Damos las gracias al laboratorio de Jeffrey Adijanto, Banzon Tina, Li Rong, Wan Qin, Zhang Congxiao, Zhao Jing, Zhi Connie, Zia Awais,, Strunnikova Natalia miembros para ayudar en la caracterización de estos cultivos celulares. Un agradecimiento especial a Jing Zhao, Zhi Connie, y Tina Banzon por su ayuda en el mantenimiento de grandes cantidades de cultivos de células. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la Salud Programa de Investigación Intramural.

1. Tejido fetal humano Todas las investigaciones relacionadas con el tejido humano sigue los principios de la Declaración de Helsinki y de la junta de revisión institucional del NIH. Los ojos del feto se obtienen por un proxeneta independiente, recursos avanzados de Bioscience (ABR, Alameda, CA), a partir de donantes escogidos al azar entre las 16 y las 22 semanas de gestación, colocado en medio RPMI-1640 que contienen los tubos (proporcionada por la ABR), lleno de hielo, y entregados por un servicio de prioridad de entrega al día siguiente. Tejidos siguen siendo viables hasta 48 horas después de la enucleación. 2. Medio de cultivo celular MEM-alfa modificado del medio (Sigma-Aldrich) se utiliza como medio base para preparar un 5% y 15% de suero que contienen los medios de comunicación para el cultivo de células del EPR (medio de RPE, Tabla 1). <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Cantidad </td><td> Almacenamiento </td></tr><tr><td> MEM, alfa modificación </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 ml </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> N1 suplemento </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutamax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Aminoácidos no esenciales </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Taurina </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hidrocortisona </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 mg </td><td></td></tr><tr><td> Triyodo-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 mg </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovino ** suero </td><td></td><td></td><td> 5% o 15% </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Componentes de fetos humanos RPE medio de Preparación del medio de 500 ml THT * se obtiene disolviendo la taurina-hidrocortisona-triyodo-thyronin en un 1,5 ml de PBS antes de hacer la media. Alícuotas se realizan múltiples y almacenadas a -80 ° C para simplificar la preparación de cultivo del medio de cultivo. ** Suero bovino fetal no se obtuvieron de Sigma-Aldrich o Gibco. Suero fetal bovino utilizado en la preparación de los medios de comunicación se obtiene de Atlanta Biológicos (Norcross, GA). Cada frasco del suero es inactivado por calor (56 ° C durante 1 hora) antes de su uso. Para asegurar la consistencia de células de cultivo a gran cantidad de suero de un mismo lote se compran y se almacenan a -20 ° C hasta que se utilizan para la preparación de los medios de comunicación. Células escasamente semillas de un lote específico de las células hfRPE se cultivan en 24 - o 12 - y placas para un par de semanas en los medios de comunicación que contiene 20% de SFB de diferentes lotes. Las células de crecimiento más rápido melanated con la morfología RPE más clásico (adoquines), indican una gran cantidad apropiada de suero que se pueden utilizar para el cultivo celular. Medio de cultivo celular también contiene: N1 suplemento (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / ml, Glutamax / penicilina-estreptomicina 1:100 ml / ml (Gibco), y la solución de aminoácidos no esenciales (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / mL. Además, la hidrocortisona (20 mg / L), taurina (250 mg / L), y triyodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) está preparado con anticipación por la disolución de estos tres componentes en PBS a una concentración final de 1:500 (ml / ml). Alícuotas de THT se almacenan a 80 ° C hasta que añadido al medio de RPE. 3. Cultivo de células En la recepción, globos intactos se lavan en una solución de antibióticos antimicóticos (diluido 10 veces;.. Gato no 15240-096, Invitrogen) y gentamicina (1 mg / ml) durante 3 a 5 minutos (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Después de los antibióticos de incubación se enjuagan dos veces con medio como HBSS o PBS. Un globo ocular en el momento de la transferencia de 10 cm con una placa de Petri recubiertas con Sylgard-184 (IPM) y se fija con agujas 27G. Usando un cuchillo Corta a puerto lateral (Alcon) se hace una incisión en la esclerótica por debajo del cuerpo ciliar (1 / 3 de la distancia desde el ecuador del ojo de la cara anterior). Esta incisión se utiliza para iniciar un corte circular para la eliminación de la parte anterior del ojo. Este corte se realiza mediante un carburo de tungsteno-tijeras iris curvas recubierto con una hoja de sierra (FST). Antes de la eliminación de la parte anterior del ojo, se hace una incisión a través del cuerpo vítreo de evitar de separar la retina de la RPE en el polo posterior. Después de la parte anterior del ojo es removido, el polo posterior se incuba con dispasa-I solución (2 U / mL, el gato no 04942086001;.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) en el 5% de suero que contiene medio durante 40-60 minutos en 37 ° C-CO 2 al 5%. Después del tratamiento dispasa, los polos posterior se transfieren a un HBSS en placas de Petri con silicona relleno (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) y se diseca en cuadrantes o trozos más grandes para aplanar suficientemente los tejidos. A continuación, la retina se quita suavemente con unas pinzas. Una sola célula capas RPE se desprendió en las hojas y se recoge directamente en frío de tripsina-EDTA (Gibco, 25200-056 #) solución. Después de que el EPR se recogen, los tubos con los tejidos de la tripsina-EDTA se cierran y se transfieren a baño maría durante 10-15 minutos a 37 ° C. Después de 10 minutos de incubación, los tubos se agita vigorosamente para separar RPE en pequeños grupos. Si la separación no es completa, los tubos se colocan de nuevo en baño de agua durante otros 5 minutos. Después de tripsina-EDTA de incubación, los tubos son inspeccionados para posibles sin disolver grupos de células mixtas. Cualquier grupos observados se eliminan mediante vidrio de punta fina pipeta Pasteur. Después de girar hacia abajo (1,4 rpm en centrífuga clínica durante 4 minutos), las células hfRPE se volvió a suspender en los medios de comunicación del EPR el 15% y se coloca en frascos de Primaria (ejemplo: cat 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Este medio se reemplaza después de un día con el medio de RPE 5% de suero que contienen, y los cambios que se hicieron cada 2 ó 3 días. Después de 3 a 4 semanas, las células se confluentes y pigmentadas de manera uniforme. Luego se trypsinized en el 0,25% de tripsina-EDTA durante 10 a 15 minutos, volvió a suspender en un 15% de suero que contienen células RPE medio de cultivo, y sembradas en claro insertos de cultivo celular de 150 a 200 mil células por pocillo (Transwell, Corning Costar, Corning, NY), con 12 mm de diámetro se inserta, los poros de 0,4 um, las membranas de poliéster (por ejemplo: gato no 07-200-161, Fisher Scientific)... Antes de la siembra, los pozos fueron recubiertos con matriz extracelular humanos (10 mg en 150 HBSS por pocillo, el gato no 354.237,.. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y se cura con la luz UV en el capó durante 2 horas. En algunos casos, el procedimiento se repitió tripsinización por segunda vez, para recoger las células que no se haya desprendido después de la tripsina en primer lugar. El mismo protocolo (sin recubrimiento con ECM) se utilizó para cultivo de células en los frascos para generar la población P1 de las células. Estas células fueron utilizados en experimentos cuando tenían una resistencia del tejido total de ≥ 200 Ω • cm 2 y fueron uniformemente pigmentados. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Por favor, haga clic aquí para obtener una cifra mayor 1</a> . 4. Paso a paso los procedimientos <ol><li> Prepare 12 y placa con múltiples soluciones (para cada ojo cuatro pozos necesarios): <ol class="lalpha"><li> añadir 10x solución de antibióticos antimicóticos - 1 y / ojo </li><li> añadir PBS / HBSS solución de enjuague - 2 pozos / ojo </li><li> agregar la solución de dispasa - 1 y / ojo </li></ol></li><li> Prepare la disección de una placa de Petri de desembalaje 5 agujas de fijación y llenado con HBSS </li><li> Desempaquetar los ojos y los situará en antibiótico-antimicótico solución durante 3-5 minutos (preparado en el paso 1) </li><li> Lavar los ojos en dos pozos (preparado en el paso 1) con PBS / HBSS, y luego los transferirá a la disección plato. </li><li> Recorte excesivo del músculo y los tejidos conectivos que rodean el ojo </li><li> Usando agujas 27G de seguridad (pin de silicio hasta la base) los ojos en la disección de la alineación de los platos de una manera en la córnea hacia arriba. </li><li> Usando un cuchillo puerto lateral hacer incisión por debajo de la córnea, donde corte circular se iniciará </li><li> El uso de tijeras iris que cortar alrededor de los ojos, y luego con unas tijeras misma corte a través del vítreo y levantar la parte anterior del ojo de distancia. Nota: en los pasos 3-8 evitar cualquier exceso de presión mecánica a cara. </li><li> La transferencia de los ojos abiertos en la solución dispasa (preparado en el paso 1) </li><li> Incubar ocular durante 40-60 minutos a 37 º C con CO2 al 5% </li><li> Reemplace la solución HBSS en la disección de plato con uno nuevo. </li><li> La transferencia de los ojos de la solución a dispasa plato de disección. </li><li> La posición del ojo en una placa Petri (taza del globo ocular hacia arriba) y seguro con dos agujas de 27G. </li><li> Con cuidado, levante la retina separado parcialmente y con unas tijeras corte la retina retina se desprenda de el nervio óptico. Deseche retina. </li><li> El uso de tijeras iris hacer una incisión de la periferia del ojo hacia el nervio óptico. </li><li> Usando los cinco agujas 27G aplanar los ojos lo que la capa de RPE bien estirado. </li><li> Con la tijera que corta la retina circular alrededor del nervio óptico que separa la capa de RPE del apego al nervio óptico. Nota: los pasos 13-17 se puede hacer con o sin aumento bajo microscopio estereoscópico </li><li> Ajuste estereomicroscopio a la ampliación de 250xo más y encontrar el borde de la hoja de RPE cerca del nervio óptico a lo largo del corte realizado con tijeras iris. </li><li> El uso de dos pinzas de membrana separado RPE-Bruch de la capa de tejido coroideo. Se puede requerir varios intentos para encontrar la zona a lo largo de la orilla, donde la conexión del EPR y la coroides es más débil. </li><li> Hojas de RPE en lugar frío tripsina-EDTA solución en el tubo de 15 ml </li><li> Después de que el EPR se recogen, los tubos de tapa y transfiera con los tejidos de la tripsina-EDTA en baño de agua durante 15 minutos de 10 a 37 ° C. </li><li> Después de 10 minutos de incubación, agite vigorosamente tubos de 15 ml para separar RPE en pequeños grupos. Si la separación no es completa, coloque los tubos de nuevo en baño de agua durante otros 5 minutos. </li><li> Inspeccionar los tubos para posibles sin disolver grupos de células mixtas. Cualquier grupos observados se deben eliminar con punta fina pipeta Pasteur de vidrio. </li><li> Girar hacia abajo (1,4 rpm en centrífuga clínica de 4 minutos), las células hfRPE, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en un 15% los medios de comunicación del EPR (9 ml en total) </li><li> Colocar 3 ml de suspensión celular en frascos Primaria agregar 2 ml de agua dulce un 15% los medios de comunicación del EPR, un frasco lugar en la incubadora hasta el día siguiente (37 ° C, 5% de CO 2) </li></ol> 5. Resultados representante Validación funcional de cultivo celular hfRPE En experimentos anteriores que han utilizado estos cultivos primarios para determinar la expresión, la polarización y la función de las proteínas plasmáticas de transporte de membrana e identificar las vías de señalización específicas que regulan la función del EPR 1.11 Estas características a medida que se acumulan proporcionar un conjunto de validación de las propiedades que se pueden aplicar a cada generación de células. Los experimentos se resumen a continuación identificar las proteínas que determinan el transporte de fluidos transepitelial y la integridad de la vía paracelular. Estos experimentos in vitro han sido validados en un modelo animal de la retina de nuevo reinserción 6. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Localización de CFTR en las células hfRPE panel superior izquierdo:. CFTR se detectó en las células utilizando hfRPE enriquecido membrana extractos. M, marcador de peso molecular, carril 1, mayor madurez (banda C) e inmaduros (bandas A y B) del panel inferior central: la localización de inmunofluorescencia de CFTR (etiqueta verde) El panel superior derecho: vista ampliada sección transversal a través del plano z muestra.. de máxima intensidad de proyección a través del eje z. ZO-1 (etiquetado como rojo) sirve como un marcador apretado nudo de delinear las partes apical y basolateral de la RPE. DAPI (azul) etiquetas de los núcleos situados cerca de la membrana basal. ZO-1 aparece como amarillo / naranja, ya que la fluorescencia se superpone con etiqueta roja verde de CFTR. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. IFN-inducida por los cambios fisiológicos en hfRPE A:. Adición de IFN al baño basal aumentado el transporte de fluidos transepitelial (J v) a través de la monocapa de células primarias, hfRPE cultivadas J v se representa como una función del tiempo en el seguimiento de la parte superior y de líquido. absorción (apical de baño basal) se indica con valores positivos, de potencial transepitelial (TEP) y la resistencia del tejido total (R T) se representa como una función del tiempo en las huellas del fondo. B: La adición de CFTRinh-172 (5 M) en el baño basal inhibe el IFN-estimulado J aumento v. A continuación se muestra un ejemplo de experimentos realizados con modelos animales que confirma hfRPE hallazgos in vitro. En este experimento, el desprendimiento de retina artificial creada se redujo significativamente después de la adición de IFNg a la superficie del ojo exterior (Figura 4 A, B). Este efecto puede ser parcialmente bloqueada por: (1) Además de bloqueador de AMPc (Figura 4), ​​(2) completamente bloqueada después de la adición de bloqueadores de JAK AMPc +. Las imágenes a continuación se han obtenido utilizando escáner octubre <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. En experimentos in vivo desprendimiento de retina. Los procedimientos de estos experimentos in vivo han sido descritas previamente en detalle 6. En estos experimentos, los desprendimientos de retina se han creado en los ojos de ratas mediante la inyección de 0,5 a 3 l de solución de PBS modificado en el espacio subretinal (SRS), solo o con una combinación de JAK-STAT y los inhibidores de la PKA. Cada experimento tuvo un período de control inicial de 40-70 minutos después de la creación del desprendimiento de retina. Durante este tiempo, la tasa de variación del volumen de la ampolla se midió para asegurar la estabilidad de la ampolla. Tomografía de coherencia óptica de imagen (Instituto de Física Aplicada de la Academia Rusa de Ciencias, Nizhniy Novgorod, Rusia) se utilizó para medir la evolución en el tiempo del cambio de volumen en el SRS. El tiempo de la re-unión volcambio de volumen se midió por tomografía de coherencia óptica (OCT). Octubre las imágenes de cuatro experimentos diferentes (paneles de la izquierda, AD), que muestran un cambio en el tamaño de desprendimiento (flechas en A, B y D) después de la adición de IFN a la superficie anterior de 40 a 70 min. Los grupos A y B muestran que IFN Jv mayor de su tipo de control (≈ 2 l • cm 2 • h -1) a 14 y de 12 l • cm 2 • h-1, respectivamente. Tras la adición de JAK-STAT y los inhibidores de PKA (C y D), el IFN - las tasas de absorción inducido se redujo significativamente de 0,2 y 7,9 l • cm 2 • h-1, respectivamente. Las flechas indican el límite de la ampolla para la comparación con el área comprendida dentro de la línea de puntos, (volumen inicial). Lado derecho de la figura: top-panel de resumen de medir las tasas de Jv de varios experimentos, panel central, la película ( <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">clic aquí</a> ), el panel inferior-3D secciones del experimento se resumen en B. Pseudocolor en azul indica la extensión espacial de la separación en t = 0 y 40 minutos después de la adición de INFγ. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología declaración. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo de los Institutos Nacionales de Salud.

<ol>
	<li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+paradigm:+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells.">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell &#38; Melanoma Research. , .</li><li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li><li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+184:+Phototransduction:+RPE+transport+Retina+Phototransduction:+RPE+transport.">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , 2540-2540 (2010).</li><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+organs:+Building+polarized+tissue.">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li><li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium.">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li><li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+localization,+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+(JAM-C)+in+human+retinal+pigment+epithelium.">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN{gamma}+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport.">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-C+and+-D+induced+proliferation/migration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines.">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li><li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y(2)+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat.">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li><li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li><li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium.">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment,+migration,+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium:+relevance+for+proliferative+retinal+disease.">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li><li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling,+ion,+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li><li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R)-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage.">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li></ol>

En los experimentos actuales, se describen las modificaciones adicionales de nuestras técnicas previamente publicado 3 diseñado para agilizar los pasos necesarios para producir múltiples culturas consistente hfRPE primaria con un número mayor de células disponibles en cada ojo. Cada cambio en el procedimiento original fue rigurosamente probado en la fisiología de múltiples experimentos de biología molecular para asegurar que los cambios no introducir artefactos y ser probado continuamente por muchos otros laboratorios con estas células. Por último, otros experimentos se llevaron a cabo para comparar los resultados in vitro a las perturbaciones similares en modelos animales.

Instrumentos necesarios para el protocolo de disección <ol><li> Stereo Microscope - disponible con cualquier x250 magnificación de trabajo necesario para la disección </li><li> Plato de disección - por ejemplo, Kimble 100 x 20 mm # 23062 (uno por disección) de cualquier fuente </li><li> Sylgard 184 - Cat WPI. # SYLG184 * * Para preparar el plato de la disección de seguir Sylgard 184 incluye las instrucciones de mezclado, se vierte elastómero líquido mezclado en una placa de Petri para formar 5-8mm capa. Elastómero para permitir la curación de al menos 24 horas. Plato con elastómero curado pueden ser esterilizados con etanol al 70% y volver a utilizar varias veces (~ 100 veces) </li><li> 27 G agujas de BD PrecissionGlide una longitud de ¼ (5 por disección) de cualquier fuente </li><li> 1X HBSS solución que contiene calcio y sales de Mg - Cat # 14025 GIBCO 500ml (bueno para las disecciones múltiples). </li><li> Tijeras iris de carburo dentada hoja, curva - FST Cat. # 14559 a 11 (uno). </li><li> Tijeras de la retina - Katena Cat. # K4-5300 (uno). </li><li> Pinzas - por ejemplo, pinzas Dumont n º 5 con puntas pulidas de Cat WPI # 500085 (2 piezas). </li><li> Cuchillo de puerto lateral - Alcon, clareo de 1 mm, bisel doble, Cat ángulo # 8065921540. </li><li> Centrífuga 15ml tubo - (una por cada ojo) de cualquier fuente </li><li> Pipeta Pasteur - (uno por disección) de cualquier fuente </li><li> Placa de 12 pocillos (uno por disección) de cualquier fuente </li><li> Primaria 25 cm 2 frasco - (02.03 por cada ojo) de cualquier fuente </li></ol>

experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology

Hemos desarrollado un método de cultivo de células que pueden producir grandes cantidades de monocapas confluentes de primaria de fetos humanos epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) los cultivos con características morfológicas, fisiológicas y genéticas de RPE humana nativa. Estos cultivos celulares hfRPE presentan pigmentación pesados, y la microscopía electrónica muestra amplia microvellosidades membrana apical. Los complejos de unión se identificaron con el etiquetado de inmunofluorescencia de varias proteínas de las uniones estrechas. Polaridad epitelial y función de estos cultivos primarios de fácil reproducción se asemejan estudiado previamente los modelos de mamíferos de RPE nativo, incluidos los humanos. Estos resultados se extendieron por el desarrollo de intervenciones terapéuticas en modelos animales de enfermedad de los ojos humanos. Nos hemos centrado en las estrategias para la eliminación de la acumulación anormal de líquido en la retina o en el espacio subretiniano. El espacio subretiniano extracelular separa los segmentos de los fotorreceptores y externa de la membrana apical del EPR y es fundamental para el mantenimiento de los archivos adjuntos de retina y una gran cantidad de interacciones RPE / retina.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology at JoVE.com

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Ofrecemos un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células fetales humanas del epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) las células que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y la proteína y los patrones de expresión génica del tejido nativo adulto. Este trabajo se ha extendido a un modelo animal de enfermedades de los ojos de varios.

Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.2K vistas.  National Institutes of Health. Ofrecemos un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células fetales humanas del epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) las células que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y la proteína y los patrones de expresión génica del tejido nativo adulto. Este trabajo se ha extendido a un modelo animal de enfermedades de los ojos de varios.

Video: Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Investigación

Neurociencias

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Los ensayos olfativos para modelos de ratón de Enfermedades Neurodegenerativas

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Modelos Experimentales para Estudiar la Neuroprotección del Acondicionamiento Acido Contra la Isquemia Cerebral

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

A largo plazo, Cultivo Sin Suero De Explantes Organotípicos De La Retina De Ratón Con Epitelio Pigmento Retiniano Intacto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...