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Describimos un protocolo de transfección para producir células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico (CAR-NK) dirigidas a patógenos fúngicos utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente. Para evaluar la activación específica del antígeno, cocultivamos las células modificadas con tubos germinativos de Aspergillus fumigatus y medimos la secreción de IFN-γ.
Las terapias celulares basadas en receptores de antígenos quiméricos (CAR) han demostrado una eficacia impresionante en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas. Recientemente, se están desarrollando estas terapias para enfermedades infecciosas, pero los estudios dirigidos a las infecciones fúngicas siguen siendo escasos. Para identificar objetivos óptimos y optimizar los productos celulares, desarrollamos un método para diseñar células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico (CAR-NK) y evaluamos su respuesta a la estimulación por hongos. Este artículo describe un método sencillo y robusto para generar células CAR-NK adaptadas a objetivos fúngicos utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente. Las células NK-92 se transfectan con la transposasa hiperactiva SB100X vectorizada como ADN de minicírculo (MC) junto con un transposón CAR codificado por plásmido. La eficiencia de la transfección se evalúa 1 semana después mediante análisis de citometría de flujo. Antes de las pruebas funcionales, las células que expresan el transgén se enriquecen mediante clasificación celular activada magnéticamente y se cultivan durante 1 semana más. Para evaluar la activación específica del antígeno, las células modificadas se cocultivan con tubos germinativos de Aspergillus fumigatus durante al menos 6 h. Posteriormente, se mide la concentración del interferón-gamma secretado (IFN-γ) mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas.
El Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) es un hongo ubicuo, que en una persona promedio inhala entre 100 y 1.000 conidios a diario. En pacientes con inmunodeficiencias adquiridas o congénitas, como los que reciben quimioterapia o los que padecen leucemia, A. fumigatus puede provocar una apsergilosis invasiva grave. Cada año, más de 200.000 personas en todo el mundo contraen aspergilosis. A pesar del uso de antimicóticos para la prevención y el tratamiento con derivados azoles, la tasa de mortalidad se mantiene entre el 30% y el 95%2,3. Además, el tratamiento tiene efectos secundarios significativos, y el 7% de los cultivos de A. fumigatus ya son resistentes a los azoles4.
La terapia con células T modificadas con receptores de antígenos quiméricos (CAR) ha demostrado éxito clínico en el tratamiento de enfermedades malignas y ha logrado resultados preclínicos prometedores en la lucha contra enfermedades infecciosas como la aspergilosis invasiva 5,6,7,8. Nuestras células Af-CAR-T previamente descritas dirigidas a una proteína en la pared celular de las hifas de A. fumigatus han mostrado resultados prometedores en modelos preclínicos6.
La reducción del riesgo de enfermedad de injerto contra huésped, síndrome de liberación de citocinas y neurotoxicidad hacen que las células CAR-NK sean una alternativa valiosa a las células CAR-T como tratamiento "listo para usar" para las infecciones agudas9. Además, se ha demostrado que las células NK desempeñan un papel crucial en la respuesta inmunitaria antifúngica. Cuando se estimulan con A. fumigatus, las células NK secretan citocinas como IFN-ɣ y quimiocinas como CCL-3 y CCL-4 y liberan gránulos citotóxicos10,11.
La línea celular NK-92 es una fuente popular de células NK para ingeniería genética, ofreciendo la ventaja de una rápida proliferación y expansión en condiciones de cultivo relativamente simples12. Varios estudios preclínicos han demostrado el potencial terapéutico de las células NK-92 transducidas por CAR en el tratamiento de tumores hematológicos y sólidos. Se están llevando a cabo numerosos ensayos clínicos para investigar su seguridad, eficacia y posible uso como terapia celular "lista para usar"13.
Lograr altas eficiencias de transfección y una expresión estable de transgenes en células NK es un desafío. Si bien los métodos virales prometen altas eficiencias, conllevan el riesgo de mutaciones de inserción con oncogénesis posterior 9,14. La última generación de vectores de transposones de la Bella Durmiente (SB) ofrece un sistema seguro, potente y económicamente viable para la transferencia estable de genes, superando las limitaciones de los métodos de administración de genes virales y transitorios no virales15.
Por lo tanto, este protocolo describe una metodología novedosa para la generación de células Af-CAR-NK-92, que potencialmente puede servir como una opción terapéutica "lista para usar" para pacientes con aspergilosis invasiva potencialmente mortal. La eficacia de este enfoque se ejemplifica con el aumento de la producción de IFN-ɣ tras la estimulación con hifas de A. fumigatus .
Todos los experimentos descritos aquí deben realizarse en condiciones estériles. En este protocolo, mostramos dos condiciones: (I) Simulacro de transfección sin ADN que servirá como control y (II) Transfección de CAR utilizando el Af-CAR6 descrito anteriormente. El plásmido Af-CAR contiene una secuencia truncada del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRt) aguas abajo del CAR, que se utilizará como marcador de transfección (Figura suplementaria S1). Para cada condición, se requieren 4 × 106 celdas NK-92.
1. Cultivo de las células NK-92
2. Transfección no viral
3. Comprobación de la eficiencia de la transfección mediante citometría de flujo
4. Enriquecimiento de células que expresan transgenes mediante clasificación de células activadas magnéticamente (MACS)
NOTA: Para obtener resultados óptimos, inicie el protocolo con 8-10 × 106 celdas. Todas las etapas de centrifugación se realizan a 4 °C.
5. Pruebas funcionales
NOTA: Para el próximo experimento, prepare y use el siguiente medio: RPMI + 20% FBS.
Todo el proceso de generación de células Af-CAR NK-92, incluida la transfección, la recuperación, el enriquecimiento y la expansión, dura aproximadamente 14 días. Después de la transfección, las células se cultivan y se dividen cada dos días. La viabilidad celular puede disminuir durante la primera división dos días después de la transfección. Típicamente, las células se recuperan 4 días después de la transfección y comienzan a proliferar, con un tiempo de duplicación de 48 h.
Después de la recuperación, se miden las eficiencias de la transfección y se espera que alcancen el 10-20% (resultados representativos mostrados en la Figura 3). El enriquecimiento de células positivas para EGFR a través de MACS aumenta el porcentaje de células Af-CAR NK-92 a más del 95% (resultados representativos mostrados en la Figura 4).
Se utilizaron cultivos con más del 95% de células Af-CAR para ensayos funcionales. Aquí, cocultivamos las células con tubos germinativos de A. fumigatus durante 6 h y medimos la secreción de IFN-ɣ como marcador de activación. Como se muestra en la Figura 5, las células Af-CAR exhibieron una secreción significativa de citocinas (media = 340,6 ± 86,5 pg/mL) en comparación con las células Mock NK-92 (media = 75,6 ± 19,5 pg/mL), lo que indica una activación sustancialmente mayor de las células Af-CAR (valor p = 0,03).
Figura 1: Tubos germinativos de Aspergillus fumigatus. Imagen microscópica de A. fumigatus después de 16 h de incubación. Se observan tubos germinativos y pequeñas hifas que se distribuyen de manera homogénea alrededor del pocillo. Barra de escala = 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cocultivo de tubos germinales de Aspergillus fumigatus con células NK-92. Imagen microscópica del cocultivo. Las células NK-92 forman grupos y están en contacto con los tubos germinativos de A. fumigatus . Barra de escala = 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Eficiencia de la transfección evaluada por tinción para el marcador de transfección EGFR. El día 5, después de la electroporación, las células NK-92 se tiñeron con 7-AAD y anti-EGFR. Los resultados se muestran para un experimento representativo para (A) células Mock y (B) Af-CAR NK-92. La columna de la izquierda muestra diagramas de puntos del tamaño de la celda frente a la granularidad de la celda; la puerta está colocada en las celdas NK-92. Las celdas muertas se eliminan mediante el etiquetado 7-AAD (segunda columna). En la tercera columna se muestra el porcentaje de células EGFR+ vivas. Abreviaturas: EGFR = receptor del factor de crecimiento epidérmico; 7-AAD = 7-aminoactinomicina D; CAR = receptor quimérico de antígenos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados de la tinción de la superficie celular después del enriquecimiento de las células NK-92 que expresan el transgén. A la izquierda, se muestran las celdas simuladas. A la derecha, se muestran las celdas Af-CAR-NK. Los histogramas rojos representan las células sin teñir. Los histogramas azules representan las células teñidas correspondientes. La puerta se establece en las celdas EGFR+ ; Los números muestran el porcentaje de celdas positivas. Abreviaturas: EGFR = receptor del factor de crecimiento epidérmico; CAR = receptor quimérico de antígenos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Secreción de citocinas de células NK activadas por tubos germinativos de Aspergillus fumigatus . Los diagramas presentan los resultados de la secreción de IFN-ɣ de células Af-CAR y Mock en cocultivo con hongos medidos por ELISA después de 6 h de cocultivo. Los datos mostrados son la media ± DE de tres experimentos realizados de forma independiente (n = 3). Valor p calculado por la prueba t de Welch utilizando GraphPad Prism 10, * p < 0,05. Abreviaturas: NK = asesino natural; IFN-ɣ = interferón gamma; CAR = receptor quimérico de antígenos; ELISA = ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Nombre | Compañía | Concentración de existencias | Referencia | |
Transposasa | SB100X Mini Círculo | Fábrica de plásmidos | 1 μg/μL | 19 |
Transposón | Plásmido Af-CAR | Producido internamente | 1 μg/μL | 6 |
Tabla 1: ADN utilizado en este protocolo.
Figura suplementaria S1: Mapa de plásmidos del transposón Af-CAR: Esquema del vector plásmido y diseño del transposón CAR. Abreviaturas: EF1 = factor de elongación-1 promotor alfa; ORI = origen bacteriano de la replicación; LIR = repetición invertida a la izquierda; RIR: repetición invertida a la derecha; Cyto = Citoplasmático; Tm = Transmembrana. Haga clic aquí para descargar este archivo.
El protocolo proporcionado ofrece un método simple y confiable para crear células CAR-NK que se dirigen a patógenos fúngicos utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente. Este método permite la inserción estable y permanente de transgenes de gran tamaño, lo que posibilita la expansión de las células para obtener las cantidades necesarias para su posterior análisis14,16.
Varios factores clave pueden influir en el éxito de la transfección, como el número de células y la viabilidad, la fuerza y la duración del pulso, así como la calidad y cantidad del ADN17. Es crucial evaluar la salud de las células antes de comenzar, asegurando una viabilidad de al menos el 90%. Se ha demostrado que una fuerza de pulso elevada puede mejorar la eficiencia de transfección de una población celular. Sin embargo, este enfoque también puede resultar en una reducción significativa de la viabilidad celular. En casos con exceso de células y una cantidad o calidad limitada de ADN, el número de células que absorben con éxito el plásmido puede ser insuficiente17. Sin embargo, se ha demostrado que altas concentraciones de ADN son tóxicas y reducen la viabilidad celular18.
Estudios previos han logrado mayores eficiencias de transfección, pero se centraron únicamente en la expresión transitoriade proteínas 17. Por el contrario, nuestro protocolo garantiza la inserción estable del transgén. Para abordar las bajas eficiencias de transfección, implementamos el enriquecimiento de células transfectadas positivamente y logramos aproximadamente un 95% de células que expresan CAR. Sin embargo, esto aumentó el tiempo de producción a ~1 semana. Si se desean tiempos de producción más cortos, el ADN del transposón podría entregarse como un minicírculo, lo que puede mejorar la eficiencia de la transfección y puede eliminar la necesidad de la etapa de enriquecimiento19. Sin embargo, el tiempo de producción no puede reducirse a <1 semana para permitir la recuperación y proliferación celular.
Dada la naturaleza aguda de la aspergilosis invasiva, las terapias celulares "listas para usar" serían beneficiosas. Los desafíos y costos asociados con el aislamiento de las células de los pacientes y la expansión de las células primarias han aumentado la popularidad de NK-92 como una línea celular conveniente para la producción de células CAR-NK20. Las células NK-92 son generalmente robustas y proliferan rápidamente en presencia de IL-2, lo que facilita la obtención de grandes cantidades de células en un período relativamente corto. A la luz de estas ventajas, hemos desarrollado un protocolo para la ingeniería genética de células NK-92, demostrando que es posible transfectar y preparar productos celulares CAR-NK de forma segura con alta pureza. Si bien este protocolo podría adaptarse para preparar células CAR-NK primarias, se deben considerar varias modificaciones. Estos incluyen la optimización del número y la intensidad de los pulsos, la cantidad de ADN utilizada y el establecimiento de un protocolo de expansión adecuado. Cualquier modificación del protocolo requeriría una investigación exhaustiva para garantizar su eficacia. Sin embargo, nuestro protocolo proporciona una plantilla fundamental que podría adaptarse para las células NK primarias en futuros experimentos.
En resumen, este innovador protocolo de transfección para producir células Af-CAR-NK estables es un método eficiente y reproducible que puede emplearse para tratar otras enfermedades. Además, podría utilizarse como un método rentable para detectar nuevos CAR dirigidos a una variedad de antígenos.
M.H.: Inventor en solicitudes de patentes y patentes concedidas relacionadas con la tecnología CAR, licenciadas en parte a la industria. Cofundador y accionista de T-CURX GmbH, Würzburg. Ponentes honorarios: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Apoyo a la investigación: BMS. M. B. informa sobre el apoyo para viajes de la compañía farmacéutica "Eli Lilly and Company", que no está relacionado con este estudio. Los demás autores no tienen ningún conflicto de intereses.
La financiación y el apoyo al proyecto fueron proporcionados por Wilhelm Sander Stiftung, proyecto 2020.017.1 a M.H., y J.L.; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Centro de Investigación Colaborativa/Transregio 124 Hongos patógenos y su huésped humano: Redes de interacción-FungiNet; proyecto A8 a M.H. y H.E.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 ML conical bottom tubes | Greiner Bio-One | 188271 | PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERILE |
50 ML conical bottom tubes | Greiner Bio-One | 227270 | PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE |
6-and 96-Well- Cell culture plate | Corning Inc. LifeSciences | 83-3736/ 83-3474 | TC-treated Multiple Well Plates, Flat bottoms, Treated for optimal cell attachment, Sterilized by gamma irradiation, Nonpyrogenic |
7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | eady-to-use nucleic acid dye for the exclusion of nonviable cells in flow cytometric assays |
Alexa Fluor 647 anti-human EGFR Antibody | Biolegend | 352918 | Clone AY13 |
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi Biotec | 130-105-637 | UltraPure MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies |
Aspergillus fumigatus | ATCC | 46645 | |
Biosphere Filter Tips (20 and 100 μL) | Sarstedt | 70.3030.365 / 70.3030.275 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin, tested |
ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-γ | Biolegend | 430104 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | for molecular biology, 0.5 M in H2O, DNase, RNase, NICKase and protease, none detected, 0.2 μm filtered. |
FACS clean | BD Biosciences | 340345 | |
FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | |
FACS Rinse Solution | BD Bioscience | 340346 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | sterile-filtered, suitable for cell culture, heat inactivated before use |
Gibco, MEM α, nucleosides | Thermofisher Scientific | 22571020 | Phenol Red, Ribonucleosides, Deoxyribonucleosides, Sodium Bicarbonate |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | Sterile-filtered, heat inactivated before use |
Human IL-2 IS, research grade | Miltenyi Biotec | 130-097-742 | Research grade. The ED50 is ≤0.3 ng/mL, corresponding to an activity of ≥3 × 106 IU/mg. |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | from Streptomyces conglobatus, used as positive control for cytokine secretion |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | W368401 | For cell culture |
MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Columns and plungers, sterile packed |
NK-92 | DSMZ | ACC 488 | |
Neon Transfektionssystem 100 μL-Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Resuspension Buffer R, Electrolytic Buffer E2, 100 μL Neon Tips, Neon Electroporation Tubes |
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | used as positive control for cytokine secretion |
Polystyrene round-bottom tube, 5 mL | BD Bioscience | S-452400 | used for flow cytometry |
Reaction tube, 1.5 ML | Greiner Bio-One | 7,26,90,001 | PP, transparent, cap attached, with injected graduation. Sterilized before use. |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 72400021 | GlutaMax I, Phenol Red, HEPES, Sterile-filtered |
TipOne 1000 μL XL Graduated Filter Tip | StarLab | S1122-1730 | |
Equipment | |||
BD FACSCalibur | BD Bioscience | ||
CO2 Incubator C60 | Labotect | ||
Heraeus Multifuge 3SR | Thermo Scientific | ||
HydroFLEX microplate washer | Tecan | ||
NanoQuant Infinite M200 Pro | Tecan | ||
Neon Transfection System | Invitrogen | ||
Pipettes | Eppendorf | ||
Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec |
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