Formulación y caracterización de nanodiscos que contienen agentes bioactivos

Aquí, describimos la producción y caracterización de agentes bioactivos que contienen nanodiscos. Los nanodiscos de anfotericina B se toman como ejemplo para describir el protocolo de manera gradual.

El término nanodisco se refiere a un tipo discreto de nanopartícula compuesta por un lípido formador de bicapa, una proteína de andamio y un agente bioactivo integrado. Los nanodiscos están organizados como una bicapa lipídica en forma de disco cuyo perímetro está circunscrito por la proteína del andamio, generalmente un miembro de la familia de apolipoproteínas intercambiables. Numerosos agentes bioactivos hidrófobos se han solubilizado eficientemente en nanodiscos mediante su integración en el medio hidrofóbico de la bicapa lipídica de la partícula, produciendo una población en gran medida homogénea de partículas en el rango de 10-20 nm de diámetro. La formulación de nanodiscos requiere una proporción precisa de componentes individuales, una adición secuencial apropiada de cada componente, seguida de la sonicación en baño de la mezcla de formulación. La proteína del andamio anfipático contacta y reorganiza espontáneamente la bicapa dispersa formando una mezcla de lípidos / agentes bioactivos para formar una población discreta y homogénea de partículas de nanodiscos. Durante este proceso, la mezcla de reacción pasa de una apariencia opaca y turbia a una muestra clarificada que, cuando está completamente optimizada, no produce precipitado tras la centrifugación. Los estudios de caracterización implican la determinación de la eficiencia de solubilización del agente bioactivo, microscopía electrónica, cromatografía de filtración en gel, espectroscopia de absorbancia ultravioleta visible (UV / Vis) y / o espectroscopia de fluorescencia. Esto normalmente es seguido por una investigación de la actividad biológica utilizando células cultivadas o ratones. En el caso de los nanodiscos que albergan un antibiótico (es decir, el antibiótico polieno macrólido anfotericina B), se puede medir su capacidad para inhibir el crecimiento de levaduras u hongos en función de la concentración o el tiempo. La relativa facilidad de formulación, versatilidad con respecto a las partes componentes, tamaño de partícula a nanoescala, estabilidad inherente y solubilidad acuosa permite innumerables aplicaciones in vitro e in vivo de la tecnología de nanodiscos. En el presente artículo, describimos una metodología general para formular y caracterizar nanodiscos que contienen anfotericina B como agente bioactivo hidrófobo.

Las lipoproteínas discoidales de alta densidad (HDL) nacientes son progenitores naturales del HDL esférico mucho más abundante presente en el sistema circulatorio humano. Estas partículas nacientes, también denominadas pre-ß HDL, poseen propiedades estructurales únicas y distintivas¹. De hecho, en lugar de existir como una partícula esferoidal, las HDL nacientes tienen forma de disco. Extensos estudios de caracterización estructural en HDL discoidales naturales y reconstituidas han revelado que están compuestas por una bicapa de fosfolípidos cuyo perímetro está circunscrito por una apolipoproteína anfipática intercambiable (apo), como apoA-I. En el metabolismo de las lipoproteínas humanas, las HDL nacientes circulantes acumulan lípidos de las células periféricas y maduran en HDL esféricas en un proceso que depende de mediadores de proteínas clave, incluido el transportador de casete de unión a ATP A1 y la lecitina: aciltransfersa^{de colesterol 2}. Este proceso representa un componente crítico de la vía de transporte inverso del colesterol que se considera protector contra las enfermedades del corazón. Armados con este conocimiento y la capacidad de reconstituir HDL discoidales, los investigadores han empleado estas partículas como una intervención terapéutica para tratar la aterosclerosis³. En esencia, la infusión de HDL reconstituido (rHDL) en pacientes promueve el flujo de colesterol de los depósitos de placa y lo devuelve al hígado para su conversión en ácidos biliares y excreción del cuerpo. Varias empresas biotecnológicas/farmacéuticas están aplicando esta estrategia de tratamiento⁴.

Al mismo tiempo, la capacidad de generar estas partículas en el laboratorio ha provocado una ráfaga de actividades de investigación que ha llevado a nuevas aplicaciones y nuevas tecnologías. Una aplicación destacada implica el uso de partículas de rHDL como una membrana en miniatura para albergar proteínas transmembrana en un ambiente nativo⁵. Hasta la fecha, cientos de proteínas se han incorporado con éxito en la rHDL discoidal, y la investigación ha demostrado que estas proteínas conservan tanto la conformación nativa como la actividad biológica como receptores, enzimas, transportadores, etc. Estas partículas, denominadas "nanodiscos", también han demostrado ser susceptibles de caracterización estructural, a menudo a alta resolución⁶. Este enfoque para las investigaciones de proteínas transmembrana se reconoce como superior a los estudios con micelas detergentes o liposomas y, como resultado, está avanzando rápidamente. Es importante reconocer que se han reportado dos métodos distintos que son capaces de formar una rHDL. El método de "diálisis de colato"¹³ es popular para aplicaciones relacionadas con la incorporación de proteínas transmembrana en la bicapa⁵ de rHDL. Esencialmente, este método de formulación implica mezclar una bicapa formando fosfolípido, una proteína de andamio y la proteína transmembrana de interés en un tampón que contiene el detergente colato de sodio (o desoxicolato de sodio; peso molecular de micela [MW] de 4.200 Da). El detergente solubiliza eficazmente los diferentes componentes de la reacción, permitiendo que la muestra se dialice contra el tampón que carece de detergente. Durante el paso de diálisis, a medida que se retira el detergente de la muestra, se forma espontáneamente una rHDL. Cuando este enfoque se utiliza para atrapar una proteína transmembrana de interés, las partículas del producto se han denominado nanodiscos⁵. Sin embargo, los intentos de utilizar este método para incorporar agentes bioactivos hidrófobos de moléculas pequeñas (MW <1.000 Da) han sido en gran medida infructuosos. A diferencia de las proteínas transmembrana, los agentes bioactivos de moléculas pequeñas pueden escapar de la bolsa de diálisis junto con el detergente, disminuyendo en gran medida su eficiencia de incorporación en las rHDL. Este problema se resolvió omitiendo detergentes de la mezcla de formulación¹⁴. En cambio, los componentes se agregan a un tampón acuoso secuencialmente, comenzando con la bicapa formando lípidos, formando un agente bioactivo estable que contiene rHDL, denominado nanodisco. Otros han utilizado la rHDL para la incorporación y transporte de agentes de imagen in vivo ⁷. Más recientemente, se han empleado en estudios de unión de ligandos rHDL especializados compuestos por un andamio de apolipoproteína y el glicerofosfolípido aniónico, cardiolipina. Estas partículas proporcionan una plataforma para estudios de la interacción de la cardiolipina con varios ligandos solubles en agua, incluyendo calcio, citocromo c y el agente anticancerígeno doxorrubicina⁸.

El presente estudio se centra en la formulación de rHDL que poseen un agente bioactivo hidrofóbico incorporado de manera estable (es decir, nanodisco). La capacidad de estos agentes para integrarse en el medio lipídico de las partículas discoidales de rHDL les confiere efectivamente solubilidad acuosa. Como tal, los nanodiscos tienen el potencial para aplicaciones terapéuticas in vivo . Al formular nanodiscos, se requieren condiciones específicas de incubación / reacción para incorporar con éxito agentes bioactivos hidrófobos discretos en la partícula del producto, y el objetivo de este informe es proporcionar información práctica detallada que pueda usarse como plantilla fundamental para crear nuevas partículas de nanodiscos para aplicaciones específicas. Por lo tanto, en el contexto de este manuscrito los términos nanodisco y nanodisco no son intercambiables. Mientras que nanodisco se refiere a un rHDL formulado para contener una proteína transmembrana incrustada en su bicapa lipídica⁵, el término nanodisco se refiere a un rHDL formulado para incorporar agentes bioactivos hidrófobos de bajo peso molecular (< 1.000 Da), como la anfotericina B¹⁴.

Una variedad de métodos están disponibles para la adquisición de proteínas de andamio adecuadas. Es posible comprar proteínas de andamio de fabricantes [por ejemplo, apoA-I (SRP4693) o apoE4 (A3234)], sin embargo, el costo puede ser un factor limitante. Un enfoque preferido es expresar proteínas de andamio recombinantes en Escherichia coli. Se publican protocolos para la apoA-I⁹ humana, apoE4¹⁰, así como para la proteína hemolinfática del insecto apolipoforina-III¹¹. Para los experimentos descritos en la presente invención, se utilizó el dominio N-terminal (NT) apoE4 humano recombinante (aminoácidos 1-183). La secuencia de nucleótidos que codifica apoE4-NT humano se sintetizó y se insertó en un vector de expresión pET-22b (+) directamente adyacente a la secuencia líder pelB codificada por vectores. Esta construcción conduce a la expresión de una proteína de fusión pelB leader sequence-apoE4-NT. Después de la síntesis de proteínas, la secuencia líder bacteriana pelB dirige la proteína recién sintetizada al espacio periplásmico donde la peptidasa líder escinde la secuencia pelB. La proteína apoE4-NT resultante, sin etiquetas de secuencia ni colas, escapa posteriormente de las bacterias y se acumula en el medio de cultivo^11,12, simplificando el procesamiento posterior.

1. Transformación, expresión y purificación del componente proteico del andamio

1. Transformación bacteriana BL21 con plásmido que contiene apoE4-NT
   1. Descongele un tubo de células competentes BL21 (DE3) en hielo durante 10 min.
   2. Una vez que todo el hielo se haya derretido, mezclar suave y cuidadosamente pipetear 50 μL de las células en un tubo de transformación sobre hielo.
   3. Añadir 5 μL que contengan 50 ng de ADN plásmido (para la secuencia, véase la Tabla suplementaria 1) a la mezcla celular. Mueva cuidadosamente el tubo cuatro o cinco veces para mezclar. No vorágice.
   4. Coloque la mezcla en hielo durante 30 minutos.
   5. Choque térmico de la mezcla exactamente a 42 °C durante 10 s.
   6. Colocar sobre hielo durante 5 min.
   7. Pipetear 950 μL de medio S.O.C. en el tubo a temperatura ambiente.
   8. Colocar el tubo en una incubadora de agitación a 37 °C durante 60 minutos con oscilación ajustada a 250 rpm.
   9. Mezclar bien las células moviendo e invirtiendo, luego extienda 100 μL de solución celular en una placa de selección de caldo Luria + agar de 20 ml tratada con ampicilina a una concentración de 0,1 mg / ml.
   10. Incubar durante la noche a 37 °C, o hasta que las colonias visibles hayan crecido.
2. Con un pipete electrónico, transferir 25 ml de medio estéril NZCYM a un matraz cónico estéril de 250 ml a temperatura ambiente y añadir ampicilina a una concentración final de trabajo de 0,1 mg/ml.
3. Utilizando un bucle de inoculación estéril, transferir una colonia individual de la placa de selección que contiene la cepa bacteriana adecuadamente transformada y añadir directamente al matraz que contiene 25 ml de medio NZCYM + ampicilina.
4. Introducir los 25 ml de matraz de cultivo de semillas NZCYM en una incubadora de agitación a 37 °C con oscilación orbital ajustada a 250 rpm.
   NOTA: Se recomienda que este cultivo de semillas se cultive durante la noche para alcanzar una concentración bacteriana adecuada (~ 1.5-2.0 unidades de densidad óptica), medida con un espectrofotómetro ajustado a longitud de onda = 600 nm.
5. Transfiera 250 ml de medio estéril de NZCYM a cuatro matraces deflectores de 1 L y agregue ampicilina antibiótico a una concentración de trabajo de 0,1 mg / ml.
6. En condiciones estériles, transferir 5 ml de cultivo de semillas saturadas a cada uno de los cuatro matraces de 250 ml que contienen cultivo y colocarlo en una incubadora de agitación a 37 °C con oscilación orbital ajustada a 250 rpm.
   NOTA: En este punto, el cultivo se denominará cultivo de expansión y el crecimiento exponencial se supervisará utilizando un espectrofotómetro UV1800. Se permite que el crecimiento continúe hasta que la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD₆₀₀) alcance un valor entre 0.6-0.8.
7. Una vez que el cultivo de expansión haya alcanzado el valor deseado de OD₆₀₀ de 0,6-0,8, añadir 59,6 mg de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) a cada cultivo de 250 ml que contenga matraz para obtener una concentración final de 1 mM para inducir la expresión de proteínas. En este punto, la cultura de expansión se conoce como la expresión cultura. Iniciar la expresión por un período de 5 h.
8. Al final del período de expresión de 5 h, retirar los cuatro matraces de la incubadora de agitación y pipetear 125 ml en seis frascos de centrífuga de 250 ml (750 ml en total).
9. Equilibre cada botella de centrífuga para asegurarse de que la masa total esté dentro de ±0,5 mg entre sí.
   NOTA: Este paso es esencial para garantizar el funcionamiento seguro del dispositivo centrífugo.
10. Prepare el dispositivo centrífugo girando primero el interruptor de encendido a la posición de encendido. Haga clic en el botón "Set/Actual" y ajuste los parámetros a "JA-14", "9,400 x g", 20.00 min y 4 °C usando los diales correspondientes.
11. Cargue las seis botellas de centrífuga balanceadas en un rotor de centrífuga del tamaño adecuado y colóquelas en la centrífuga asegurándose de que se sigan los parámetros de seguridad específicos.
    NOTA: Continúe este paso hasta que se hayan centrifugado todos los cultivos celulares bacterianos y se hayan recolectado sobrenadantes.
12. Filtrar el sobrenadante bacteriano aislado a través de un aparato de filtración al vacío o equivalente equipado con un filtro de 0,45 micras para eliminar cualquier residuo residual.
13. Purificación de heparina de la proteína andamio apoE4-NT recombinante
    NOTA: El procedimiento de purificación de la columna se lleva a cabo a temperatura ambiente.
    1. Equilibre la columna de heparina Hi-trap aplicando 10 volúmenes de columna (50 ml) de tampón fosfato de sodio de 10 mM, pH 7.2, y eluyendo a una velocidad de 5 mL/min.
    2. Aplique el medio enriquecido con apoE4-NT a la columna a una velocidad de 2,5 ml / min hasta que se haya aplicado todo el volumen de 1 L de medio y deseche el flujo.
    3. Lave la columna con 10 volúmenes de columna (50 ml) de tampón fosfato de sodio de 10 mM, pH 7.2, y deseche el flujo.
    4. Eluya la proteína apoE4-NT deseada aplicando tres volúmenes de columna (15 ml) de tampón de elución (tampón fosfato de sodio 10 mM + 1.5 M NaCl, pH 7.2) a la columna y recoja el eluido.
14. Diálisis del eluido de apoE4-NT
    1. Prepare una sección de tubo de diálisis (las dimensiones del tubo de diálisis utilizado fueron 22 cm de longitud, 12 mm de diámetro interno y 10,000 MWCO) remojándolo completamente en agua destilada desionizada (ddi) durante 10 min.
    2. Preparar 1 L de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (10 mM de fosfato sódico + 150 mM de NaCl, pH 7,2) en un vaso de precipitados de plástico de 1 L o equivalente.
    3. Con una abrazadera de tubo de diálisis, sujete un extremo del tubo de diálisis empapado, asegurándose de que la abrazadera esté asegurada y que no pueda escapar ningún líquido.
    4. Inserte un embudo de cuello estrecho en el extremo abierto del tubo de diálisis y vierta los 15 ml de eluido de apoE4-NT en el tubo de diálisis.
       NOTA: Es imperativo verificar si hay fugas en este paso.
    5. Retire el embudo y sujete el extremo del tubo de diálisis con otra pinza para tubo de diálisis.
    6. Coloque un flotador de diálisis de espuma en uno de los extremos sellados del tubo de diálisis y coloque el tubo de diálisis ensamblado en el vaso de precipitados que contiene 1 L de tampón PBS.
    7. Coloque una barra de agitación magnética en la parte inferior del vaso de precipitados y ajuste el control de agitación a "bajo", asegurándose de que no se forme un vórtice.
    8. Una vez concluida la diálisis, decantar el retentado en un tubo cónico de 50 ml y almacenar a -20 °C.
       NOTA: Se recomienda que esta diálisis se realice a 4 °C durante la noche.

2. Formulación de agentes bioactivos que contienen nanodiscos

1. Preparación de alícuota fosfolípida
   1. Pesar 5 mg de un fosfolípido apropiado (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilcolina [DMPC]) y transfiéralo a un tubo de ensayo de vidrio.
   2. Disolver los 5 mg de fosfolípidos añadiendo 300 μL de CHCl 3 y 100 μL de CH 3 OH para una proporcióntotal de₃:1 v/v.
   3. Evapore el disolvente orgánico colocando el tubo de ensayo de vidrio bajo una corriente suave de gas_N2 durante 10-15 min, de modo que se forme una película delgada de fosfolípidos secos a lo largo de las paredes de la parte inferior del tubo.
2. Liofilización de alícuotas de fosfolípidos
   1. Preparar las alícuotas de fosfolípidos para la liofilización cubriendo la abertura del tubo de ensayo de vidrio con parafilm.
   2. Perforar el parafilm con una aguja de 24 G aproximadamente 10-15 veces.
   3. Coloque las alícuotas perforadas en un recipiente de liofilización apropiado y asegúrese de que la tapa de goma esté sellada correctamente.
   4. Conecte el recipiente de liofilización al colector de vacío ubicado en la parte superior de la máquina de liofilización y asegúrese de que todas las demás válvulas estén bien cerradas.
   5. Encienda la máquina de liofilización girando el interruptor de encendido y presionando el botón de inicialización de vacío.
   6. Una vez que el sistema haya alcanzado el vacío total, haga clic en el botón de inicialización de refrigeración para comenzar el proceso de liofilización.
      NOTA: Se recomienda que las muestras se licofilicen durante la noche.
3. Formulación de nanodiscos de anfotericina-B (amp-B)
   1. Pipetear 0,45 ml de PBS a la alícuota de fosfolípidos liofilizados y vórtice durante ~30 s para dispersar el lípido.
      NOTA: La muestra resultante aparecerá opaca y turbia.
   2. Pipetear 50 μL de una solución madre ampB de 20 mg/ml (20 mg de ampB disuelta en 1 ml de dimetilsulfóxido [DMSO], almacenada a -20 °C en un recipiente ámbar cerrado) en la muestra de fosfolípidos dispersos y el vórtice.
      NOTA: Al seleccionar un disolvente para utilizar en la preparación de una solución madre del agente bioactivo hidrófobo, las dos consideraciones generales son 1) la solubilidad del agente bioactivo y 2) la miscibilidad del disolvente con el tampón acuoso utilizado en la formulación. Mientras que el DMSO se utiliza a menudo 15,16,17,18,19, la dimetilformamida ^20,21 o el tetrahidrofurano 22 también se han empleado con éxito ²³.
   3. Pipetear 0,5 ml de proteína de andamio apoE4-NT (concentración de ~4 mg/ml) al tubo de ensayo de vidrio que contiene el fosfolípido disperso y ampB. El volumen final de la muestra debe ser de aproximadamente 1 ml.
   4. Bañar sonicar la muestra a 24 °C hasta que la solución se aclare (generalmente 10-15 min).
4. Centrifugación de nanodiscos
   1. Transfiera la solución clarificada de nanodisco ampB a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 ml.
   2. Coloque el tubo en un rotor de microcentrífuga de mesa con la adición de un tubo de equilibrio colocado directamente enfrente.
   3. Apriete la tapa del rotor y cierre la tapa de la centrífuga.
   4. Programe la centrífuga para que gire durante 10 minutos a ~ 11,000 x g utilizando los diales correspondientes ubicados en la parte frontal de la unidad de microcentrífuga.
      NOTA: En este punto, un pellet puede ser visible. Este pellet consiste en fosfolípidos no incorporados y/o ampB.
   5. Retire el sobrenadante y transfiéralo a otro tubo de microcentrífuga limpio de 1,7 ml.
5. Diálisis de muestra de nanodisco ampB
   1. Prepare una sección de tubo de diálisis (las dimensiones del tubo de diálisis utilizado fueron de 3 cm de longitud, 16 mm de diámetro interno y 10,000 MWCO) remojando completamente en agua ddi durante 10 min.
   2. Preparar una solución tampón de 1 L de PBS (10 mM de fosfato de sodio + 150 mM de NaCl, pH 7,2) en un vaso de precipitados de plástico de 1 L o equivalente.
   3. Con una abrazadera de tubo de diálisis, sujete un extremo del tubo de diálisis empapado, asegurándose de que la abrazadera esté asegurada y que no pueda escapar ningún líquido.
   4. Inserte un embudo de cuello estrecho en el extremo abierto del tubo de diálisis y transfiera la muestra de nanodisco ampB al tubo de diálisis.
   5. Retire el embudo y sujete el extremo del tubo de diálisis con otra pinza para tubo de diálisis.
   6. Coloque un flotador de diálisis de espuma en uno de los extremos sellados del tubo de diálisis y coloque el tubo de diálisis ensamblado en el vaso de precipitados que contiene 1 L de tampón PBS.
   7. Coloque una barra de agitación magnética en la parte inferior del vaso de precipitados y ajuste el control de agitación a "bajo", asegurándose de que no se forme un vórtice. Deje que la diálisis continúe durante la noche a 4 °C.

3. Análisis espectral de muestras de nanodiscos ampB

1. Inicialización del espectrofotómetro seguida de blanco automático
   1. Encienda el espectrofotómetro girando el interruptor de encendido y conéctese a una computadora de soporte correspondiente presionando el botón etiquetado "Control de PC".
   2. En la computadora de soporte, abra el software etiquetado "UVProbe 2.61" y conéctese al espectrofotómetro haciendo clic en el botón "Conectar" en la esquina inferior izquierda.
   3. Haga clic en el botón etiquetado Spectrum en la barra de herramientas superior dentro del software UVProbe.
   4. Haga clic en el botón Método en la barra de herramientas superior.
   5. Haga clic en la pestaña Medición e ingrese "500" en el cuadro de texto Inicio ubicado en "Rango de longitud de onda (nm)" y "300" en el cuadro de texto "Fin".
   6. Haga clic en el menú desplegable junto a la pestaña etiquetada Velocidad de escaneo y configúrela en Media.
   7. Preparar una muestra en blanco transfiriendo 1 ml de DMSO a dos cubetas de cuarzo (QS 1.000).
   8. Cargue ambas cubetas en los respectivos puertos de muestra del espectrofotómetro, haga clic en Autoblank y registre un espectro de 300-500 nm haciendo clic en Inicio en la esquina inferior izquierda.
2. Preparación y análisis espectral del estándar ampB
   1. Preparar 20 μg/ml ampB patrón retirando la cubeta del puerto de muestra frontal y añadiendo 20 μL de una solución madre de ampB de 1 mg/ml (20 μg de ampB en total).
   2. Cargue la cubeta de nuevo en el puerto de muestra del espectrofotómetro y haga clic en Iniciar para registrar la absorbancia de la muestra.
   3. Retire la cubeta del puerto de muestra y decanta el contenido líquido en un recipiente de residuos debidamente etiquetado.
   4. Enjuague bien la cubeta con tres lavados de agua desionizada seguidos de tres lavados con etanol al 70%.
3. Preparación y análisis espectral de la muestra de ampB-nanodisco interrumpido
   1. Preparar una muestra de nanodisco ampB interrumpida (que contenga 20 μg/ml como ampB) pipeteando 20 μL de un material de nanodiscos ampB de 1 mg/ml en 1 ml de DMSO. Incubar durante al menos 1 minuto antes de grabar el espectro.
   2. Cargue la cubbeta en el puerto de muestra frontal del espectrofotómetro y haga clic en Iniciar para registrar la absorbancia de la muestra.
4. Preparación y análisis espectral de un espacio en blanco de tampón PBS
   1. Prepare un tampón PBS en blanco transfiriendo 1 ml de tampón PBS a dos cubetas de cuarzo (QS 1.000).
   2. Cargue las cubetas en los respectivos puertos de muestra del espectrofotómetro, haga clic en Autoblank y registre el espectro de 300-500 nm.
5. Preparación y análisis espectral de una muestra de nanodisco ampB no interrumpida
   1. Prepare una muestra de nanodisco ampB no interrumpida (que contenga 20 μg/ml como ampB) retirando la cubeta del puerto de muestra frontal e introduciendo 20 μL de una muestra de nanodisco ampB de 1 mg/ml en el tampón PBS.
   2. Cargue la cubeta de nuevo en el puerto de muestra del espectrofotómetro, haga clic en Inicio y registre el espectro de muestra.
      NOTA: Todos los desechos químicos deben eliminarse en un contenedor de desechos debidamente etiquetado siguiendo las pautas aceptadas.

4. Análisis del ensayo de viabilidad de levaduras

NOTA: Se realizaron ensayos de viabilidad de levaduras con el fin de evaluar la actividad biológica de ampB y determinar si el proceso de formulación o incorporación en nanodiscos, afectó su actividad de inhibición del crecimiento de levaduras.

1. Formular dos muestras de nanodiscos ampB (volumen final = 1 ml) para contener 1 mg de ampB por 5 mg de DMPC y 0,1 mg de ampB por 5 mg de DMPC siguiendo el método descrito anteriormente (2.3-2.4.1).
   NOTA: Para hacer un ampB de 1 mg/ml y 0,1 mg/ml por 5 mg de DMPC, pipetear 50 μL y 5 μL, respectivamente, de un ampB de 20 mg/ml en existencias de DMSO en cada vial de muestra.
2. Preparación de un cultivo de levadura saturada
   1. Transfiera 25 ml de medio estéril de extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) a un tubo cónico estéril de 50 ml.
   2. Utilice un bucle de inoculación estéril para transferir una sola colonia de Saccharomyces cerevisiae (BY4741) a los 25 ml de medio YPD.
   3. Cultivar la levadura en una incubadora agitadora fijada a 30 °C, con oscilación ajustada a 200 rpm durante 18 h.
3. Preparación de muestras individuales de ensayos de inhibición del crecimiento
   1. Transfiera 5 ml de medio YPD estéril a 30 tubos de cultivo estériles de 13 ml.
   2. Trate tres juegos de tubos de cultivo agregando 20, 10 y 5 μL de la muestra de nanodisco ampB de 1 mg/ml, que representa 20, 10 y 5 μg de ampB, respectivamente.
   3. Tratar tres conjuntos de tubos de cultivo agregando 20, 10 y 5 μl de la muestra de nanodiscos ampB de 0,1 mg/ml, que representan 2, 1 y 0,5 μg de ampB, respectivamente.
   4. Trate cuatro juegos de tubos de cultivo agregando 20 μL de PBS, DMSO, rHDL de control (sin ampB) o 20 μg de ampB en DMSO.
      NOTA: Cada conjunto de tubos de cultivo representa una réplica independiente. Por lo tanto, siguiendo estos métodos da como resultado un valor n global de n = 3.
4. Inicialización del ensayo de viabilidad de levadura
   1. Iniciar el experimento inoculando cada muestra con 100 μL (2% vol/vol) del cultivo de levadura saturada
   2. Cultivar la levadura utilizando una incubadora agitadora a 30 °C, con oscilación ajustada a 200 rpm durante un máximo de 18 h.
5. Mediciones de viabilidad de levaduras
   1. Encienda el espectrofotómetro girando el interruptor de encendido, luego haga clic en el botón Ir a WL y establezca el valor en 600 nm.
   2. Transfiera 1 ml de medio YPD estéril a dos cubetas de plástico, cárguelo en los puertos de muestra respectivos del espectrofotómetro y haga clic en Autoblank.
   3. Transfiera 1 ml de cada muestra a una cubeta de plástico, asegurándose de cambiar las cubetas cada vez y cargue la cubeta en el puerto de muestra frontal del espectrofotómetro.
   4. Mida y registre la densidad óptica de cada muestra a 600 nm y deseche cada cubeta gastada en un contenedor de desechos de riesgo biológico debidamente etiquetado.

Proceso de formulación de nanodiscos de agentes bioactivos
En el procedimiento de formulación de nanodiscos ampB descrito, la reacción se considera completa cuando la apariencia de la muestra pasa de turbia a clara (Figura 1). Este cambio indica que se han formado nanodiscos y que el agente bioactivo ha sido solubilizado. A menudo, los agentes bioactivos absorben la luz en la región de longitud de onda visible (por ejemplo, ampB, curcumina, luteína, coenzima Q₁₀) y, en estos casos, la muestra adopta el color del agente bioactivo. Una vez que se completa la clarificación de la muestra (generalmente 5-20 minutos de sonicación en baño), la muestra se transfiere a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml y se centrifuga a 11.000 x g durante 5 minutos al material insoluble en pellets. La ausencia de un pellet visible puede considerarse una fuerte evidencia de que el agente bioactivo se ha incorporado en los nanodiscos. Por otro lado, la aparición de un pellet indica que se ha producido una incorporación parcial o nula de agente bioactivo. Si es necesario o útil, las formulaciones de control que contienen la bicapa que forma lípidos y la proteína de andamio solo se pueden realizar en paralelo, y el grado de clarificación de ambas muestras se puede comparar visual y cuantitativamente utilizando un espectrofotómetro. En cualquier caso, tras la centrifugación de un agente bioactivo que contiene nanodiscos, la muestra se dializa contra PBS, u otro tampón adecuado, para eliminar los restos de disolvente.

Análisis de la eficiencia de solubilización de agentes bioactivos
Para ilustrar cómo se puede utilizar la absorbancia de la muestra para determinar la eficiencia de solubilización, se pueden utilizar nanodiscos ampB. Inicialmente, se recoge un espectro de ampB en DMSO. Esto se logra agregando 20 μL de una solución madre de 1 mg/ml de ampB (en DMSO) a una cubeta que contiene 980 μl de DMSO. El espectro se registra en el rango de longitud de onda visible de 300-500 nm en un espectrofotómetro UV/Vis (Figura 2). Este espectro, obtenido en disolvente DMSO, produce tres máximos de absorbancia distintivos a 372 nm, 392 nm y 415 nm, picos indicativos de ampB. Posteriormente, se recoge un espectro de absorbancia de nanodiscos ampB en PBS. Para obtener este espectro, se añaden 20 μL de nanodiscos ampB en PBS a 980 μL de PBS, y se registra el espectro. Se espera que este espectro sea bastante diferente, con un único pico de absorbancia importante en una longitud de onda más corta, del espectro observado en DMSO²⁵. Este resultado se debe al hecho de que, en PBS, la estructura de partículas ampB-nanodisco permanece intacta, con moléculas individuales de ampB confinadas y restringidas al interior del medio hidrofóbico de la bicapa de nanodisco. Debido a que las moléculas de ampB en la muestra están muy cerca de otras moléculas de ampB, se pueden formar complejos / estructuras de orden superior, lo que resulta en un cambio dramático en las propiedades espectrales de ampB. Para comparar directamente los espectros de ampB formulados en nanodiscos versus ampB stock, se agrega una alícuota de 20 μL de nanodiscos ampB dializados (en PBS) a 980 μL de DMSO. En este caso, el disolvente DMSO conduce a la interrupción de la estructura de partículas de nanodisco, de modo que ampB integrado en la bicapa lipídica de la muestra de nanodisco se libera y se vuelve libremente soluble en el disolvente DMSO. El espectro de absorbancia de esta muestra debe parecer muy similar, si no idéntico, al espectro de ampB de stock descrito anteriormente. Este resultado proporciona evidencia directa de que ampB está presente y que sus propiedades químicas no han sido alteradas por el proceso de formulación de nanodiscos. En este caso, se prevé que se detectarán los mismos tres máximos de absorbancia.

Actividad biológica de los nanodiscos ampB
Para evaluar la actividad biológica de los nanodiscos ampB, se realizaron ensayos de inhibición del crecimiento de levaduras. Se empleó la cepa de levadura BY4741 (descendiente de la cepa S288C de S. cerevisiae ). Después del tratamiento, la densidad óptica de cada muestra de levadura se midió a 600 nm en un espectrofotómetro UV/Vis UV-1800 (Figura 3). La inclusión de tres muestras de control (PBS, DMSO y rHDL) demostró que los componentes de nanodiscos distintos de ampB no tienen un efecto discernible sobre el crecimiento de la levadura. El control positivo (20 μg de ampB en DMSO) confirmó que ampB es un inhibidor eficiente del crecimiento de levadura. Cuando se probaron nanodiscos ampB, se obtuvo evidencia de actividad de inhibición del crecimiento dependiente de la concentración de ampB. Por lo tanto, el secuestro de ampB en el medio lipídico de las partículas de nanodisco permite una mayor solubilidad del tampón acuoso, con retención de una potente actividad biológica.

Figura 1: Efecto de la sonicación del baño en la formulación de nanodiscos y la apariencia de la muestra. Se preparó una muestra de ampB-nanodisco (ampB-ND) dispersando 5 mg de DMPC en 0,75 ml de PBS, añadiendo 1 mg de ampB a la muestra de una solución madre de 20 mg/ml en DMSO, seguido de la adición de 2 mg de proteína de andamio en 0,5 ml de PBS (de una solución madre de 4 mg/ml). (A) Dispersión DMPC en PBS. (B) dispersión de DMPC en PBS tras la adición de 1 mg de ampB. (C) solución de nanodisco que contiene DMPC, ampB y proteína de andamio después de la sonicación del baño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Espectroscopia de absorbancia UV/Vis de muestras de ampB. (A) ampB en DMSO. (B) nanodiscos ampB (ampB-ND) en PBS. (C) nanodiscos ampB en DMSO. Los espectros se recogieron en un espectrómetro UV/Vis. El contenido de ampB de las muestras de nanodiscos ampB puede determinarse transfiriendo una alícuota conocida a una solución de DMSO y midiendo la absorbancia a 416 nm (coeficiente de extinción ampB a 416 nm = 1,24 x 10⁵ M-1 ^cm-1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Efecto de ampB sobre el crecimiento de S. cerevisiae. Las levaduras se cultivaron a 30 °C en ausencia y presencia de ampB. Las muestras de control que carecían de ampB incluyeron PBS solo y rHDL. Como control positivo, se administró ampB en DMSO. Las formulaciones de prueba incluyeron nanodiscos ampB (ampB-ND) a las concentraciones indicadas de ampB. Después de la incubación, se determinaron los valores de densidad óptica de la muestra individual a 600 nm. La significación estadística se determinó mediante una comparación múltiple de ANOVA bidireccional con una prueba post hoc de Tukey. Los valores informados son la media ± error estándar (n = 3), representativos de tres experimentos independientes. ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Agentes bioactivos incorporados con éxito en nanodiscos.

La formulación de un agente bioactivo que contiene nanodiscos proporciona un método conveniente para solubilizar compuestos hidrófobos insolubles. Debido a que los nanodiscos de agentes bioactivos del producto son completamente solubles en medios acuosos, proporcionan un método de administración útil para una amplia gama de moléculas hidrófobas (Tabla 1). Estos incluyen moléculas pequeñas, drogas naturales y sintéticas, fitonutrientes, hormonas, etc. La estrategia de formulación generalmente sigue un protocolo estándar que debe tener en cuenta las propiedades de solubilidad del agente bioactivo en disolventes orgánicos. Además de seleccionar un disolvente orgánico apropiado para disolver el agente bioactivo, se requieren dos parámetros adicionales, lograr una solución madre de ~ 20 mg / ml y la miscibilidad del disolvente con soluciones acuosas. Esto es necesario porque permite agregar una cantidad significativa de agente bioactivo a la mezcla de formulación sin introducir un exceso de disolvente orgánico. La miscibilidad es importante porque la separación de fases evitará la incorporación de agentes bioactivos en el nanodisco del producto.

La introducción del agente bioactivo inmediatamente después de la dispersión de fosfolípidos de formación bicapa en el tampón de elección permite que estos componentes interactúen entre sí antes de agregar la proteína del andamio. Antes e inmediatamente después de la adición de proteína de andamio, la muestra aparece como una suspensión opaca. Sin embargo, una vez que se agregan los tres componentes (fosfolípido, agente bioactivo y proteína de andamio, en una proporción de 5/1/2 p/p/p) y la muestra se somete a sonicación de baño a la temperatura correcta durante un período suficiente, su apariencia cambia de turbia a clara. Si el agente bioactivo está coloreado, la muestra clarificada tomará ese color. Por lo tanto, es fácil detectar la formación de nanodiscos mediante inspección visual.

Aunque DMPC es conveniente y a menudo se usa como el fosfolípido de elección para muchas aplicaciones, con ciertos agentes bioactivos, este fosfolípido resiste la formulación de nanodiscos. Por ejemplo, los nanodiscos de la coenzima Q₁₀ se formaron solo cuando se usó fosfatidilcolina (PC) de huevo¹⁹, y lo mismo para la xantofila, luteína²². Por lo tanto, mientras que DMPC es a menudo el fosfolípido de elección, esto no es universal. La razón por la cual la coenzima Q₁₀ y la luteína prefieren el huevo PC puede deberse a sus regiones hidrófobas extendidas, una preferencia por las bicapas que poseen ácidos grasos insaturados o algún otro factor. Cuando se emplea el huevo PC, la temperatura de sonicación se eleva a 45 ° C durante la sonicación para lograr una clarificación completa de la muestra. Una vez formulados, los nanodiscos que contienen agentes bioactivos se centrifugan para eliminar el material insoluble. Cabe señalar, sin embargo, que normalmente no se forma un precipitado una vez que se determinan y siguen las condiciones óptimas. Posteriormente, la muestra se dializa contra tampón durante la noche para eliminar la pequeña cantidad de disolvente orgánico que se agregó a la mezcla de formulación junto con el agente bioactivo. Después de la diálisis, el nanodisco del producto puede almacenarse a 4 °C durante períodos prolongados. Si el agente bioactivo incorporado es susceptible a la oxidación, entonces la muestra de nanodisco debe almacenarse en un recipiente cerrado bajo gas_N2 .

Se han utilizado varios métodos para caracterizar y validar que los nanodiscos se han formado realmente. Quizás el método más preciso es la microscopía electrónica^26,27. Esta técnica proporciona información sobre la morfología de las partículas, el diámetro y la heterogeneidad del tamaño de la población. Este método se considera definitivo para la formación de nanodiscos. Un método relacionado, la microscopía de fuerza atómica, también se ha utilizado para investigar las propiedades de nanodiscos que contienen agentes bioactivos 17,24,28. Sin embargo, para fines prácticos, la cromatografía de filtración en gel de cromatografía líquida de proteínas rápidas (FPLC) es conveniente y típicamente suficiente para caracterizar el tamaño (~ 200,000 Da) y la homogeneidad de una muestra de nanodisco de agente bioactivo dada^20,22. Una vez que se determina que se han formado nanodiscos de agentes bioactivos, también es importante y útil determinar la eficiencia de solubilización del agente bioactivo. Si el agente bioactivo tiene propiedades de absorbancia características en una longitud de onda dada, entonces la espectroscopia de absorbancia UV/Vis representa un método conveniente. Un factor potencialmente complicado es la absorbancia de la proteína del andamio a 280 nm. Sin embargo, si un agente bioactivo dado se absorbe en una longitud de onda diferente, entonces esto no es un problema. Si se conoce un coeficiente de extinción para el agente bioactivo de interés, entonces es posible determinar con precisión la cantidad de agente bioactivo solubilizado en nanodiscos. De lo contrario, se puede utilizar una curva estándar derivada de espectros de cantidades conocidas del agente bioactivo en un disolvente apropiado. Los métodos alternativos incluyen la espectroscopia de fluorescencia^17,22 o el análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)^20,24.

El proceso de formulación básica descrito para agentes bioactivos que contienen nanodiscos es susceptible de una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, los nanodiscos que albergan agentes de contraste se han utilizado en estudios de imagen médica para diagnosticar y evaluar la progresión de la enfermedad²⁹. Otro enfoque es integrar proteínas modificadas con lípidos en la bicapa de nanodiscos. Por ejemplo, Lalefar et al. incorporaron con éxito la proteína "Wnt" en nanodiscos mediante la inserción de su fracción de ácido oleico unida covalentemente³⁰. Posteriormente se demostró que los nanodiscos Wnt constituyen un vehículo de transporte Wnt soluble en agua capaz de promover la expansión ex vivo de las células madre hematopoyéticas. En otro estudio, Crosby et al. construyeron una quimera de proteína de andamio compuesta por apoA-I fusionada a un fragmento de anticuerpo variable de cadena única (scFv) dirigido contra el antígeno de superficie de células B CD20³¹. La formulación posterior de nanodiscos de curcumina con α-CD20 scFv·apoA-I como componente de andamio confirió orientación a las células B, mejorando así la administración de agentes bioactivos. Esta estrategia proporciona un enfoque novedoso para minimizar la toxicidad asociada con los agentes quimioterapéuticos dirigiéndolos específicamente al tipo de célula diana. En otro ejemplo, el lípido catiónico sintético cloruro de 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano (DMTAP) fue incorporado a la bicapa de nanodiscos³². Esta estrategia de formulación confirió efectivamente un carácter de carga positiva a la superficie de la bicapa de nanodisco y, por lo tanto, promovió una interacción de unión estable con ARN interferente corto (si). Luego se demostró que los nanodiscos DMTAP enriquecidos con ARNip poseen actividad biológica en estudios de eliminación de genes objetivo. En otro ejemplo, los nanodiscos se han formulado con cardiolipina como único componente fosfolípido. Se sabe que este glicerofosfolípido aniónico único se une a varios ligandos, incluido el mineral divalente calcio, la hemoproteína citocromo c, el agente anticancerígeno antraciclina doxorrubicina y otros^33,34,35,36. Los nanodiscos de cardiolipina se han utilizado para caracterizar estas interacciones de unión en detalle aprovechando las propiedades de solubilidad de los nanodiscos, su tamaño a nanoescala y la presencia de una^{bicapa 8} de cardiolipina accesible. Sobre la base de estas y otras aplicaciones, es evidente que la tecnología de nanodiscos es una plataforma versátil para una multitud de aplicaciones.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R37 HL-64159).