Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae

Se describe un ensayo cualitativo para la adhesión de la levadura y la invasión de agar como una medida de la diferenciación y la invasión pseudohyphal. Este ensayo simple se puede utilizar para evaluar el fenotipo invasivo de distintos mutantes, así como las señales de los efectos ambientales y las vías de señalización en la diferenciación de la levadura.

Las levaduras se encuentran en las biopelículas naturales, donde muchos microorganismos colonizan las superficies. En ambientes artificiales, como las superficies de los objetos artificiales, los biofilms pueden reducir la productividad industrial, destruir las estructuras, y poner en peligro la vida humana. 1.3 Por otra parte, aprovechando el poder de biofilms pueden ayudar a limpiar el medio ambiente y la generación de energía sostenible. 8.4 La capacidad de S. cerevisiae para colonizar las superficies y participar en las biopelículas complejo fue ignorada hasta que el redescubrimiento de los programas de diferenciación provocada por diferentes vías de señalización y las señales ambientales en este organismo. 9, 10 El continuo interés en el uso de S. cerevisiae como organismo modelo para comprender la interacción y convergencia de las vías de señalización, como el Ras-PKA, MAPK Kss1 y Hog1 vías osmolaridad, pone rápidamente de S. cerevisiae en el cruce de la biopelícula la biología y la investigación de la transducción de señales. 20.11 En este sentido, la diferenciación de células de levadura en un largo, filamentos de adhesivo, se convirtió en pseudohyphal una lectura conveniente para la activación de vías de transducción de señales a los diversos cambios ambientales. Sin embargo, filamentación es un conjunto complejo de fenotipos, lo que hace analizando para ello, como si se tratara de un fenotipo engañoso simple. En la última década, varios ensayos se adoptaron con éxito de los estudios de biofilm de bacterias a la investigación de levadura, tales como los ensayos de la formación de MAT para medir la expansión de colonias en agar blando y cristal violeta para medir cuantitativamente la adherencia de la superficie celular. 12, 21 Sin embargo, ha habido cierta confusión en los ensayos desarrollados para evaluar cualitativamente los fenotipos adhesivo e invasiva de la levadura en agar. A continuación, presentamos un método sencillo y fiable para evaluar la calidad del adhesivo e invasiva de las cepas de levadura con fácil de entender, las medidas necesarias para aislar la evaluación de la adherencia de la evaluación de la invasión. Nuestro método, adoptado a partir de estudios anteriores, 10, 16 y afecta las células que crecen en medios líquidos y placas en las condiciones diferenciales de nutrientes para el crecimiento de grandes manchas, que luego lave con agua para evaluar la adhesión y frote las células completamente fuera de la superficie del agar para evaluar la invasión en el agar. Se elimina la necesidad de rayar las células en agar, que afecta a la invasión de las células en el agar. En general, hemos observado que las cepas haploides que invaden agar siempre adhesiva, sin embargo, no todas las cepas adhesivo puede invadir un medio de agar. Nuestro enfoque se puede utilizar en combinación con otros ensayos para analizar cuidadosamente los pasos y los requisitos de diferenciación de la transducción de señal de la levadura, la diferenciación, la detección de quórum, y la formación de biofilm.

1. Ponga 200ul de las culturas de creciente interés en las placas de los medios de comunicación sintética con las condiciones requeridas hambre (SC con glucosa al 2% frente al SC con 0,2% de glucosa, por ejemplo) Si la densidad de las culturas son muy diferentes el uno del otro, ajustar el recuento de células por cultivo 200ul por lo que cada gota tiene aproximadamente la misma cantidad de células.
2. Asegúrese de mantener registros de las que caen en las placas es que la cultura.
3. Mantenga la tapa entreabierta placa y dejar bien a temperatura ambiente oa 30 ° C hasta que las gotas se seca.
4. Placas de sellado con parafilm y envoltorio plástico (opcional) y dejar en 30 ° C durante 3-7 días.
5. Documentar el crecimiento de las células en las placas (por escáner, tomar una fotografía digital, etc)
6. Lavar las células de la superficie del agar con agua a alta presión (de preferencia agua DI) durante un minuto cuidando para el agar, no para levantar y cambiar la orientación.
7. Deshacerse del exceso de agua tocando las placas en papel toalla y dejarlos abiertos a secas.
8. Una vez que las placas se seca documento de adhesión en cada plato (mediante la exploración o la toma de fotografías digitales)
9. Células con un dedo enguantado y frote suavemente de forma la superficie del agar con agua corriente durante un minuto.
10. Secar las placas como antes.
11. Si se utiliza un microscopio de disección, retire la aguja antes de colocar las placas en la plataforma del microscopio.
12. Documento de la invasión con un aumento de 10x o 40x. Asegúrese de concentrarse en la parte media de cada círculo, para los bordes será demasiado llena para ver a morfologías celulares individuales. Los bordes pueden indicar el nivel de crecimiento filamentoso y pueden registrarse para referencia futura. Exploración o de tomar una fotografía digital de todo el plato también puede ser útil.

Las células de levadura mostrar los diversos modos de diferenciación de acuerdo a la disponibilidad de nutrientes y las condiciones ambientales, incluyendo la formación de esporas bajo condiciones de hambre y el estrés, filamentación en diversas tensiones de nutrientes, y la floculación. Levaduras diferentes, incluyendo S. cerevisiae y C. albicans, también se puede encontrar en los biofilms formados por un conjunto diverso de microorganismos. Aunque hay una cierta correlación con filamentación y comportamiento invasivo, no está claro exactamente cómo filamentación podría provocar la invasión y colonización de las superficies y los tejidos. Levadura sin duda se puede encontrar tanto en las formas vegetativas y filamentosas en las biopelículas en la naturaleza, así como lugares en los que amenazan la salud humana, tales como catéteres y órganos humanos infectados. 10.13 A fin de comprender las vías de señalización utilizadas por las levaduras para infectar a los animales y para participar en las biopelículas perjudiciales y beneficiosas, es necesario desarrollar ensayos accesible y confiable. Aquí hemos desarrollado un ensayo, adoptada a partir de la adhesión ya existentes y los ensayos de invasión para la levadura, que nos permiten determinar cualitativamente los fenotipos adhesivo e invasiva de las cepas de levaduras mutantes y en distintas condiciones. El ensayo que aquí se presenta elimina la necesidad de rayar las células de levadura en el agar, donde la mera acción de rayar la superficie del agar cambios las cualidades invasivas y el adhesivo de la levadura. Imágenes digitales de las células invasoras, especialmente mediante un microscopio permite semi-cuantitativo de la evaluación del grado de invasión y adhesión. Esa detección de células invasoras y el adhesivo es de cortesía en el agar de células individuales invasión de ensayo desarrollado por el laboratorio Sprague 9 y se puede adaptar para hacer experimentos curso.

Nos gustaría agradecer a Lisa Schneper y Duevel Katrin por sus ideas en el desarrollo de este ensayo.