El proyecto descrito fue apoyada por los números de Grant P01 AI055637 y AI057156 U54 del NIAID / NIH. Sus contenidos son de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la Oficina de Programas de ICE, el NIAID, o NIH.

Día 1: F. tularensis inoculación placa <ol><li> Cultivos en placa de valores congelados de F. tularensis en agar Mueller-Hinton suplementado con 2,5% (vol / vol) de los donantes de suero de ternera, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, el 0,1% (wt / vol) de glucosa, y el 0,025% (wt / vol) de pirofosfato de hierro. Crecer F. tularensis a 37 ° C con 5% de CO 2 durante aproximadamente 24 h. </li></ol> Día 2: F. líquido tularensis medios de inoculación <ol><li> Preparar y autoclave de 1 litro de cationes ajustados Mueller-Hinton (que contiene calcio 1,23 mM de dihidrato de cloruro de magnesio hexahidratado y 1,03 mM de cloruro). Cuando se enfría a 37 ° C, medio complementar aún más con el 0,1% (wt / vol) de glucosa, 0.025% (wt / vol) de pirofosfato de hierro, y el 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filtro de esterilización (0,22 μ) medio en dos alícuotas de 500 ml. </li><li> Quitar 12 ml de Mueller-Hinton complementado medio y la transferencia en una estéril de 50 ml tubo Falcon. </li><li> Utilizando una aguja estéril de 10 l asa de siembra, raspar un asa grande de F. tularensis crecimiento de las placas de agar (a partir del día 1) y las bacterias de transferencia en 12 ml de Mueller-Hinton (ver paso 2). Adición de la solución de múltiples ocasiones de ruptura de grupos y preparar la suspensión bacteriana homogénea. No vórtice. </li><li> Con una pipeta estéril, inocular cada buque de 500 ml con 5 ml de suspensión bacteriana desde el paso 3. Los cultivos de caldo a 37 ° C durante 14 a 18 h con agitación suave (190 a 200 rpm en un agitador New Brunswick Innova serie 2300). </li></ol> Día 3: lisis Spheroplasting, osmótico y la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa <ol><li> Obtener F. culturas tularensis de la incubadora de agitación y eliminar una alícuota de 1 ml de cada cultivo de 500 ml para comprobar la densidad óptica correspondiente. Hemos encontrado la extracción de la membrana y los resultados óptimos cuando se utiliza el aislamiento F. tularensis células en una fase inicial de crecimiento logarítmico, que se correlaciona con una OD 600 entre 0,2 y 0,4 (~ 07 10 hasta 08 10 UFC / ml). Culturas con un OD 600 a menos de 0,2 no dará la suficiente cantidad de material de la membrana total de gradientes de sacarosa posteriores. Por el contrario, las culturas con una OD 600 superior a 0,4 (cerca de la fase estacionaria) se ha encontrado que el rendimiento mixto membrana fusiones. </li><li> Centrifugar los cultivos a 7.500 x g durante 30 minutos a 15 ° C para recoger las células. Se recomienda la centrifugación de las culturas de cada cuatro botellas de centrífuga de 250 ml, ya que facilita la posterior suspensión de pellets. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante los medios de comunicación de cada botella de centrífuga y golpear firmemente las botellas en material absorbente para eliminar el exceso de medio de cultivo. </li><li> Dentro de la terminación de 10 minutos después de la centrifugación, suspender cada sedimento bacteriano en 8,75 ml de sacarosa 0,75 M (en 5 mM Tris, pH 7,5). Los cuatro pellets bacteriana debe ser suspendido y transferido (35 total de ml de suspensión bacteriana) a un recipiente estéril de 250 ml frasco (con una pequeña stirbar) en 10 minutos. </li><li> Mientras mezclar suavemente la suspensión celular en un stirplate, agregue lentamente 70 ml (2 volúmenes), de 10 mM EDTA disódico (en 5 mM Tris, pH 7,8) a lo largo de 10 min. Añadir la solución de EDTA con la punta de la pipeta por debajo del nivel de suspensión de células para evitar la elevación de las concentraciones locales de EDTA. El stirbar debería estar girando a una velocidad suficiente para mezclar completamente la suspensión de células, pero no lo suficientemente rápido para producir espuma o la formación de burbujas. Después de la solución de EDTA se ha añadido, se incuba la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de la incubación de 30 minutos, agregue lentamente 11 ml (volumen 1 / 10 º) de 2 mg / ml de solución de lisozima a una concentración final de 200 mg / ml. Continúe mezclando la suspensión celular durante la adición de solución de lisozima. Como se señaló anteriormente, añadir la solución de lisozima con la punta de la pipeta por debajo del nivel de células de fluido de suspensión para evitar la elevación de las concentraciones locales de la lisozima. Soluciones madre lisozima (2 mg / ml) se puede preparar en un solo uso alícuotas y almacenado a -20 ° C durante tres a cuatro meses. Incube la solución resultante durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Durante la incubación de 30 minutos, prepare un frasco de 1 litro estéril con una pequeña stirbar y 530 ml de la temperatura ambiente Cellgro molecular Grado dH 2 O (4,5 volúmenes). </li><li> Osmóticamente lisis de la suspensión celular (del paso 6) por la dilución lenta (velocidad de flujo de aproximadamente 11 ml / min) en 530 ml de Biología Molecular Grado dH 2 O (del paso 7) en el transcurso de 10 a 15 minutos con una mezcla suave. Debido al volumen de la solución más importante en este paso, aumentar la velocidad stirbar para asegurar una mezcla adecuada. El stirbar debería estar girando a una velocidad suficiente para dispersar completamente la suspensión de células, una vez añadido a la DH 2 O, pero no lo suficientemente rápido para dar lugar a formación de espuma o la formación de burbujas. Añadir la suspensión de células con la punta de la pipeta descansando en el fondo del frasco, junto a la stirbar, para facilitar la dilución uniforme del cell de la suspensión. Hemos encontrado que 25 ml pipetas funcionan mejor durante esta etapa. Que observe cuidadosamente el proceso de dilución y de interrumpir el caudal necesario para dispersar a la acumulación local de las células, grupos de células, y mechones de la célula. Incube la solución resultante durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que este paso parece ser uno de los más difíciles y críticos para el éxito global de la prueba. </li><li> Después de la incubación de 30 minutos, la transferencia de alícuotas de 40 ml de la solución de lisis osmótica en 50 ml tubos cónicos y se centrifuga a 7500 xg durante 30 min a 10 ° C para eliminar las células intactas y los escombros. </li><li> Tras la centrifugación, retire con cuidado 27 a 30 ml de sobrenadante de cada tubo cónico y sobrenadantes de la piscina en un frasco estéril de 1 litro </li><li> 25 ml de sobrenadante agrupados, cada uno, en 16 tubos de ultracentrífuga y centrifugar a 200.000 xg (44.400 rpm en F50L-8x39 rotor ultracentrífuga Fiberlite) durante 2 horas a 4 ° C. Tenga en cuenta que cada rotor con capacidad para 8 tubos, por lo que este paso requiere de dos rotores y ultracentrífugas dos. Por otra parte, el segundo conjunto de 8 tubos deben mantenerse a 4 ° C hasta que se centrifuga. </li><li> Dentro de los 10 minutos de la finalización de la ejecución de ultracentrifugación, preparar modificado buffer membrana resuspensión. Transferencia de 8 ml de tampón de suspensión de membrana (25% [p / p] sacarosa, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) a un tubo estéril y añadir 1 tableta de EDTA libre de cóctel inhibidor de la proteasa y 375 U de Benzonase. Mezclar suavemente la solución para disolver la tableta inhibidor de la proteasa. </li><li> Después de ultracentrifugación, cuidadosamente vierta sobrenadantes, invertir los tubos de ultracentrífuga con material absorbente, y golpear firmemente los tubos para eliminar el exceso de sobrenadante. Marca la ubicación de cada pastilla de membrana con un marcador para ayudar en la visualización. Resuspenda suavemente ocho pastillas de membrana de 600 l cada uno de buffer modificado la resuspensión de la membrana. La transferencia de cada resuspensión de membrana para la siguiente serie de ocho tubos, resuspender suavemente estos ocho pastillas, y la piscina resuspensiones membrana que resulta en un tubo estéril. Las membranas de pellets son difíciles de volver a suspender, por lo que seguirá pasando el buffer de resuspensión de la membrana modificada por la pastilla hasta que se desprende de la pared del tubo. A menudo es necesario utilizar la punta de la micropipeta para raspar el pellet de membrana de la pared del tubo y la ayuda en el proceso de resuspensión. Cuando pipeteo, evitar formación de espuma o la formación de burbujas. Tenga en cuenta que este paso parece ser uno de los más difíciles y críticos para el éxito global de la prueba. </li><li> Cuando los gránulos de la membrana se han resuspendido y se retira de los 16 tubos, lavar cada cuatro tubos con 600 l de buffer modificado la resuspensión de la membrana. El lavado debe centrarse en torno a la zona marcada (membrana pellet) de cada tubo. Transferencia del lavado en el tubo de la resuspensión de la membrana. Repita el paso de lavado para los restantes tres series de cuatro tubos. </li><li> Incubar la resuspensión de membrana con balanceo suave durante 30 minutos a temperatura ambiente para degradar el ADN y la ayuda en la reducción de material floculante. </li><li> Eliminar una pequeña alícuota de la suspensión de membrana y llevar a cabo la cuantificación de proteínas para determinar el rendimiento total de la membrana. Por lo general preparan sin diluir, 01:01 diluido (en el 2,5% SDS), y 1:3 diluido (en el 2,5% SDS) muestras de membrana, el calor de las muestras a 90 ° C durante 10 minutos, y el uso del ensayo BioRad DC Proteína de cuantificar la resuspensión de concentración de proteínas de membrana. Producción de proteína total es por lo general entre 1,0 mg / ml y 1,6 mg / ml. El uso del calor y la Ficha de Seguridad está obligado a liberar OMPs de las membranas extraídas de manera que un valor de la proteína cuantificación más precisa se puede obtener. </li><li> Prepare gradientes lineales de sacarosa por capas de 1,8 ml cada una de las soluciones de sacarosa (p / p, preparado en 5 mM EDTA, pH 7,5) a 14 x 95 mm tubos de ultracentrífuga ultra claro en el siguiente orden: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Capas de gradientes de sacarosa es más fácil de realizar cuando se utiliza una pipeta de bulbo, no una pipeta automática. </li><li> En base a la cuantificación de proteínas de membrana resuspensión (Paso 16), la capa de 1,5 mg de resuspensión de membrana en la parte superior de cada gradiente. Cada 14 x 95 tubo de ultracentrífuga mm tiene una capacidad máxima de 12,5 ml y, dado que el 10,8 ml se explica por las soluciones de sacarosa a partir del paso 17, no se debe cargar más de 1,7 ml de la resuspensión de la membrana por gradiente. Individualmente pesan y ajustar cuidadosamente el peso final de cada tubo de gradiente de sacarosa (añadiendo o quitando la resuspensión de membrana), de modo que todos los tubos tienen el mismo peso (± 0,01 g). </li><li> Transferencia de gradientes de sacarosa en un cubo de rotor SW-40Ti movimientos de balanceo y centrifugado a 256.000 xg (38.000 rpm) durante un mínimo de 17 horas a 4 ° C. </li></ol> Día 4: Recolección de fracciones gradiente de sacarosa <ol><li> Después de 17 h de la centrifugación, detener la ejecución de centrífuga, y retirar con cuidado gradientes de sacarosa del rotor SW-40Ti. </li><li> Limpie cuidadosamente la parte inferior del tubo de gradiente de sacarosa con 70% de etanol, la punción de laparte inferior del tubo con una aguja 21G, y recoger secuencial 500 fracciones l del gradiente en tubos de microcentrífuga estéril. Repita el procedimiento para gradientes posteriores. El gradiente se debe permitir que por goteo por gravedad, a fin de no perturbar el gradiente de sacarosa. Sin embargo, si cesa el goteo de la parte inferior del tubo de gradiente, una pequeña cantidad de presión se puede aplicar a la parte superior del tubo con el dedo. </li><li> Determinar el índice de refracción de cada fracción de gradiente de sacarosa con un refractómetro y correlacionar el índice de refracción con un peso específico en g / ml 1. Evaluar la localización de la proteína mediante la preparación de representante de las fracciones gradiente de sacarosa (incrementos de la densidad de 0,01, de 1,11 g / ml a 1,26 g / ml) para la separación SDS-PAGE, transferencia a nitrocelulosa y de inmunotransferencia. </li></ol> Resultados representante Cuando se realiza correctamente, este procedimiento resulta en la separación completa de la mensajería instantánea y las vesículas OM, tanto Tipo A (por ejemplo, SchuS4) y B (por ejemplo, LVS) de las cepas de F. tularensis. Como se muestra en immunoblots representante en la figura 1, F. OMPs tularensis localizar entre las densidades de 1,17 y 1,20 g / ml. En comparación, el PIM localizar entre las densidades de 1,13 y 1,14 g / ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Immunoblotting de F. tularensis gradientes de densidad de sacarosa. Secuencial fracciones se obtuvieron de los degradados y las densidades (g / ml) se calcula en base a índices de refracción. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE, transferidos a nitrocelulosa, y inmunoblot para detectar OMP y fraccionamiento IMP. mw, prestained estándares de peso molecular con un tamaño (en kDa) señaló en el lado izquierdo de cada mancha. LVS, lisados ​​de células enteras de F. LVS tularensis. La densidad de sacarosa correspondiente fracción de gradiente se observan por encima de sus carriles respectivos. OMPs y PIM, como se señala en el margen izquierdo, se detectaron con el antisuero policlonal monoespecífico. Resultados similares fueron obtenidos por F. tularensis SchuS4.

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Este protocolo describe una variación de la lisis spheroplasting, osmótica, y la densidad de centrifugación en gradiente de sacarosa &quot;patrón oro&quot; para la separación física y el enriquecimiento de las bacterias Gram-negativas OM de otros componentes celulares 2, 3, 4. Mientras que se ha descrito anteriormente la aplicación de este método para aislar OM de ambas cepas del tipo A y tipo B de F. tularensis 5, esta presentación ofrece un procedimiento más detallado y optimizado para el aislamiento de OM. De hecho, este es un avance importante para la identificación de potenciales de superficie expuesta y los factores de virulencia de este presunto patógeno mortal. La importancia de este procedimiento se ha demostrado en estudios realizados por nuestro laboratorio muestran que la inmunización de ratones con OMPs purificadas conceden una considerable protección contra el tipo A virulenta F. tularensis pulmonar reto 6. Como se señaló anteriormente, la fase de crecimiento de las células bacterianas, un monitoreo cuidadoso durante la lisis osmótica y la resuspensión de pellets suave membrana son pasos críticos que parecen estar en correlación con el éxito / fracaso de este procedimiento de separación por membranas. Si bien este método optimizado es riguroso y está sujeto a cierta variabilidad experimental, el resultado OM parecen ser de calidad muy mejorada en comparación con los obtenido por el uso de detergentes, cloruro de litio, carbonato de sodio o 7, 8, 9, 10, 11, 12.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Donor calf serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>35-022-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IsoVitaleX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>211876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellgro molecular grade dH2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>46-000-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>38.5 ml polycarbonate bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>010-0514</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F50L-8x39 ultracentrifuge rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>096-087051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>04693132001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzonase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>70664-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DC protein assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>500-0116</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>344060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SW-40Ti swinging bucket rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>331301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Abbe benchtop refractometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-964-10 </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for the isolation of francisella tularensis outer membranes

Francisella tularensis es un cocobacilo Gram-negativa intracelular y el agente causante de la tularemia enfermedad zoonótica. En comparación con otros patógenos bacterianos, la dosis infecciosa muy baja (&lt;10 UFC), la progresión rápida de la enfermedad, y la morbilidad y mortalidad sugieren que las cepas virulentas de Francisella codifican factores de virulencia de la novela. Superficie expuesta moléculas, las proteínas de membrana externa a saber (OMP), se ha demostrado que promover la unión de la célula huésped bacteriana, de entrada, la supervivencia intracelular, la virulencia y la evasión inmune. La relevancia para el estudio de OMPs es aún más por el hecho de que pueden servir como vacunas de protección contra una serie de enfermedades bacterianas. Mientras que OMPs se puede extraer de bacterias gram-negativas a través de técnicas de mayor extracción de la membrana, incluyendo la sonicación de las células, seguido de centrifugación y / o extracción con detergente, estas preparaciones son a menudo contaminados con periplásmico y / o citoplásmica (interior) de la membrana (IM) los contaminantes. Durante años, el &quot;patrón oro&quot; método para la separación de bioquímica y biofísica de bacterias gram-negativas de mensajería instantánea y las membranas externa (OM) ha sido el de las bacterias sometidas a lisis osmótica y spheroplasting, seguido por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Una vez en capas en un gradiente de sacarosa, la OMS puede ser separado de mensajes instantáneos basados ​​en las diferencias en la densidad de flotación, que se cree basa en gran medida de la presencia de lipopolisacárido (LPS) de la OM. Aquí se describe un método riguroso y optimizado para extraer, enriquecer y aislar F. tularensis membranas externas y sus asociados OMPs.

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Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Un protocolo para la separación de membranas internas y externas de<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Por lisis spheroplasting, osmótica y sacarosa ultracentrifugación en gradiente de densidad.

Método para el aislamiento de Francisella tularensis Membranas externas

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

17.0K vistas.  University of Texas Southwestern Medical Center. Un protocolo para la separación de membranas internas y externas de Francisella tularensis Por lisis spheroplasting, osmótica y sacarosa ultracentrifugación en gradiente de densidad.

Video: Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Investigación

Biología

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Un rápido, método escalable para el aislamiento, estudio funcional, y análisis de la matriz extracelular derivado de células

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Método estandarizado para la esterilización de alto rendimiento de semillas de Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Clasificación celular activada por fluorescencia para el aislamiento de las poblaciones celulares escleractinianas

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...