytopath</td><td>TCS Biosciences</td><td>HC8595</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2618</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-B-cyclodextrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>332615</td><td></td></tr></tbody></table>

invasion of human cells by a bacterial pathogen

Aquí vamos a describir la forma en que el estudio de la invasión de las células endoteliales humanas por Staphylococcus aureus patógeno bacteriano. El protocolo general se puede aplicar al estudio de la invasión de las células de prácticamente cualquier bacteria cultivables. Las etapas en las que los aspectos específicos de la invasión se puede estudiar, como por ejemplo el papel de la reorganización de actina o caveolas, se destacó. Las células hospedadoras se cultivan en frascos y cuando esté listo para su uso se siembran en placas de 24 pocillos que contienen cubreobjetos Thermanox. Utilizando cubreobjetos permite su posterior eliminación de las células de los pozos para reducir la interferencia de las proteínas del suero deposita en las paredes de los pozos (a la que se conceden por S. aureus). Las bacterias se cultivan a la densidad requerida y se lavan para eliminar cualquier proteínas secretadas (por ejemplo, toxinas). Cubreobjetos con capas confluentes de células endoteliales son transferidos a nuevas placas de 24 pocillos que contienen medio de cultivo fresco antes de la adición de bacterias. Las bacterias y las células se incuban juntos por la cantidad de tiempo requerido en el 5% de CO 2 a 37 ° C. Para S. aureus suele ser entre 15-90 minutos. Cubreobjetos Thermanox se eliminan de cada pozo y la inmersión se lavan en PBS para eliminar las bacterias sin ataduras. Si el total de bacterias asociadas (adherente e internalizado) se cuantifica, cubreobjetos se colocan en un lugar bien fresco que contiene 0,5% de Triton X-100 en PBS. Pipeteo suave lleva a completar la lisis celular y las bacterias son enumerados por la dilución de serie y placas en agar. Si el número de bacterias que han invadido las células que se necesita, cubreobjetos se añaden a los pocillos con 500 l medio de cultivo de tejidos suplementado con gentamicina y la continuación de incubación de 1 h, lo que va a matar todas las bacterias externas. Cubreobjetos puede ser lavado, las células lisadas y las bacterias enumeradas en placas en agar como se describió anteriormente. Si el experimento requiere la visualización directa, cubreobjetos se fijaron y se tiñeron para microscopía óptica, fluorescencia o confocal o preparados para microscopía electrónica.

Watch this Scientific Journal Video about Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Un protocolo general para el estudio de la invasión de las células huésped por un patógeno bacteriano, centrándose en<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Y las células endoteliales humanas.

La invasión de las células humanas por un patógeno bacteriano

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.7K vistas.  University of Bath. Un protocolo general para el estudio de la invasión de las células huésped por un patógeno bacteriano, centrándose en Staphylococcus aureus Y las células endoteliales humanas.

Video: Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Investigación

Inmunología e Infección

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

Entérica invasión bacteriana de las células epiteliales intestinales<em&gt; In Vitro</em&gt; Se ha mejorado considerablemente gracias a un modelo de cámara de difusión vertical

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

Un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de fluido cerebroespinal humano Sangre-para estudiar la infección bacteriana desde el lado basolateral

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

Medicina

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

Usando un patógeno bacteriano a punta de prueba para las respuestas celular y organísmica nivel Host

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A Bacterial Infection Assay for Studying Anaerobic Bacteria-Host Cell Interactions

Source: Wunsch, C. M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53408">Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique for assessing the ability of Porphyromonas gingivalis, an anaerobic pathogenic bacterium, to adhere to and invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). After infecting the host cells with the bacteria, the host cells are lysed to release both adhered and internalized bacteria. When the lysate is plated in an appropriate medium, the presence of colonies indicates successful bacteria-host cell interactions.

Ensayo de infección bacteriana para el estudio de las interacciones anaeróbicas entre bacterias y células huésped

The following protocols will describe methods for culturing and studying the invasion by the anaerobic species, P. gingivalis; however, these protocols ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in an Ex Vivo Organ Culture

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates a method to establish an infection model in placental tissues to study infection propagation. An ex vivo placental organ culture is infected with Listeria monocytogenes, a facultative intracellular parasite. The bacteria invade extravillous trophoblasts (EVTs) to enter the placental tissue and then propagate to other cells via cell-to-cell spread.

Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en un cultivo de órganos ex vivo

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

Immunopathology

In Vitro Models

A Permeable Membrane Insert-Based Infection System to Study the Impact of Bacterial Toxins

Source: Flaherty, R. A., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54406">Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a permeable membrane insert-based infection system to assess the impact of secreted bacterial toxins. By eliminating direct contact between the bacterial pathogen and the host cells using a permeable membrane, this technique allows for studying the effect of toxins secreted by pathogenic bacteria on mammalian host cells.

Un sistema de infección basado en insertos de membrana permeable para estudiar el impacto de las toxinas bacterianas

1. Bacterial Culture

	Generate isogenic mutant strains to be used for the study of the specific secreted factor of interest.
	Note: The GAS (Group A ...

La invasión de las células humanas por un patógeno bacteriano

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video