Circuitos digitales genéticos basados en sistemas CRISPR-Cas y proteínas anti-CRISPR

Los sistemas CRISPR-Cas y las proteínas anti-CRISPR se integraron en el esquema de puertas booleanas en Saccharomyces cerevisiae. Los nuevos circuitos lógicos pequeños mostraron un buen rendimiento y profundizaron la comprensión de los factores de transcripción basados en dCas9 / dCas12a y las propiedades de las proteínas anti-CRISPR.

Las puertas booleanas de genes sintéticos y los circuitos digitales tienen una amplia gama de aplicaciones, desde el diagnóstico médico hasta el cuidado del medio ambiente. El descubrimiento de los sistemas CRISPR-Cas y sus inhibidores naturales, las proteínas anti-CRISPR (Acrs), proporciona una nueva herramienta para diseñar e implementar circuitos digitales de genes in vivo . Aquí, describimos un protocolo que sigue la idea del ciclo de ingeniería biológica "Diseñar-Construir-Probar-Aprender" y hace uso de dCas9/dCas12a junto con sus correspondientes Acrs para establecer pequeñas redes transcripcionales, algunas de las cuales se comportan como puertas booleanas, en Saccharomyces cerevisiae. Estos resultados señalan las propiedades de dCas9/dCas12a como factores de transcripción. En particular, para lograr la activación máxima de la expresión génica, dSpCas9 necesita interactuar con un ARN de andamio diseñado que recolecta múltiples copias del dominio de activación VP64 (AD). Por el contrario, dCas12a se fusionará, en el extremo C, con el fuerte VP64-p65-Rta (VPR) AD. Además, la actividad de ambas proteínas Cas no se ve reforzada por el aumento de la cantidad de sgRNA/crRNA en la célula. Este artículo también explica cómo construir puertas booleanas basadas en la interacción CRISPR-dCas-Acr. El dominio de unión a hormonas fusionado AcrIIA4 del receptor de estrógeno humano es el núcleo de una puerta NOT que responde al β-estradiol, mientras que los AcrVA sintetizados por el promotor GAL1 inducible permiten imitar las puertas SÍ y NO con galactosa como entrada. En estos últimos circuitos, AcrVA5, junto con dLbCas12a, mostró el mejor comportamiento lógico.

En 2011, los investigadores propusieron un método computacional y desarrollaron una pieza correspondiente de software para el diseño automático de circuitos genéticos sintéticos digitales¹. Un usuario tenía que especificar el número de entradas (tres o cuatro) y rellenar la tabla de verdad del circuito; Esto proporcionó toda la información necesaria para derivar la estructura del circuito utilizando técnicas de la electrónica. La tabla de verdad se tradujo a dos fórmulas booleanas a través ^{del método 2} del mapa de Karnaugh. Cada fórmula booleana está hecha de cláusulas que describen operaciones lógicas (suma o multiplicación) entre (parte de) las entradas del circuito y sus negaciones (los literales). Las cláusulas, a su vez, se suman (OR) o se multiplican (AND) para calcular la salida del circuito. Cada circuito se puede realizar de acuerdo con cualquiera de sus dos fórmulas correspondientes: una escrita en forma POS (producto de sumas) y la otra en representación SOP (suma de productos). El primero consiste en una multiplicación de cláusulas (es decir, puertas booleanas) que contienen una suma lógica de los literales. Este último, en cambio, es una suma de cláusulas donde los literales se multiplican.

Los circuitos eléctricos se pueden realizar, en una placa de pruebas, conectando físicamente diferentes puertas juntas. La corriente eléctrica permite el intercambio de señales entre puertas, lo que conduce al cálculo de la salida.

En biología, la situación es más compleja. Una puerta booleana se puede realizar como una unidad de transcripción (TU; es decir, la secuencia "promotor-codificante de la región-terminador" dentro de las células eucariotas), donde la transcripción o la traducción (o ambas) están reguladas. Así, al menos dos tipos de moléculas establecen un cableado biológico: las proteínas del factor de transcripción y los ARN antisentido no codificantes¹.

Un circuito digital de genes está organizado en dos o tres capas de puertas, a saber: 1) la capa de entrada, que está hecha de puertas SÍ (tampón) y NO y convierte los productos químicos de entrada en moléculas de cableado; 2) la capa interna, que consiste en tantas TU como cláusulas hay en la fórmula booleana correspondiente. Si el circuito está diseñado de acuerdo con la fórmula SOP, cada cláusula en la capa interna producirá la salida del circuito (por ejemplo, fluorescencia) en una llamada arquitectura de salida distribuida. Si se utiliza la fórmula del producto de suma (POS), entonces se requiere una capa final 3), que contendrá una sola puerta multiplicativa que recoge las moléculas de cableado de la capa interna.

En general, en biología sintética, se pueden diseñar muchos esquemas diferentes para el mismo circuito. Difieren en el número y el tipo de TU y moléculas de cableado. Para elegir la solución más fácil de implementar en celdas de levadura, cada diseño de circuito se asocia con una puntuación de complejidad S, definida como

donde A representa el número de activadores, R representa el número de represores y a es la cantidad de moléculas de ARN antisentido. Si los activadores o represores están ausentes del circuito, su contribución a S es cero. Por lo tanto, es más difícil realizar un esquema de circuito en el laboratorio (S alta) cuando requiere un alto número de factores de transcripción ortogonales. Esto significa que los nuevos activadores y represores deben diseñarse de novo para realizar el cableado completo dentro de los circuitos digitales. En principio, las nuevas proteínas de unión al ADN se pueden ensamblar utilizando las proteínas Zinc Finger³ y los efectores TAL⁴ como plantillas. Sin embargo, esta opción parece demasiado ardua y lenta; por lo tanto, uno debe confiar principalmente en pequeños ARN y regulación de traducción para finalizar circuitos genéticos complejos.

Originalmente, este método fue desarrollado para fabricar circuitos digitales en bacterias. De hecho, en las células eucariotas, en lugar de ARN antisentido, es más adecuado hablar de microARN (miARN) o pequeños ARN interferentes (siRNAs)⁵. Sin embargo, la vía del ARNi no está presente en la levadura S. cerevisiae. Por lo tanto, uno debe optar por redes completamente transcripcionales. Supongamos que un circuito necesita cinco activadores y cinco represores; su puntuación de complejidad sería S = 32. La complejidad del circuito puede reducirse reemplazando los 10 factores de transcripción con un solo dCas9⁶ (Cas9 deficiente en nucleasa) fusionado a un dominio de activación (AD). Como se muestra en⁷, dCas9-AD funciona como un represor en la levadura cuando se une a un promotor entre la caja TATA y el TSS (sitio de inicio de la transcripción) y como un activador cuando se une bien aguas arriba de la caja TATA. Por lo tanto, se pueden reemplazar 10 factores de transcripción con una sola proteína de fusión dCas9-AD y 10 sgRNAs (ARN guía únicos) para una puntuación de complejidad total de S = 11. Es rápido y fácil sintetizar diez sgRNAs, mientras que, como se comentó anteriormente, el ensamblaje de 10 proteínas exigiría un trabajo mucho más largo y complicado.

Alternativamente, se podrían usar dos proteínas dCas ortogonales (por ejemplo, dCas9 y dCas12a): una para fusionarse con un AD y la otra desnuda o en combinación con un dominio de represión. La puntuación de complejidad aumentaría en una sola unidad (S = 12). Por lo tanto, los sistemas CRISPR-dCas son la clave para la construcción de circuitos digitales de genes muy intrincados en S. cerevisiae.

Este documento caracteriza profundamente la eficiencia de los represores y activadores basados en dCas9 y dCas12a en levadura. Los resultados muestran que no demandan una gran cantidad de sgRNA para optimizar su actividad, por lo que los plásmidos episomales se evitan preferentemente. Además, los activadores basados en dCas9 son mucho más efectivos cuando se usa un ARN de andamio (scRNA) que recluta copias del VP64 AD. Por el contrario, dCas12a funciona bien cuando se fusiona directamente con el fuerte VPR AD. Además, un promotor activado sintético exige un número variable de sitios diana, dependiendo de la configuración del activador (por ejemplo, tres cuando se utiliza dCas12a-VPR, seis para dCas9-VP64 y solo uno con dCas9 y un scRNA). Como represor, dCas12a parece más incisivo cuando se une a la región codificante que al promotor.

Sin embargo, como inconveniente, CRISPR-dCas9 / dCas12a no interactúan directamente con los productos químicos. Por lo tanto, es posible que no sean útiles en la capa de entrada. Por esta razón, se han investigado diseños alternativos de puertas booleanas que contienen proteínas anti-CRISPR (Acrs). Acrs actúan sobre las proteínas (d)Cas e inhiben su funcionamiento⁸. Por lo tanto, son un medio para modular la actividad de los sistemas CRISPR-(d)Cas. Este artículo analiza a fondo las interacciones entre Acrs tipo II y (d)Cas9, así como Acrs tipo V y (d)Cas12a en S. cerevisiae. Dado que los Acr son mucho más pequeños que las proteínas Cas, se construyó una puerta NOT que responde al estrógeno β-estradiol fusionando el dominio de unión hormonal del receptor de estrógeno humano^9-HBD (hER) con AcrIIA4. Además, se realizaron un puñado de puertas SÍ y NO que expresaban dCas12a (-AD) constitutivamente y AcrVA en la inducción con galactosa. En la actualidad, estas puertas sirven solo como prueba de concepto. Sin embargo, también representan el primer paso hacia un replanteamiento profundo del algoritmo para llevar a cabo el diseño automático computacional de circuitos digitales de genes sintéticos en células de levadura.

1. Diseño y construcción del casete de expresión sgRNA/crRNA

NOTA: Hay dos tipos de casetes de expresión de sgRNA/crRNA: SNR52^10-está compuesto por el promotor SNR52 dependiente de la ARN polimerasa III, la secuencia sgRNA/crRNA y el terminador SUP4; otro, abreviado como RGR¹¹, consiste en el promotor ADH1 dependiente de la ARN polimerasa II, la estructura RGR (ribozima-ribozima de ARN guía de ribozima) que contiene dos ribozimas (una ribozima de cabeza de martillo-HH y una ribozima del virus delta de la hepatitis HDV) y la secuencia del sgRNA / crRNA intermedio, y el terminador ADH1. Los homólogos de Cas9 que guían el sgRNA están formados por una secuencia espaciadora y la característica repetición directa¹², mientras que el crRNA para las proteínas Cas12a comprende la repetición directa seguida de la secuencia espaciadora^13,14 (véase la Tabla suplementaria 1 para todas las secuencias de ADN utilizadas en este estudio).

1. Diseñar la secuencia espaciadora para la activación transcripcional mediada por Cas9/Cas12a.
   1. Aproveche la secuencia del operador lex bacteriano (llamada lexOp) para que sea el sitio objetivo ^15,16 e insértela en el promotor CYC1 que impulsa la expresión de la proteína fluorescente verde mejorada con levadura (yEGFP)¹⁷. Por lo tanto, la secuencia espaciadora está definida y es complementaria al lexOp insertado.
2. Compruebe la ortogonalidad de la secuencia espaciadora mediante la herramienta CRISPRDIRECT¹⁸.
   1. Pegue la secuencia lexOp flanqueada por la secuencia PAM en el campo de texto, defina la secuencia PAM como NRG para dCas9 y TTTV para dCas12a, y especifique las especies de la lista desplegable como Levadura en ciernes (Saccharomyces cerevisiae) Genoma S288C. Haga clic en Diseño. Asegúrese de que no haya un sitio de destino coincidente en 20mer + PAM ni en la búsqueda de 12mer + PAM.
3. Construir el casete de expresión sgRNA/crRNA.
   1. Utilice PCR de toma para amplificar las secuencias de ADN de las partes biológicas estándar, como promotores, secuencias codificantes y terminadores.
      1. Preparar una mezcla de reacción que contenga: 20-40 ng de plantilla de ADN, 1 μL de cebador directo de 10 μM (es decir, ot25, construcción de plásmido de expresión de sgRNA/crRNA), 1 μL de cebador inverso de 10 μM (es decir, ot26, construcción de plásmido de expresión de sgRNA/crRNA), 5 μL de mezcla de 2,5 mM dNTP, 0,5 μL de ADN polimerasa, 10 μL de 5x tampón de reacción de ADN polimerasa, y agua destilada doble (_ddH2O) hasta un volumen total de 50 μL.
         NOTA: Consulte la Tabla suplementaria 2 para obtener una lista de cebadores utilizados en este estudio.
      2. Ejecute el programa de PCR de toma de contacto en un termociclador:
         Etapa 1: 98 °C durante 30 s.
         Etapa 2 con 10 ciclos: 98 °C durante 10 s, 68 °C durante 20 s y 72 °C durante 15 s.
         Etapa 3 con 25 ciclos: 98 °C durante 10 s, 59 °C durante 20 s y 72 °C durante 15 s.
         Etapa 4: 72 °C durante 2 min.
         Por último, mantener a 4 °C hasta el inicio de los experimentos de seguimiento.
         NOTA: Los 68 °C en la etapa 2 y los 59 °C en la etapa 3 dependen de las temperaturas de fusión de los cebadores directos e inversos, que varían de diferentes pares de cebadores. El tiempo a 72 °C en las etapas 2 y 3 está determinado por la longitud del producto de PCR y la velocidad de la ADN polimerasa.
   2. Aislar los productos de PCR mediante electroforesis en gel (100 V, 30 min). Eluya las secuencias de ADN del gel de agarosa a través de un kit de extracción de gel de ADN (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Se requiere un gel de agarosa al 0,8% para fragmentos de más de 500 nt, un gel de agarosa al 1,5% para fragmentos entre 100 nt y 500 nt, y un gel de agarosa al 2% para fragmentos de menos de 100 nt.
   3. Insertar la TU que expresa sgRNA/crRNA en un vector lanzadera pRSII404/424¹⁹, que contiene el gen de resistencia a la ampicilina y el gen marcador auxotrofo seleccionable por levadura-TRP1.
      1. Digerir el vector lanzadera a 37 °C durante 1 h con las dos enzimas de restricción SacI y Acc65I. Preparar la mezcla de reacción añadiendo 5 μg del vector lanzadera, las cantidades recomendadas de enzimas, tampón de digestión (según las instrucciones de la enzima) y_ddH2Ohasta un volumen total de 30 μL.
      2. Verificar la digestión del vector lanzadera mediante electroforesis en gel (ver subpaso 1.3.2). A continuación, inactivar las dos enzimas a 65 °C durante 20 min.
      3. Utilice el método de ensamblaje 20 de Gibson para insertar los productos de PCR purificados en el vector lanzadera abierto de corte dejando entrar la mezcla de ADN equimolar a⁵⁰ °C durante 1 h.
      4. Transforme células competentes de Escherichia coli DH5α con la mezcla de reacción de Gibson anterior mediante el método de transformación de choque térmico²¹. Transfiera las células transformadas de E. coli a placas de agar Luria-Bertani (LB) que contienen ampicilina (0,1 g / L). Coloque las placas en la incubadora a 37 ° C y deje que las células crezcan durante la noche.
      5. Recoger cuatro colonias de la placa de agar LB y cultivarlas por separado durante la noche a 37 °C en una solución de LB que contenga ampicilina (0,1 g/L). Luego, use el procedimiento de mini preparación para extraer plásmidos de las células de E. coli ²².
      6. Utilice los cebadores ot18 y ot19 (véase la Tabla complementaria 2 para las secuencias oligo) para secuenciar y confirmar la unidad de transcripción insertada mediante el método de Sanger²³.
         NOTA: En experimentos posteriores, los plásmidos construidos y confirmados se insertarán en el genoma de la levadura a través del protocolo PEG / LiAc²⁴.

2. Diseño y construcción del cassette de expresión de ARN del andamio

NOTA: El ARN guía del andamio (scRNA) está compuesto por la secuencia sgRNA y las estructuras de horquilla MS2²⁵. En este trabajo se utilizan dos tipos de estructuras de horquilla MS2: horquilla MS2 de tipo salvaje y aptámero-f6 de proteína de recubrimiento MS2 f6 (MCP).

1. Sintetice una plantilla de scRNA que pueda acomodar diferentes secuencias espaciadoras (es decir, pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
   NOTA: En este estudio, la plantilla de scRNA fue sintetizada por una compañía de síntesis de genes (ver Tabla de materiales).
2. Diseñar cebadores adecuados (ver Tabla Suplementaria 2) para ejecutar PCR en las secuencias espaciadoras necesarias.
3. Siga los procedimientos del paso 1.3 para construir un casete de expresión de scRNA.

3. Ingeniería de dSpCas9 y construcción de plásmidos de expresión

1. Obtenga el plásmido pTPGI_dSpCas9_VP64 (consulte la Tabla de materiales).
2. Construya el vector aceptor pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, basado en el vector lanzadera pRSII406, mediante PCR de toma de contacto y el método de ensamblaje de Gibson (consulte el paso 1.3). El plásmido proporciona un fuerte promotor constitutivo-pGPD, y un terminador-CYC1t.
3. Digerir el plásmido pTPGI_dCas9_VP64 y el vector aceptor recién construido (5 μg durante 1 h o 10 μg durante la noche; véase el paso 1.3.3.1 como referencia) con XbaI y XhoI a 37 °C. Separar y purificar el fragmento de inserción y el vector aceptor como en el paso 1.3.2.
4. Ligar el fragmento de inserto purificado y el vector aceptor con ADN ligasa T4 a 16 °C durante 8 h. Preparar la solución de ligadura añadiendo 50-100 ng del vector aceptor purificado, fragmentos diana purificados en cantidad equimolar con el vector aceptor, 1,5 μL de tampón T4, 0,5 μL de ligasa T4 y_ddH2Ohasta un volumen total de 15 μL.
5. Siga los pasos 1.3.3.3 y 1.3.3.4. A continuación, confirmar que el plásmido recién construido es correcto mediante digestión con XbaI y Xhol (37 °C, 1 h) y electroforesis en gel (ver paso 1.3.2).

4. Ingeniería dCas12a y construcción de plásmidos

1. Construir los plásmidos que expresan dCas12a-AD.
   1. Sintetizar dos proteínas dCas12a optimizadas para codones de levadura (denAsCas12a y dLbCas12a) flanqueadas por sitios de enzimas de restricción BamHI y Xhol.
      NOTA: En este estudio, las dos proteínas dCas12a optimizadas para codones de levadura fueron sintetizadas por una compañía de síntesis de genes (ver Tabla de materiales).
   2. Construya el vector aceptor pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 mediante PCR de toma de contacto y el método de ensamblaje de Gibson (consulte el paso 1.3), donde el "promotor" es pGPD o pGAL1, "sp" representa una secuencia aleatoria corta y "AD" es VPR o VP64.
   3. Insertar cada proteína dCas12a en los dos vectores aceptores recién construidos mediante digestión con BamHI y XhoI y ligadura con ADN ligasa T4 (consultar los pasos 3.3 y 3.4).
2. Construir los plásmidos expresando un dCas12a desnudo.
   1. Construya un vector aceptor para los casetes de expresión inducibles por galactosa de dCas12a como pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t utilizando PCR de toma de contacto y el método de ensamblaje de Gibson (consulte el paso 1.3).
   2. Digiera los plásmidos que contienen las proteínas dCas12a y el vector aceptor anterior con BamHI y Xhol, luego ligarlos con ADN ligasa T4 para obtener el plásmido pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t (consulte los pasos 3.3 y 3.4).
   3. Digerir el plásmido obtenido en el paso 4.2.2 con Acc65I y BamHI, y luego reemplazar pGAL1 con pGPD mediante PCR de toma de contacto y el método de ensamblaje de Gibson para construir pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t.

5. Ingeniería de proteínas anti-CRISPR y construcción de plásmidos

NOTA: Se han empleado tres tipos de promotores para impulsar la expresión de Acrs: un promotor inducible-pGAL1, cuatro promotores constitutivos de levadura-pGPD, pACT1, pTEF1 y pTEF2, y un promotor constitutivo sintético-genCYC1t_pCYC1noTATA²⁶.

1. Obtener los plásmidos que contienen las secuencias de Acrs tipo II (AcrIIA2, AcrIIA4²⁷ y AcrIIA5 28) y Acrs tipo V-A (AcrVA1, AcrVA4 y AcrVA5²⁹) de una compañía de síntesis génica.
2. Construir los plásmidos basados en el vector lanzadera pRSII403 para expresar Acrs.
   1. Construir casetes de expresión AcrIIA.
      NOTA: Utilice la PCR de toma de contacto para amplificar cuatro promotores diferentes (es decir, pGPD, pACT1, pTEF2 y genCYC1t_pCYC1noTATA), los tres tipos de AcrIIA y dos terminadores (ADH1t y CYC1t). Construya una serie de TU que expresen AcrIIAs, bajo diferentes promotores, a través del método de ensamblaje de Gibson (consulte el paso 1.3).
   2. Construir casetes de expresión AcrVA.
      1. Sintetizar la secuencia aceptora: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, donde "sp" es una secuencia aleatoria que será reemplazada por AcrVAs más adelante.
         NOTA: En este estudio, las secuencias aceptoras fueron sintetizadas por una compañía de síntesis de genes (Tabla de Materiales).
      2. Ensamble los vectores aceptores pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, donde el "promotor" es: pGAL1, pTEF1 y genCYC1t_pCYC1noTATA. Utilice el método de ensamblaje Gibson (consulte el paso 1.3).
      3. Inserte cada uno de los tres AcrVA en el vector aceptor descrito en el paso 5.2.2.2 (mediante PCR de toma de contacto y el método de ensamblaje de Gibson [consulte el paso 1.3]) para construir un conjunto de plásmidos que produzcan AcrVA.
3. Diseñe aún más AcrIIA4 extendiendo su secuencia con las secuencias del enlazador GS y HBD(hER). Esto permite la construcción de un circuito sensible al β-estradiol.
   1. Utilice PCR de toma de contacto para obtener piezas GS-HBD y AcrIIA4 por separado (consulte el paso 1.3.1).
   2. Coloque AcrIIA4, GS-HBD y el vector lanzadera en la mezcla de Gibson y construya el plásmido completo mediante el método de Gibson (ver paso 1.3.3).

6. detección de crRNA: RT-qPCR y diseño de cebadores

NOTA: la detección de crRNA se logró a través de RT-qPCR, que se organiza en tres pasos.

1. Realice la extracción y purificación de ARN de las células de levadura a través de un kit de ARN.
   1. Cultive células de levadura durante la noche en 2 ml de medio completo sintético definido (SDC, volumen de 1 L: 20 g de glucosa, 2 g de mezcla AA, 6,7 g de YNB, 396 mg de leucina, 79,2 mg de triptófano, 79,2 mg de histidina, y 79,2 mg de uracilo) utilizando una placa de 24 pocillos (240 rpm, 30 °C).
   2. Por la mañana, diluir el cultivo celular (1:100) en 2 ml de SDC fresco y seguir cultivando las células de levadura a 30 °C, 240 rpm, durante otras 4 h.
   3. Cosechar los 2 ml enteros de la solución celular y centrifugar a 20,238 x g durante 2 min. Retire el sobrenadante con cuidado ya que el pellet celular es pequeño.
   4. Extraiga el ARN de las células de levadura utilizando un kit de ARN.
   5. Compruebe la calidad del ARN.
      1. Prepara un gel de agarosa al 1%. Mezclar 5 μL de cada muestra de ARN con 1 μL de colorante de carga de ADN. Luego cargue la mezcla en el gel y ejecútelo.
      2. Asegúrese de que dos bandas claras a ~4,000 nt y ~2,000 nt, correspondientes al ARN ribosómico (25S / 18S), estén presentes en el gel. Se puede ver una banda borrosa adicional a ~ 80 nt para el ARNt.
   6. Utilice las muestras de ARN inmediatamente para la síntesis de ADNc o almacénelas a -80 °C para su uso futuro.
2. Transcripción inversa: Utilice el método stem-loop 30 para formar la primera cadena de ADNc correspondiente al crRNA (⁴⁰ nt). Para la transcripción inversa del sgRNA (casi 100 nt), el procedimiento es el mismo que para la síntesis de ADNc del gen de referencia ACT1.
   NOTA: El método para la transcripción inversa del ARNcr es diferente del utilizado con el ARNg y el ARNm ACT1 . Dado que el ARNc es muy corto, se trató como un microARN y se utilizó el método de transcripción inversa de microARN (enfoque tallo-bucle) para obtener el ADNc correspondiente. Se utilizaron dos kits de síntesis de ADNc (un kit de bucle madre para el ARNc y un kit de transcripción inversa habitual para el gen ACT1 ) en la cuantificación del ARNcr. La misma cantidad de ARN se utilizó en los dos kits (ver Tabla de materiales) para hacer que los resultados del experimento fueran comparables. El cebador utilizado con el kit tallo-bucle se diseñó de acuerdo con la secuencia tallo-bucle y los últimos seis nucleótidos en el extremo 3' del crRNA (para el bucle madre y la secuencia de cebadores, ver Tabla complementaria 2).
   1. Método de bucle madre para la transcripción inversa de crRNA
      1. Saque la plantilla de ARN, la imprimación y los amortiguadores del congelador y déjelos derretir en hielo.
      2. Eliminación del ADN genómico: Primero, prepare 10 μL de la mezcla de reacción de acuerdo con las instrucciones del kit. Poner la mezcla en un termociclador a 42 °C durante 2 min. Finalmente, transfiéralo al hielo.
      3. Síntesis de la primera cadena de ADNc: Preparar 20 μL de la mezcla de reacción añadiendo 10 μL de la mezcla del paso 6.2.1.2, 1 μL de cebador tallo-bucle (concentración de 2 μM), 2 μL de tampón de reacción RT 10x, 2 μL de mezcla enzimática de transcripción inversa (que contiene la transcriptasa inversa) y 5 μL de_H2Olibre de RNasa.
      4. Coloque la mezcla de reacción en un termociclador y ejecute el siguiente programa: 25 °C durante 5 min, 50 °C durante 15 min y 85 °C durante 5 min. Utilice el producto para la reacción de qPCR inmediatamente o guárdelo a -80 °C.
   2. Transcripción inversa de ARNm de sgRNA y ACT1
      1. Primera reacción: Prepare una mezcla de 13 μL que consista en la mezcla de cebador, la mezcla de dNTP, la plantilla de ARN (50 pg-5 μg) y agua sin RNasa (aparte de la plantilla de ARN, todas proporcionadas por el kit), de acuerdo con las instrucciones del kit. Utilice 1 μg de plantilla de ARN. Poner la mezcla en un termociclador a 70 °C durante 10 min.
      2. Segunda reacción (síntesis de ADNc): Prepare la mezcla de reacción añadiendo los reactivos (como se describe en las instrucciones del kit) a los 13 μL de la primera solución de reacción hasta un volumen final de 20 μL. Coloque la mezcla en un termociclador durante 15 min a 50 °C y luego durante 5 min adicionales a 85 °C. Utilice el producto para la reacción de qPCR inmediatamente o guárdelo a -80 °C.
3. Kit SYBR para qPCR: detección de valores de Ct
   NOTA: El cebador inverso utilizado en la qPCR del ARNcr es fijo porque corresponde al complemento inverso de la secuencia tallo-asa (ver Tabla complementaria 2). El cebador directo, por el contrario, es variable y depende de la secuencia del crRNA. Los cebadores directos e inversos para la qPCR de ARNm de sgRNA y ACT1 están diseñados a https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Se seleccionan dos imprimaciones cuando la diferencia entre sus temperaturas de fusión no es superior a 2 °C (véase el cuadro complementario 2). Cada muestra se mide en tres réplicas.
   1. Prepare la mezcla de reacción qPCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit SYBR.
   2. Establezca el siguiente programa de qPCR en una máquina de PCR en tiempo real.
      Preincubación: 10 min a 95 °C.
      Etapa de PCR: 15 s a 95 °C, seguida de 34 s a 55 °C. Ajuste el ciclo de la etapa de PCR a 45 veces. Etapa de fusión: 10 s a 95 °C, seguida de 60 s a 65 °C, y finalmente 1 s a 97 °C.
   3. Calcule los valores relativos de expresión de ARNm mediante la fórmula³¹ de Pfaffl.

7. Inmunofluorescencia para detectar proteínas Cas

NOTA: Las proteínas Cas (CasP) se fusionan a un His_tag.

1. Preparación de células de levadura
   1. Recoger algunas células de levadura utilizando un bucle estéril y cultivarlas en 5 ml de medio rico en YPD durante la noche a 240 rpm a 30 °C. Por la mañana, añadir 500 μL de la solución celular a 20 ml de YPD fresco y cultivarlos a 240 rpm a 30 °C hasta que el OD₆₀₀ alcance 0,6.
   2. Tomar 5 mL del cultivo y mezclarlo con 500 μL de formaldehído al 37%. Deje que la mezcla permanezca a temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Cosechar las células por centrifugación a 1.500 x g durante 5 min.
   3. Retirar el sobrenadante y resuspender las células con 1 mL de tampón de fijación (0,1 M KH 2 PO₄, 0,5 M MgCl₂, formaldehído al 3,7%, pH = 6,5). Mantenga la solución celular en RT durante 20 min.
   4. Centrifugar la solución celular a 1.500 x g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de tampón de lavado (0,1 M KH 2 PO 4,_1,2M de sorbitol, pH = 6,5) suplementado con 4 μL de beta-mercaptoetanol y₄ μL de solución de lisado (5 mg/ml). Colocar la solución celular en una incubadora a 37 °C durante 20 min.
   5. Centrifugar la solución celular a 1.500 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Lavar el pellet celular dos veces con 1 ml de PBS por centrifugación (1.500 x g durante 5 min).
   6. Resuspender las células en 100 μL de PBS más 0,05% Tween 20 y añadir 4 μL de solución BSA (10 mg/ml). Mantenga la solución celular en RT durante 20 min.
2. Incubación con anticuerpos primarios
   1. Añadir el anticuerpo primario Anti-His tag a la mezcla en el paso 7.1.6 con una dilución de 1:400. Mantener la solución en RT durante 2 h.
   2. Centrifugar la mezcla en el paso 7.2.1 a 1.500 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Añadir 1 ml de PBST y centrifugar (1.500 x g) durante 5 min para lavar el pellet celular. Repita esta operación dos veces. Finalmente, deseche el sobrenadante y suspenda las células en 100 μL de 1x PBST.
3. Detección de células de microscopía
   1. Monte las celdas en una diapositiva; Tomar 2 μL de la solución celular del paso 7.2.2 y colocarla sobre un portaobjetos de vidrio. Cúbralo con un cubreobjetos.
   2. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia. Encienda la fuente de luz fluorescente, el microscopio y la computadora. Anote el número de fuente de luz fluorescente y abra el software del microscopio en la computadora.
   3. Coloque el portaobjetos en la plataforma del microscopio. Elija la lente del objetivo 40x y observe las celdas bajo la luz verde (550 nm). Mueva la perilla de enfoque grueso hasta que aparezca el contorno de las células de levadura. Mueva la perilla de enfoque fino para enfocar las celdas.
   4. Detecte las células con el software del microscopio. Cierre el campo de visión del microscopio y cambie a la pantalla del ordenador. Haga clic en En vivo, espere 3-5 s y haga clic en Capturar para tomar una foto. Guarde la imagen.
   5. Apague la computadora, el microscopio y la fuente de luz fluorescente.

8. Adquisición de datos: FACS

NOTA: La fluorescencia verde se detecta a través de la citometría de flujo (es decir, mediciones de clasificación celular activada por fluorescencia [FACS]). Las células de levadura se cultivan, en general, a 30 °C y 240 rpm para realizar experimentos FACS. Sin embargo, las células pueden exigir algunas precauciones dependiendo de su contenido genético. Las células que contienen el gen dCas12a-VPR (controlado por el promotor constitutivo GPD ) deben cultivarse durante 24 h en la solución SDC. Después, las células se diluyen en una proporción de 1:100 en SDC fresco y se cultivan durante otras 12 h antes de medir la intensidad de fluorescencia. Las células modificadas con el gen AcrIIA4-HBD (hER) también requieren dilución. Además, OD₆₀₀ necesita ser controlado. Primero, se permite que las células crezcan en SDC durante la noche (más de 14 h). Por la mañana, se mide OD₆₀₀ . Luego, el cultivo se diluye en SDC, suministrado con una concentración diversa de β-estradiol, hasta OD₆₀₀ = 0.1. Antes de los experimentos FACS, las células se cultivan durante otras 7 h de modo que OD₆₀₀ alcanza 0.8-1.0. Las células que expresan dCas9-VP64 o dCas12a-VP64 se cultivan en SDC durante 20-24 h sin dilución y crecimiento adicional antes de las mediciones en la máquina FACS.

1. Encienda la máquina FACS 20 minutos antes de las mediciones para calentar el láser.
2. Preparar las muestras (dilución): mezclar 20 μL del cultivo celular con 300 μL de_ddH2O.
3. Ejecute el software FACS en el ordenador conectado a la máquina FACS y cree un nuevo experimento. Establezca los parámetros de medición (es decir, FSC (SSC) - A / H / W e histograma).
4. Seleccione el filtro de acuerdo con las longitudes de onda de excitación y emisión de las muestras. Por ejemplo, la proteína objetivo aquí es yEGFP, cuyas longitudes de onda de excitación y emisión son 488 nm y 507 nm, respectivamente. Por lo tanto, seleccione el filtro FITC o GFP (longitud de onda de excitación: 488 nm; longitud de onda de emisión: 527/32 nm). Establezca el número de celda de adquisición en 10.000.
5. Ajuste el voltaje del filtro FITC midiendo la intensidad de las perlas fluorescentes. Asegúrese de que la diferencia relativa en la intensidad de las perlas entre dos experimentos consecutivos no supere el 5%.
6. Lave la máquina con_ddH2Odurante unos segundos para eliminar cualquier posible exceso de perlas.
7. Mida la intensidad de fluorescencia de la muestra. Haga clic en Vista previa y espere 3-5 s para la estabilidad de la inyección de la muestra. Finalmente, haga clic en Adquirir.
8. Mide las cuentas de nuevo al final del experimento. El voltaje es el que se utilizó durante la medición inicial de las perlas (ver paso 8.4, 438-441 V). Compruebe si la diferencia relativa entre las medidas de las dos perlas supera el 5%.
9. Exporte los datos FACS como archivos FCS.
10. Analice los archivos FCS con el software R Studio.

9. Análisis de datos

NOTA: Utilice el paquete Flowcore R Bioconductor ³² en R studio. Los archivos FCS se analizaron utilizando un script escrito en lenguaje R.

1. Abra R studio y cargue el script Bdverse analysis. R para analizar los archivos FCS.
2. Establezca el nombre del experimento (ename), el directorio (ruta) donde se encuentran los archivos FCS
   Almacenado (dir_d) y donde se crearán los archivos de resultados (dir_r).
3. Ajuste el canal de fluorescencia. Por ejemplo, select_ch = "GPA-A" si se midió la fluorescencia verde.
4. Establezca el número de muestras que se midieron (s_num).
5. Establezca las dimensiones de cada diagrama de puntos (sxlim, sylim). Establezca la longitud máxima de los ejes x e y para gráficos de barras y diagramas de caja (xlimit, ylimit). xlimit debe ser mayor o igual que s_num.
6. Elija el método de acceso eliminando el # de las líneas correspondientes.
   NOTA: morphGate es un método de activación automática llevado a cabo por el script (es decir, la región de los diagramas de puntos donde las celdas son más densas es reconocida y seleccionada por el programa). polygonGate y rectangleGate exigen observar los diagramas de puntos y definir los vértices de un polígono o el lado de un rectángulo que abarca la zona donde se encuentran la mayoría de las celdas.
7. Seleccione el objeto flowSet gated, correspondiente al método de gating elegido. Seleccione la resolución del diagrama de puntos (res; debe ser al menos igual a 256).
8. Quite el comentario flt_low <- filter_low(sp) para eliminar las mediciones en las que la fluorescencia es negativa. Uncomment flt_sp <- filter(flt_lw) para eliminar valores atípicos debido a otros experimentos.
9. Presione Source y ejecute el script. Todos los archivos que contienen los resultados del análisis se crean en dir_r.

Expresión de sgRNA/crRNA por un promotor de tipo ARN polimerasa III
Primero, este trabajo abordó la ingeniería del circuito de activación transcripcional (circuito 1) que se muestra en la Figura 1A. Contenía tres componentes básicos: 1) el gen que codifica para yEGFP (el informador), que fue precedido por una serie de diferentes promotores sintéticos que proporcionaron sitios objetivo para dCas9 / dCas12a-AD; 2) una versión optimizada para codones de levadura de dCas9 o dCas12a fusionada a un dominio de activación (VP64 y VPR, respectivamente) y que contiene una o dos secuencias de localización nuclear (NLS). Ambas proteínas dCas fueron producidas por un fuerte promotor constitutivo-pGPD; y 3) una secuencia de sgRNA/crRNA que guió a dCas9/dCas12a-AD a los sitios objetivo. La eficiencia de activación de los activadores basados en dCas9/dCas12a se visualizó y reflejó mediante la intensidad de fluorescencia del informador (medida a través de experimentos FACS).

Se probaron una proteína dCas9 (dSpCas9) y dos proteínas dCas12a (denAsCas12a y dLbCas12a). Se logró una activación de 3,36 veces con dSpCas9 extendido, en su extremo C, con el VP64 AD y la unión de un promotor sintético -aguas arriba de yEGFP- que contiene seis copias del sitio de destino lexOp. El sgRNA se colocó en un vector lanzadera integrador y se transcribió mediante el promotor SNR52 dependiente de la ARN polimerasa III (configuración SNR52i , ver Figura 1B). En el caso de dCas12a, denAsCas12a-VPR devolvió la activación más alta (4,45 veces) de un promotor sintético con tres operadores cuando el crRNA se expresó a través de la configuración SNR52i (Figura 1C). En las mismas condiciones, dLbCas12a-VPR logró su mejor mejora de fluorescencia (3,21 veces) (Figura 1D). Cabe señalar que el término de comparación, en cada experimento, era un circuito cuyo sgRNA/crRNA no podía unirse a los operadores lex.

Los plásmidos multicopia no son necesarios
El casete de expresión de sgRNA SNR52i fue reemplazado por una estructura RGR expresada por un promotor moderadamente fuerte-pADH1. Sin embargo, tanto en los casos de dCas9 como en los de dCas12a, la activación en presencia de un sgRNA/crRNA generado por la autoescisión de RGR parecía comparable o incluso inferior a la lograda con un sgRNA/crRNA producido a través de SNR52i, a pesar de que pSNR52 se consideraba un promotor débil (ver Figura 1C,D para los primeros resultados obtenidos con dCas12a).

Para explorar más a fondo la conexión entre la cantidad de sgRNA / crRNA y la eficiencia de activación, los dos sistemas de expresión de sgRNA / crRNA se insertaron en un plásmido episomal, que puede ser absorbido por la célula en 10-40 copias y generar una mayor cantidad de sgRNA / crRNA. Como se muestra en la Figura 2A, la activación por el ARNcr localizado en un plásmido integrativo (SNR52i o RGRi) fue de 1,4 a 2,4 veces mayor que la lograda cuando el mismo ARNcr fue expresado por un plásmido episomal (SNR52m o RGRm). La tendencia fue confirmada por el sgRNA. En este caso, el plásmido integrador garantizó una activación de 1,1 a 1,5 veces mayor (Figura 2B). Para excluir que los resultados fueran causados por una pérdida de los plásmidos episomales, se realizó RT-qPCR para cuantificar la abundancia relativa de sgRNA/crRNA in vivo. Los resultados, en la Figura 2C,D, verificaron que el vector episomal produjo un nivel mucho mayor de sgRNA/crRNA que el vector integrador, independientemente del sistema de expresión (RGR o SNR52). Estos resultados mostraron que el sistema SNR52 podría funcionar incluso mejor que el sistema RGR, y una mayor cantidad de sgRNA/crRNA en la célula no garantizaba una mayor activación por parte del sistema CRISPR-Cas. Por lo tanto, los plásmidos episomales no deben emplearse en la construcción de circuitos digitales de genes donde se utilizan dCas9/dCas12a-AD.

Andamio de ingeniería de ARN
Se diseñó un ARNsc extendiendo la secuencia de un ARNg con estructuras de horquilla MS2 que permitieron reclutar VP64 AD cuando se fusionó con la proteína de la capa MS2 (MCP, ver Figura 3A). De esta manera, no fue necesaria ninguna ingeniería ni modificación de dCas9. Se probaron dos variantes de MS2: wt y f6. El ARNsc que contenía la horquilla única MS2 -1×MS2(wt) y 1×MS2(f6)- dio una activación de 5,27 veces y una de 4,34 veces, respectivamente. Sin embargo, el ARNsc con una combinación de las dos horquillas, 2×MS2(wt+f6)- devolvió la activación general más alta en este estudio (7,54 veces, ver Figura 3B). Estos resultados demostraron que la ingeniería de un scRNA fue mucho más efectiva que fusionar cualquier dominio de activación con dSpCas9 directamente.

Puerta booleana basada en proteínas Acr
Para controlar y ajustar aún más la activación transcripcional mediante sistemas CRISPR-Cas, el circuito 1 se modificó con la inserción de una cuarta UT para la expresión de proteínas anti-CRISPR (ver Figura 4A para AcrIIAs y Figura 5A para AcrVAs). Después de demostrar que los Acrs eran efectivos, en S. cerevisiae, para contrastar la activación debida a dCas9/dCas12a-AD, se construyó un nuevo circuito (ver Figura 5D) para probar la acción de AcrVA en represores basados en dCas12a (un trabajo previo³³ ya había demostrado que los AcrIIAs podrían inhibir la regulación negativa del gen basado en dCas9). Las nuevas redes pequeñas que contienen Acr funcionaron como simples puertas booleanas (SÍ y NO), lo que podría conducir a un rediseño de la capa de entrada de circuitos digitales de genes sintéticos más complejos.

AcrIIA4 es un potente inhibidor de dSpCas9
Se utilizaron cuatro promotores diferentes con diversas fortalezas para impulsar la expresión de tres tipos de AcrIIs: AcrIIA2, AcrIIA4 y AcrIIA5. Los resultados mostraron que los tres AcrII funcionaron de manera dependiente de la dosis en S. cerevisiae. Cuando se expresaron por un promotor fuerte, pGPD, redujeron el nivel de fluorescencia alcanzado por dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64 a 0,21, 0,11 y 0,13 de su valor, respectivamente (Figura 4B). Dado que AcrIIA4 fue el único que causó una alta inhibición de la expresión de fluorescencia, incluso cuando fue producido por un promotor sintético débil, genCYC1t_pCYC1noTATA, pudimos inferir que AcrIIA4 fue el inhibidor más fuerte entre los tres AcrII. A continuación, el HBD(ER) se fusionó con el extremo C de AcrIIA4 para construir un dispositivo de detección de β-estradiol (véase la figura 4C). En presencia del estrógeno β-estradiol, AcrIIA4-HBD(ER) podría translocarse en el núcleo y luego neutralizar la función del activador basado en dSpCas9. La curva de valoración en la Figura 4D muestra que el circuito se comporta como una puerta NOT con una relación ON/OFF cercana a 2.3.

Los AcrVA son represores de las proteínas dCas12a
Se diseñó y construyó una puerta NOT insertando el casete de expresión AcrVA de conducción pGAL1 en el circuito 1. De esta manera, la síntesis de AcrVA, y la consiguiente represión de dCas12a-AD, podrían ser inducidas por galactosa (Figura 5A). Como se muestra en la Figura 5B,C, AcrVA1 obstaculizó tanto denAsCas12a como dLbCas12a como activadores al reducir la expresión de fluorescencia del 19% al 71%, dependiendo del esquema del circuito. AcrVA4 y AcrVA5 no pueden ejercer ninguna acción sobre denAsCas12a³⁴. Sin embargo, realizaron una fuerte inhibición de los activadores basados en dLbCas12a al reducir la expresión de fluorescencia hasta un 84% (AcrVA5) y un 82% (AcrVA4). En general, AcrVA5 resultó ser el más confiable, entre estos tres AcrVA, para inhibir activadores basados en dLbCas12a porque garantizaba, en diferentes circuitos, una represión superior al 70%.

La acción de AcrVA1 depende de la concentración
También se estudió la relación entre la concentración in vivo de AcrVA y sus efectos inhibitorios tanto sobre activadores como sobre represores basados en denAs/dLbCas12a. Para ello, cada AcrVA se expresó bajo diferentes promotores: el pGAL1 fuerte, el pTEF1 de fuerza media y el débil genCYC1t_pCYC1noTATA. Como se ilustra en la Figura 5E, AcrVA1 mostró grandes fluctuaciones en su rendimiento dependiendo del promotor que dirigió su síntesis. AcrVA1 funcionó razonablemente bien solo cuando fue producido por pGAL1. Bajo pTEF1 y genCYC1t_pCYC1noTATA, AcrVA1 mostró cierta represión solo en el dLbCas12a desnudo. AcrVA4 y AcrVA5, por el contrario, parecían ser menos sensibles a su concentración, especialmente cuando interactuaban con el dLbCas12a desnudo.

Estos datos mostraron que AcrVA4 y AcrVA5 generalmente funcionaron mejor que AcrVA1 en la inhibición de factores de transcripción basados en dLbCas12a en S. cerevisiae. Cabe destacar que AcrVA5 tiene un peculiar mecanismo de trabajo, ya que actúa como una enzima que modifica LbCas12a de forma permanente. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, AcrVA5 (junto con AcrVA4) no puede interactuar con denAsCas12a.

Cuando los AcrVA se expresaron bajo pGAL1, los circuitos se convierten en puertas SÍ (dCas12a se fusionó con un AD) o puertas NOT (dCas12a desnudo). El primero parecía tener un alto rendimiento, mientras que el segundo parecía funcionar mejor en presencia de AcrVA4 o AcrVA5.

Figura 1: Activación transcripcional mediada por dCas9/dCas12a-AD. (A) Diagrama del Circuito 1. Los promotores sintéticos de yEGFP contenían seis (6x) y tres (3x) copias de sitios objetivo para dCas9 o dCas12a, respectivamente. Después de eso, dCas9 / dCas12a-AD se combina con sgRNA / crRNA; El promotor sintético es dirigido y activado debido a la presencia de los dominios de activación. (B) La mejor eficiencia de activación de dSpCas9-VP64 se logró cuando había seis sitios objetivo lexOp en el promotor sintético, y el sgRNA fue transcrito por SNR52i. (C,D) La mayor eficiencia de activación de dCas12a-VPR se obtuvo cuando se insertaron tres copias de lexOp en el promotor sintético, y el crRNA fue generado por SNR52i. SNR52i significa que el sgRNA/crRNA fue producido por pSNR52, y el casete de expresión se colocó dentro de un vector lanzadera integrador. RGRi significa que se utilizó un plásmido integrador que aloja el casete RGR para expresar sgRNA/crRNA. El control negativo, "-", representa un sgRNA/crRNA que contiene una secuencia de espaciador codificado que no coincide con el sitio lexOp ni con ninguna secuencia a lo largo del genoma de la levadura. "bA" indica que el sgRNA/crRNA se une a la hebra antisentido del ADN diana, mientras que "bS" significa unir la cadena sensorial. Cada nivel de fluorescencia representa el valor medio de al menos tres experimentos independientes (es decir, llevados a cabo en días diferentes). Las barras de error son la desviación estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Comparación de sgRNA/crRNA integrativo y episomal productor de plásmidos. (A) Eficiencia de activación de dLbCas12a-VPR:crRNA cuando se dirige a un solo sitio en el promotor aguas arriba de yEGFP. (B) dSpCas9-VP64:sgRNA activado n× promotor sintético ("n" significa el número de sitios diana lexOp). (C,D) Nivel de expresión normalizado de sgRNA/crRNA^15,16. "i" significa que el casete de expresión sgRNA/crRNA se colocó en un vector lanzadera integrador, mientras que "m" significa plásmido multicopia (es decir, episómico). "bA"/"bS" indica que el sgRNA/crRNA se une a la hebra antisentido/sentido del ADN. "ctrl" es un control negativo, donde se expresó un sgRNA/crRNA codificado. Cada nivel de fluorescencia representa el valor medio de al menos tres experimentos independientes (es decir, llevados a cabo en días diferentes). Las barras de error son la desviación estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La eficiencia de activación del dSpCas9 desnudo en complejo con un scRNA. (A) El diagrama esquemático de las interacciones entre scRNA, MCP-VP64, y el dSpCas9 desnudo ¹⁶. La estructura en forma de tapa en púrpura representa MCP (proteína de la capa MS2). Una horquilla MS2 (la estructura púrpura en el scRNA) puede reclutar y unir dos copias de MCP. Por lo tanto, un scRNA permite no solo la unión al ADN por dSpCas9 sino también la activación de la expresión génica a través del reclutamiento de MCP-VP64. (B) La eficiencia de activación de dSpCas9:scRNA-MCP-VP64. Se probaron tres tipos de scRNA: uno que llevaba la horquilla MS2 de tipo salvaje-1×MS2 (wt), otro diseñado con el aptámero f6 MCP 1×MS2 (f6) y el último que contenía ambas horquillas-2×MS2 (wt + f6), que resultó ser el más eficiente. Cada nivel de fluorescencia representa el valor medio de al menos tres experimentos independientes (es decir, llevados a cabo en días diferentes). Las barras de error son la desviación estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Circuitos relacionados con AcrIIA y resultados. (A) El casete de expresión AcrIIA se insertó en el circuito 1. Esta TU adicional incluye pGPD que lidera la expresión de AcrIIAs para contrarrestar dSpCas9:scRNA_2×MS2(wt+f6)-MCP-VP64. (B) La eficiencia de inhibición de AcrIIAs en el mejor activador basado en dSpCas9 en la Figura 3B. La línea discontinua negra representa la fluorescencia en presencia del activador basado en dSpCas9. Las figuras sobre cada columna muestran la eficiencia de inhibición calculada como la relación OFF/ON (es decir, el nivel de fluorescencia en presencia del AcrIIA dividido por la fluorescencia en ausencia de cualquier AcrIIA). En la leyenda, la fuerza de los cuatro promotores constitutivos aumenta gradualmente de arriba hacia abajo. (C) Diagrama del dispositivo de detección de β-estradiol (NOT gate) que expresa AcrIIA4-HBD (hER). (D) Curva de valoración del circuito en (C)¹⁶. La curva verde se refiere al cambio en la fluorescencia en el circuito funcional. La curva negra se derivó de la cepa sin la expresión de AcrIIA4-HBD(hER)-el control negativo. La línea discontinua en gris marcaba la meseta de fluorescencia en el equilibrio. Se calculó como la media de los valores de fluorescencia a concentraciones de β-estradiol no inferiores a 125 nM. Cada nivel de fluorescencia representa el valor medio de al menos tres experimentos independientes (es decir, llevados a cabo en días diferentes). Las barras de error son la desviación estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Circuitos relacionados con AcrVA y resultados. (A) El casete de expresión de AcrVA se insertó en el circuito 1. La nueva TU contiene el promotor inducible pGAL1 aguas arriba de los genes AcrVA que neutralizan el funcionamiento de dCas12a-AD. El nuevo circuito es una puerta NO regulada por galactosa. (B,C) Resultados de la puerta NOT sensible a la galactosa en (A). Aquí, pGAL1 impulsa la síntesis de AcrVAs, que luego interactúan con dCas12a-AD¹⁵. La fluorescencia relativa corresponde a la relación OFF/ON. (D) Puerta SÍ sensible a la galactosa. Emplea AcrVAs bajo el control de pGAL1 y el dCas12as desnudo que reprime la síntesis de yEGFP. (E) Comparación de las eficiencias de inhibición de AcrVAs expresadas por promotores de diferente fuerza¹⁵. Los grupos "AcrV effects on repression" y "bare dLb" se refieren al circuito en (D). Los grupos "AcrV effects on activation" y "dLb-VPR" son los resultados de la puerta NOT en (A). Cada nivel de fluorescencia representa el valor medio de al menos tres experimentos independientes (es decir, llevados a cabo en días diferentes). Las barras de error son la desviación estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Una lista de todas las secuencias de ADN utilizadas en este estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Una lista de cebadores utilizados en este estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivos de codificación complementarios: el script de R studio para analizar los archivos FCS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

El protocolo mostró un posible flujo de trabajo completo para los circuitos digitales de genes sintéticos, siguiendo el ciclo de ingeniería biológica "Diseñar-Construir-Probar-Aprender" (DBTL) y con respecto a los experimentos de laboratorio seco y laboratorio húmedo. Aquí, nos centramos en el sistema CRISPR-Cas, principalmente dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a y las proteínas anti-CRISPR correspondientes, diseñando y construyendo en S. cerevisiae pequeñas redes transcripcionales. Algunos de ellos imitaban las puertas booleanas, que son los componentes básicos de los circuitos digitales. Todos los circuitos descritos aquí nos permitieron representar las propiedades y características de las proteínas asociadas a CRISPR y anti-CRISPR en S. cerevisiae. Estos resultados son esenciales para incluir estas proteínas en el esquema de los circuitos digitales de genes.

El concepto DBTL proporciona un marco en biología sintética, mientras que muchas optimizaciones y mejoras se realizarán después de probar un nuevo artefacto. Por ejemplo, en el circuito 1, inicialmente solo había un sitio de destino (una copia de lexOp) para dCas9/dCas12a-AD en el promotor sintético aguas arriba de yEGFP. Después de probar esa configuración de circuito, descubrimos que no podía lograr más que una activación doble^15,16. Entonces, asumimos que aumentando el número de copias de lexOp, como en⁷, podríamos alcanzar una mayor activación transcripcional. De hecho, se obtuvo un mayor nivel de fluorescencia mediante el uso de tres a seis sitios lexOp (Figura 1). Además, mejoramos aún más el rendimiento de los circuitos que alojan dSpCas9 mediante la ingeniería de un scRNA, que es más fácil que fusionar uno o más AD a una proteína grande como dSpCas9 (Figura 3). Además, al usar un promotor de diferentes fortalezas para producir los tres AcrIIAs que elegimos, concluimos que AcrIIA4 era el inhibidor más fuerte entre ellos. Por lo tanto, construimos una nueva puerta NOT sensible al β-estradiol fusionando el HBD (ER) con AcrIIA4 y explotando la fuerte represión de AcrIIA4 en nuestro mejor activador basado en dSpCas9 (Figura 4).

Del mismo modo, caracterizamos profundamente tanto el funcionamiento de denAsCas12a y dLbCas12a en levaduras como sus interacciones con tres AcrVA (Figura 5). Para cada par dCas12a-AcrVA, construimos una puerta NOT (dCas12a se fusionó con un AD) y una puerta SÍ (dCas12a desnuda) que responde a la galactosa. En general, dLbCas12a, junto con AcrVA5, resultó en el mejor sistema para calcular funciones lógicas simples.

El método descrito aquí presentó algunos pasos críticos. Todas las secuencias de ADN de proteínas fueron optimizadas para codones de levadura para asegurar una mayor expresión en S. cerevisiae. Para evitar dianas inespecíficas de dSpCas9/denAsCas12a/dLbCas12a en el genoma de S. cerevisiae , seleccionamos un operador bacteriano como lexOp. Además, las cepas que contienen el promotor GAL1 mostraron un retraso significativo en el crecimiento que podría limitar la aplicabilidad de pGAL1 a los circuitos génicos sintéticos¹⁵.

También se podrían introducir algunas modificaciones en algunos pasos del método general. Para mejorar la eficiencia del procedimiento de digestión-ligadura, es preferible digerir 10 μg (durante la noche) tanto del plásmido que contiene el inserto como de los vectores aceptores, en lugar de solo 5 μg en 1 h. De esta manera, se alcanza una mayor concentración de ADN después de la etapa de elución. El tiempo para la ligadura T4 debe extenderse de 1 h (protocolo del fabricante) a 8 h. Finalmente, las cepas que contienen la proteína de fusión dCas12a-VPR deben diluirse después de un cultivo de 24 h y cultivarse durante otras 12 h antes de realizar un experimento FACS. Bajo esta condición, la variabilidad entre los niveles de fluorescencia de diferentes células ya no es demasiado alta, y una desviación estándar aceptable acompaña al valor medio de la intensidad de fluorescencia sobre una población celular.

En resumen, este protocolo explicaba cómo simplificar el diseño de circuitos digitales de genes haciendo uso de proteínas dCas y, posiblemente, proteínas anti-CRISPR. Más importante aún, mostramos en detalle cómo funcionan estas familias de proteínas en S. cerevisiae y cuáles de ellas son las más prometedoras para un uso futuro dentro de las redes digitales. Un problema no resuelto es el acoplamiento de sistemas y productos químicos CRISPR-dCas/anti-CRISPR, que representan las entradas del circuito y no pueden unirse directamente a las proteínas dCas o anti-CRISPR. Aquí, evitamos el problema utilizando el promotor GAL1 inducible o el HBD (ER) conectado a AcrIIA4. Sin embargo, una forma de generalizar la arquitectura de la capa de entrada del circuito es necesaria para diseñar circuitos digitales de genes sintéticos para diferentes áreas de bioingeniería, como ingeniería metabólica, biosíntesis, biodetección, biodiagnóstico y biorremediación.

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Queremos agradecer a todos los estudiantes del laboratorio de Biología Sintética -SPST, TJU- por su ayuda general, junto con Zhi Li y Xiangyang Zhang por su asistencia en los experimentos de FACS.