Mantenimiento en cautiverio y extracción de veneno de Tityus serrulatus (escorpión amarillo brasileño) para la producción de antídotos

Aquí, presentamos protocolos exitosos de mantenimiento y extracción de veneno para la cría a gran escala de Tityus serrulatus Lutz y Mello, 1922 (escorpión amarillo brasileño), con el objetivo de proporcionar veneno para la posterior producción de antídotos de escorpión para satisfacer la demanda del sistema de salud brasileño.

El envenenamiento por escorpión es un problema de salud pública en varios países tropicales y subtropicales. Tityus serrulatus Lutz y Mello, 1922 (escorpión amarillo brasileño) son responsables de aproximadamente 150.000 casos de envenenamiento por año en Brasil, de los cuales el 10% requiere tratamiento antiofídico para revertir los efectos del veneno potencialmente mortales. Por lo tanto, miles de individuos de T. serrulatus se mantienen en condiciones de cautiverio controlado para la extracción de veneno, posteriormente utilizados en la producción del suministro nacional de antídoto para escorpiones. El Instituto Butantan es el principal laboratorio de fabricación de antídotos de Brasil, suministrando cerca de 70.000 viales de antídoto de escorpión para el sistema de salud brasileño. Por lo tanto, los protocolos de cría y las metodologías de extracción de veneno son puntos clave para el éxito de la producción de veneno estandarizada a gran escala. El objetivo de este artículo es describir los protocolos de cautiverio de la cría de T. serrulatus , abarcando la rutina de cría y los procedimientos de extracción del veneno, siguiendo las buenas prácticas de manufactura y asegurando el bienestar animal. Estas prácticas permiten mantener hasta 20.000 animales en cautiverio, con una rutina de 3.000 a 5.000 alacranes ordeñados mensualmente de acuerdo a la demanda de fabricación de antivenenos, logrando un promedio de 90% de extracción positiva.

Los escorpiones son artrópodos pertenecientes a la clase Arachnida, orden Scorpiones, que comprende aproximadamente 2.621 especies ^1,2. Estos animales tienen una amplia distribución geográfica y están presentes en todos los continentes excepto en la Antártida¹. El envenenamiento causado por escorpiones provoca la morbilidad o muerte de miles de personas cada año en todo el mundo³. En 2019, se estimó que hubo más de 1,2 millones de accidentes y 3.500 muertes anuales causadas por estos animales. En Brasil, el número de casos ha aumentado exponencialmente, llegando a más de 100.000 casos por año desde 2017 ^4,5,6. La urbanización descontrolada observada en Brasil en las últimas décadas, sin un adecuado tratamiento de las aguas residuales y una recolección y disposición regular de la basura, asociada a la degradación ambiental y a los cambios climáticos, ha creado condiciones para la proliferación de escorpiones invasores, como T. serrulatus, aumentando el contacto con los humanos y, por lo tanto, resultando en accidentes nocivos ^4,7,8. Existen alrededor de 178 especies de escorpiones en Brasil, pero las picaduras de importancia médica son causadas por el género Tityus, siendo cuatro especies (T. serrulatus, T. bahiensis, T. stigmurus y T. obscurus) de preocupación médica, siendo Tityus serrulatus responsable de los casos más graves y de las muertes ^7,9.

El Instituto Butantan es el principal laboratorio de fabricación de antídotos de Brasil, suministrando aproximadamente 70.000 viales de antídoto de escorpión para el sistema de salud brasileño. Brevemente, los pasos involucrados en la fabricación de antídotos incluyen la inoculación de antígenos derivados del veneno en equinos, la recolección y purificación de plasma rico en anticuerpos, lo que da como resultado viales de 5 ml de antídoto de escorpión. Cada vial es capaz de neutralizar, al menos, 1 mg de veneno de escorpión por ml de antídoto. El Bioterio de Artrópodos es una parte integral del centro industrial, responsable de suministrar el material de partida para el antídoto del escorpión.

El Bioterio de Artrópodos del Instituto Butantan se denominó originalmente Laboratorio de Artrópodos y fue creado en 1967. Sin embargo, no fue hasta 1995 que el Laboratorio se trasladó a una instalación exclusiva dedicada al alojamiento de artrópodos venenosos^10,11. En ese momento, los escorpiones se mantenían en una sala de 12^m2 sin temperatura controlada y se distribuían en aproximadamente 13 recintos, cada uno de los cuales albergaba un máximo de 300 animales¹⁰. Debido a la creciente demanda de veneno a lo largo de los años y la consiguiente necesidad de aumentar el número de animales, junto con las mejoras en el proceso de extracción del veneno, en 2016 se produjo un cambio importante. El Laboratorio se integró en el centro industrial del Instituto Butantan y pasó a llamarse Bioterio de Artrópodos. Además, en 2016, el Bioterium se trasladó a una nueva instalación especialmente diseñada. La nueva sala de escorpiones tiene una superficie de 24^m2 y contiene aproximadamente 48 recintos de polipropileno, cada uno de los cuales alberga hasta 300 animales, como se muestra en la Figura 1. Esto da como resultado un total de 10.000 a 20.000 individuos que se mantienen en condiciones controladas de cautiverio, con variaciones a lo largo del año. Los escorpiones son cuidadosamente manejados bajo estrictos protocolos de cría para garantizar su bienestar mientras satisfacen las altas demandas de producción y se adhieren a las buenas prácticas y estándares éticos para el cuidado de los animales. Para la extracción del veneno, se diseñó y construyó una sala específica, que alberga dos gabinetes de flujo de aire como se muestra en la Figura 2A. Estos gabinetes sirven como medidas de seguridad para evitar que los técnicos inhalen partículas de veneno durante el procedimiento de extracción. Los equipos de protección individual (EPI) son obligatorios para los técnicos, incluidos los delantales sintéticos y las mascarillas FFP2, para evitar cualquier contaminación y garantizar su seguridad.

Figura 1: Vista general de la sala del escorpión del Bioterio de Artrópodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Área de trabajo . (A) Vista general de la sala de extracción de veneno del Bioterio de Artrópodos. (B) Superficie de trabajo del gabinete de flujo de aire. Todos los materiales y equipos están preparados y dispuestos en la parte superior de la superficie de trabajo del gabinete de flujo de aire. La flecha negra indica el dispositivo electroestimulador y la flecha roja indica las pinzas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Alrededor del 90% de los escorpiones de T. serrulatus en el Bioterio de Artrópodos provienen de diferentes sitios, recolectados por agentes de salud municipales como parte de un programa de vigilancia y control de estos animales. Los escorpiones son capturados en áreas urbanas y luego enviados al Instituto Butantan como parte de un programa de colaboración. Los escorpiones de T. serrulatus son partenogenéticos, lo que significa que el nacimiento ocurre como consecuencia del desarrollo de la descendencia a partir de huevos no fertilizados, sin la presencia de un individuo del sexo opuesto¹². Debido a este tipo de reproducción, algunos animales nacen en cautividad en nuestras instalaciones y se mantienen hasta que alcanzan la fase adulta, siguiendo un protocolo de cría similar al que se describe a continuación. Una vez que alcanzan la etapa adulta, se agregan a la rutina de extracción de veneno. A su llegada, los escorpiones se someten a un cribado inicial, y los que se encuentran en buenas condiciones de salud son mantenidos en recintos colectivos que contienen un máximo de 350 individuos, divididos por su procedencia. Para cada recinto, se rellena diariamente un formulario de control en el que se proporcionan datos sobre la fecha de alimentación y el tipo de presa ofrecida (grillo o cucaracha), el suministro de agua, los procedimientos de limpieza, el número de animales muertos y el número de animales vivos que quedan dentro del recinto.

En una agenda programada previamente, los animales se someten a estimulación eléctrica y el veneno resultante de cientos de individuos se liofiliza, lo que da como resultado lotes de veneno liofilizado. El veneno estandarizado obtenido de este proceso se destina a la inmunización de caballos como parte del proceso de fabricación, así como a proporcionar material de referencia para el control de calidad de la sustancia activa y del producto final.

Existen muy pocas instalaciones en el mundo capaces de mantener un número tan grande de escorpiones y realizar el volumen de extracciones de veneno de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación y el uso ético de los animales, como se hace en el Bioterio de Artrópodos del Instituto Butantan. Por lo tanto, nuestro objetivo es describir los protocolos de mantenimiento del escorpión y los procedimientos de extracción de veneno utilizados en la cría de T. serrulatus , que proporcionan con éxito la cantidad necesaria de veneno para la producción del antídoto del escorpión.

Los protocolos que involucran animales invertebrados están exentos de la aprobación del Comité de Uso y Cuidado de Animales del Instituto Butantan. Sin embargo, el mantenimiento de los escorpiones aquí descritos sigue parámetros éticos, y se respeta el bienestar animal de acuerdo con las necesidades de la especie.

1. Vivienda

1. Mantener los alacranes en contenedores comunales de polipropileno a modo de recintos (altura 35 cm, ancho 35,5 cm, largo 72 cm) que contengan un máximo de 350 animales.
2. Mantener la sala donde se alojan los recintos de los animales a una temperatura controlada de 24 °C (±0,5 °C) en un ciclo de luz de 10 h con las luces encendidas y 14 h con las luces apagadas.
3. Cubra el piso del recinto (parte inferior) de cada recipiente con papel kraft fijado con cinta adhesiva en los bordes de todos los lados para que los animales no puedan meterse debajo del papel (Figura 3A).
4. Utilice cuatro bandejas de cartón (bandejas de huevos) como sustratos verticales, apiladas en un lado del recipiente, con una hoja de cartón rígido colocada entre cada bandeja (Figura 3B, C).
5. Coloque una bandeja de polipropileno poco profunda (bandeja de agua) en el lado opuesto del recinto, que contenga algodón empapado como fuente de agua para los animales (Figura 3B).
6. Mantenga los recipientes sin tapa para aumentar el flujo de aire. Coloque una tira de aproximadamente 10 cm de cinta plástica autoadhesiva en la parte superior de la superficie interna del recinto y en las esquinas superiores para que las paredes sean lo suficientemente lisas como para evitar que los animales se escapen del contenedor (Figura 3A).

Figura 3: Preparación de la carcasa y la carcasa . (A) Las flechas indican el papel kraft en la parte inferior, fijado con cinta adhesiva en los bordes. Las líneas punteadas indican la cinta plástica autoadhesiva colocada en la parte superior de la superficie interna de la carcasa. (B) Sustrato vertical (bandejas de huevos apiladas en un lado del recipiente) y una bandeja de polipropileno poco profunda (bandeja de agua) colocada en el lado opuesto. (C) Detalle de sustrato vertical: bandejas de huevos con una hoja de cartón rígido entre dos bandejas. (D) Hojas de cartón y bandejas de huevos colocadas en capas, simulando el hábitat natural oscuro y húmedo de T. serrulatus . (E) Animales acomodados en el sustrato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Rutina de higiene

NOTA: La rutina de higiene se divide en dos procedimientos de mantenimiento: mantenimiento completo y parcial. La primera se realiza 2 días después de alimentar a los animales o cuando se selecciona el recinto para la extracción del veneno. El mantenimiento parcial se realiza cuando los animales no están alimentados.

1. Mantenimiento completo
   1. Prepare un recinto limpio con sustrato nuevo (bandejas de huevos, cartón y papel kraft) y una bandeja de agua limpia, como se describe en la sección 1.
   2. Utilizando pinzas largas, retire la bandeja de agua del recinto. Si hay escorpiones en la bandeja de agua, retírelos y colóquelos en el recinto limpio.
   3. Repita el mismo procedimiento descrito en el paso 2.1.2 con todas las bandejas de huevos y láminas de cartón, retirando todos los escorpiones y colocándolos en el recinto limpio.
   4. Después de retirar las bandejas, retire todos los escorpiones que queden en el suelo del recinto y colóquelos en el recinto limpio. Asegúrese de tener en cuenta los cadáveres y desecharlos adecuadamente. Recoja todas las presas vivas restantes (insectos) y retírelas del recinto.
   5. Retire todos los sustratos desechables del recinto (bandejas de huevos, lámina de cartón y papel kraft) y deséchelos adecuadamente. Envíe los artículos reutilizables (bandeja de agua y contenedor de polipropileno) para su saneamiento.
      NOTA: La higienización de los artículos reutilizables se realiza con hipoclorito al 0,5% combinado con un detergente neutro. Es obligatorio que los materiales se enjuaguen a fondo y abundantemente con agua corriente después de usar cualquier producto o solución de saneamiento.
2. Mantenimiento parcial
   NOTA: El mantenimiento parcial consiste en inspeccionar todos los sustratos (bandejas de huevos y papel kraft) con el objetivo de eliminar cadáveres de escorpiones muertos y otros restos indeseables, pero sin desechar los sustratos ni cambiar el recinto.
   1. Realice la inspección con pinzas largas para levantar suavemente cada bandeja de huevos y eliminar los desechos.
   2. Si es necesario, reemplace una o más bandejas de huevos por una limpia.
   3. Reemplace completamente la bandeja de agua por una limpia con pinzas largas. Transfiera los escorpiones en la bandeja de agua a la bandeja de huevos en otra parte del recinto.

3. Alimentación

1. Alimentar a los animales cada 15 días de acuerdo con el programa de extracción de veneno. Alimente a los animales que serán ordeñados 7 días antes y 7 días después de la extracción del veneno.
2. Para la alimentación, suministre cucarachas (Phoetalia pallida) y grillos (Gryllus sp.) alternativamente.
3. Calcular la cantidad de alimento en función de la ingesta energética de los animales; Ofrece 1 presa por cada 3 o 5 escorpiones en el recinto.
4. Cuente la cantidad calculada de presas y colóquelas vivas dentro del recinto, dejándolas durante 2 días antes del mantenimiento completo (sección 2.1).
5. Cuando ofrezcas cucarachas, aplica una solución de carbonato de calcio con alcohol alrededor de la parte superior de los recintos. La solución hace que las cucarachas resbalen y no puedan trepar por la superficie lateral del recinto, evitando así que los insectos se escapen.

4. Extracción de veneno

NOTA: Los animales utilizados en la rutina de extracción de veneno son adultos o preadultos. Debido a la dificultad para determinar la madurez sexual completa del escorpión amarillo brasileño (fase adulta), se determinó que los animales con una longitud corporal total de 5 a 7 cm son elegibles para el procedimiento.

1. Ordeña cada animal cada 2-3 meses.
2. El día de la extracción del veneno, cuente todos los animales vivos en el recinto y transfiéralos a un recipiente de vidrio utilizando pinzas largas (Figura 4).
3. Prepare y organice todos los materiales y equipos que se utilizarán en la parte superior de la superficie de trabajo del gabinete de flujo de aire. Enchufe el cable de alimentación del electroestimulador en el tomacorriente y encienda el electroestimulador y el gabinete de flujo de aire (Figura 2B).
   1. Utilice los siguientes ajustes de los parámetros del electroestimulador: potencial (diferencia del potencial entre los electrodos): 540 mV, estrés (duración del pulso eléctrico): 2 ms, acción (intermitencia para moderar la potencia utilizada, lo que reduciría el calentamiento del tejido orgánico de Telson): 70%, ciclo (ajustar la repetición cíclica): 1 s, e intensidad (corriente eléctrica que circula por el músculo del animal): 0,75 mA.
4. Sujete manualmente a cada animal de manera que el telson se quede quieto, siguiendo los pasos:
   1. Sujete el metassoma del animal con pinzas rectas (Figura 5A).
   2. Inmovilizar el telson con pinzas curvas (Figura 5B).
   3. Sujete el telson con la mano (Figura 5C, D).
5. Después de la sujeción, coloque el telson en contacto directo con el conductor del electroestimulador, sin necesidad de utilizar una solución conductora. La descarga eléctrica provoca una contracción muscular involuntaria de la glándula venenosa y la consiguiente eyección del veneno.
6. Recoja las gotas de veneno directamente en un microtubo de plástico colocado cerca del conductor del electroestimulador (Figura 6).
7. A continuación, suelta al animal de nuevo en el recipiente de vidrio, siguiendo los pasos:
   1. Transfiera el telson del animal de la mano a las pinzas curvas.
   2. Coloque al animal suavemente en el fondo del recipiente de vidrio.
8. Realice los pasos 4.4-4.7 con cada animal en el recipiente de vidrio.
9. Después de que todos los animales en el recipiente de vidrio hayan sido ordeñados, colóquelos nuevamente en el recinto.
10. Almacenar el veneno recogido a -20 °C hasta el proceso de liofilización.

Figura 4: Escorpiones en el recipiente de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Procedimiento de restricción para la extracción del veneno. (A) Metassoma sujeto con pinzas rectas (flecha negra). (B) Telson inmovilizado con pinzas curvas (flecha negra). (C) Transferencia del telson restringido de las pinzas a la mano. (D) Telson sujetado por la mano. Se recomienda que los animales sean manipulados con las manos desnudas ya que al utilizar guantes, los escorpiones pueden agarrar el material con sus garras, dificultando su liberación al final del procedimiento y aumentando considerablemente el riesgo de accidentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Extracción del veneno. Un microtubo de plástico (flecha blanca) colocado cerca del electroestimulador (flecha amarilla). Las gotas de veneno se recogen directamente en el tubo que se mantiene a temperatura ambiente durante el procedimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se desarrollaron treinta procedimientos operativos estándar (SOP) para cada procedimiento, asegurando la repetibilidad de los procedimientos entre los técnicos y el cumplimiento de los parámetros de calidad. La tasa de mortalidad promedio después del procedimiento de extracción es de alrededor del 12%, lo que puede considerarse bajo, considerando la rutina de electroestimulación y el ambiente de cautiverio, donde los factores de estrés se reducen con éxito mediante la aplicación de los procedimientos.

Para mantener a los animales sanos, se coloca una bandeja cubierta con algodón y agua en un extremo de la caja, mientras que las láminas de cartón y las bandejas de huevos se colocan en capas en el lado opuesto, simulando el hábitat natural oscuro y húmedo de T. serrulatus (Figura 3D,E). El sustrato descrito ha demostrado ser eficaz para mantener a un gran número de animales en un espacio confinado, proporcionando suficiente refugio y espacio, asegurando así su bienestar.

Anualmente, la producción de veneno de T. serrulatus supera la cantidad de 80 gramos de veneno líquido, lo que corresponde a más de 13 gramos de veneno liofilizado. Hemos estado recopilando indicadores de producción, como el promedio de veneno ordeñado por animal, el número de animales y la cantidad de veneno obtenida por mes, como se muestra comparativamente en la Tabla 1, Figura 7, Figura 8 y Figura 9. Los tres gráficos muestran una línea de tendencia positiva, lo que indica un coeficiente de correlación de Pearson positivo (respectivamente R= 0,68; R= 0,84; y R= 0,74). Alrededor de 3.000 a 5.000 escorpiones son ordeñados mensualmente de acuerdo con la demanda de fabricación de antídotos, con un promedio del 90% de extracciones positivas. La mayoría de los animales son sometidos a más de cinco procedimientos de extracción de veneno durante su vida productiva en la instalación, lo que refleja la longevidad de los animales, la baja morbilidad o daño de las glándulas venenosas y la baja tasa de mortalidad. Es importante señalar que hay una disminución en la cantidad de veneno obtenido de los alacranes que han sido extraídos más veces, pero siguen siendo productivos.

Figura 7: Comparación mensual del veneno liofilizado extraído por animal (2012-2022). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Comparación del veneno liofilizado extraído por mes (2012-2022) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Comparación del número de escorpiones extraídos por mes (2012-2022). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación de indicadores de producción (2012-2022).

La aplicación de los métodos descritos nos permite mantener un gran número de individuos de T. serrulatus y nos da una predicción consistente del número de escorpiones necesarios para la producción anual de veneno. De esta manera, podemos proporcionar suficientes lotes de veneno por adelantado para abastecer el proceso de fabricación de antídotos. Al mismo tiempo, el desarrollo de cronogramas preestablecidos para el mantenimiento, la alimentación y la extracción de veneno es una parte esencial de las actividades y ayuda a cumplir con los protocolos descritos. Por lo tanto, el establecimiento de una rutina es obligatorio para mantener una producción continua.

Hasta donde saben los autores, no existen protocolos descritos científicamente con respecto a la cría en cautiverio de escorpiones con el objetivo de producir veneno. Por lo tanto, el desarrollo y la aplicación de los métodos descritos tienen como objetivo presentar un protocolo eficiente y exitoso para lograr números de producción elevados, como se presenta en este artículo. El protocolo para la extracción de veneno que aquí se presenta difiere de otras metodologías descritas anteriormente, ya que fue desarrollado con el objetivo de simplificar al máximo el procedimiento, debido a la necesidad de obtener grandes volúmenes de veneno. Por lo tanto, el método presentado permite extraer un gran número de animales en un corto período de tiempo, obteniendo así un volumen sustancial de veneno necesario para la producción de antídotos. Es importante destacar que los técnicos involucrados en el manejo de los animales durante el procedimiento de extracción del veneno están rigurosamente capacitados.

Los gráficos ilustran los datos presentados en la Tabla 1, mostrando que de 2012 a 2022 hubo un crecimiento lineal en los marcadores presentados debido a la fuerte relación entre el año y el veneno liofilizado extraído por animal, el veneno liofilizado extraído por mes y los alacranes extraídos por mes, respectivamente. El veneno liofilizado extraído por animal mostró un pequeño aumento a lo largo de los años, pero la cantidad de veneno por mes y el número de escorpiones extraídos aumentaron notablemente a partir de 2016, lo que refleja las mejoras físicas en la instalación y el desarrollo y aplicación de los POE. Ambos marcadores de producción disminuyeron en 2020 debido a la pandemia de COVID, pero volvieron a aumentar al año siguiente.

Otro objetivo esencial que se cumplió con la aplicación de la metodología descrita fue el bienestar animal. Los protocolos se desarrollaron teniendo en cuenta la biología de T. serrulatus, las necesidades de la especie en condiciones de cautiverio y en una rutina de producción de veneno, que difiere de sus necesidades en vida libre ^5,12. Los resultados positivos de la metodología, además del éxito en mantener de forma estandarizada un alto número de animales, respetando el bienestar de los escorpiones y satisfaciendo la demanda de producción de veneno, se muestran en la larga vida útil de los animales, muchos de los cuales pasan por más de cinco procedimientos de extracción de veneno durante su vida productiva en las condiciones de cautiverio descritas.

Independientemente de los protocolos a utilizar, la formación continua de los técnicos implicados en la cría del escorpión o en la extracción del veneno es sumamente importante para reducir el estrés causado a los animales debido a la rutina de cautiverio y en consecuencia mejorar los parámetros de producción. El entrenamiento constante también es esencial para reducir el riesgo potencial de accidentes que involucren al personal durante la manipulación de los escorpiones.

Los protocolos de manejo aquí descritos se desarrollaron de acuerdo con la necesidad de mantener un gran número de individuos de T. serrulatus en un espacio limitado, y para ello, la biología y fisiología de la especie fueron de gran importancia. Además de la especificidad de las especies que se mantienen, los mismos protocolos pueden ser replicados para varios otros géneros y especies de escorpiones, con pequeños ajustes. Los materiales utilizados son de fácil acceso y económicos, lo que hace viable el mantenimiento en el caso de la ganadería a gran escala como se presenta. En cuanto a los protocolos de extracción de veneno, el electroestimulador utilizado fue especialmente diseñado y puede ser replicado por otros laboratorios de fabricación de antídotos.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Ninguno