Ex Utero Cultivo de embriones de ratón desde la pregastrulación hasta la organogénesis avanzada

Una plataforma mejorada para el cultivo de embriones enteros permite el desarrollo continuo y robusto ex utero de embriones de ratón postimplantación durante un máximo de seis días, desde las etapas de pregastrulación hasta la organogénesis avanzada. En este protocolo, detallamos el procedimiento estándar para el cultivo exitoso de embriones utilizando placas estáticas y sistemas de botellas giratorias.

Los métodos de cultivo de embriones de mamíferos postimplantación han sido generalmente ineficientes y limitados a breves períodos después de la disección fuera del útero. Recientemente se han desarrollado plataformas para el cultivo ex utero altamente robusto y prolongado de embriones de ratón desde las etapas de cilindro de huevo hasta la organogénesis avanzada. Estas plataformas permiten un desarrollo adecuado y fiel de embriones pregastrulantes (E5.5) hasta la etapa de formación del miembro posterior (E11). Los embriones de gastrulación tardía (E7.5) se cultivan en botellas giratorias en estos entornos, mientras que el cultivo extendido de las etapas de pregastrulación (E5.5 o E6.5) requiere una combinación de cultivos de botellas estáticas y giratorias. Además, la regulación sensible de la concentración de _O2 y _CO2 , la presión del gas, los niveles de glucosa y el uso de un medio de cultivo ex utero específico son críticos para el desarrollo adecuado del embrión. Aquí, se proporciona un protocolo detallado paso a paso para el cultivo extendido de embriones de ratón ex útero. La capacidad de cultivar embriones de ratón normales ex utero desde la gastrulación hasta la organogénesis representa una herramienta valiosa para caracterizar el efecto de diferentes perturbaciones experimentales durante el desarrollo embrionario.

El desarrollo intrauterino del embrión de mamífero ha limitado el estudio de las primeras etapas del desarrollo postimplantacional1,2. La inaccesibilidad del embrión en desarrollo dificulta la comprensión de los procesos clave de desarrollo que ocurren después de que el embrión se implanta en el útero, como el establecimiento del plan corporal animal, la especificación de las capas germinales o la formación de tejidos y órganos. Además, el tamaño muy pequeño del embrión postimplantado temprano dificulta la observación por imágenes intravitales en el útero antes de E103. La incapacidad de observar y manipular embriones vivos en estas etapas ha restringido el estudio de la embriogénesis postimplantacional temprana a instantáneas durante el desarrollo.

Los protocolos para el cultivo in vitro de embriones de mamíferos preimplantacionales están bien establecidos, son confiables y se utilizan regularmente4. Sin embargo, los intentos de establecer sistemas de cultivo ex utero capaces de soportar el crecimiento adecuado de embriones postimplantacionales de mamíferos tuvieron un éxito ^limitado5. Desde hace más de un siglo se han propuesto diversas técnicas de cultivo, principalmente mediante el cultivo de los embriones en placas estáticas convencionales6,7,8 o botellas giratorias (cultivos con rodillos)^5,9,10. Estas plataformas demostraron ser útiles para ampliar el conocimiento sobre el desarrollo de los mamíferos después de la ^{implantación11,12}, a pesar de ser altamente ineficientes para la supervivencia embrionaria normal y limitadas a períodos cortos. Los embriones comenzaron a mostrar retraso en el desarrollo y anomalías morfológicas tan pronto como 24-48 h después del inicio del cultivo.

Este estudio proporciona una descripción detallada para configurar el sistema de cultivo embrionario ex utero que permite el desarrollo continuo desde la pregastrulación hasta las etapas avanzadas de organogénesis durante hasta seis días de desarrollo postimplantacional13. Este artículo describe el protocolo mejorado de cultivo de rodillos que apoya el crecimiento de embriones E7.5 (placa neural y etapa de pliegue de la cabeza) hasta la etapa de formación de la extremidad posterior (~ E11) y el cultivo extendido de E5.5 / E6.5 mediante la combinación de cultivo en placas estáticas y plataformas de cultivo de rodillos.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices de Protección Animal del Instituto Weizmann de Ciencia y fueron aprobados por el IACUC pertinente del Instituto Weizmann (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Se pidió a las mujeres embarazadas sanas que dieran su consentimiento informado para recolectar sangre de su cordón umbilical, según lo aprobado por el Comité del Centro Médico Rambam Helsinki (#RMB-0452-15). A los adultos sanos se les pidió su consentimiento informado para que se recolectara sangre de acuerdo con las pautas del Comité del Instituto Weizmann de Ciencias de Helsinki (# 1566-3).

1. Preparación de los medios

1. Preparar el medio de disección utilizando 500 ml de Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco sin rojo fenol y L-glutamina, complementado con suero bovino fetal al 10%, 5 ml de penicilina/estreptomicina, y esterilizar con filtro con un filtro de 0,22 μm.
   NOTA: Mantenga el medio de disección a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
2. Prepare el medio de cultivo embrionario ex utero (EUCM) fresco todos los días de cultivo dentro de una campana biológica utilizando el 25% del medio embrionario más el 50% de suero de rata y el 25% de suero de sangre de cordón umbilical humano (HCS) o suero de sangre humana para adultos (HBS).
3. Para preparar el medio embrionario, agregue 5 ml de glutamina, 5 ml de HEPES y 5 ml de penicilina/estreptomicina en 500 ml de DMEM sin rojo fenol y L-glutamina. Preparar alícuotas de 10-15 ml y almacenarlas a 4 °C durante un máximo de dos meses.
   NOTA: Duplique la concentración de antibióticos si experimenta alguna contaminación.
4. Inactivar térmicamente el suero de rata a 56 °C durante 30-45 min y filtrar a través de un filtro de difluoruro de polivinilideno de 0,22 μm. Use el suero para cultivo el mismo día de la inactivación. Descongele HCS o HBS y úselo inmediatamente para experimentos.
   NOTA: El suero comercial para ratas proporciona resultados consistentes (se probaron un mínimo de 4 lotes sin variación evidente). Alternativamente, se puede obtener suero para ratas de alta calidad internamente como se describió ^{anteriormente8,14}. Si HCS no está disponible, reemplácelo con HBS recolectado internamente. El suero de rata, HCS y HBS se pueden volver a congelar una vez y mantenerse a -20 ° C para su uso en un día diferente. Descongele y combine el suero recongelado con un mayor volumen de suero recién descongelado y no lo vuelva a congelar.

2. Recolección de suero sanguíneo del cordón umbilical humano y suero sanguíneo humano adulto

1. Para aislar el HCS, recolecte sangre del cordón umbilical de mujeres embarazadas sanas el día del parto por cesárea programado.
   1. Pinza doble el cordón umbilical a 5-7 cm del ombligo y transecta entre las pinzas inmediatamente después del parto del bebé.
   2. Extraiga sangre manualmente con una aguja de 14 G de gran diámetro y una jeringa de 50 ml directamente de la vena umbilical mientras la placenta permanece in situ para evitar cualquier rastro de hemólisis.
      NOTA: Recolectar sangre después de que el bebé sea retirado del campo de la cirugía, y la sangre umbilical ha sido extraída para pruebas clínicas.
2. Dispensar la sangre recolectada a tubos de ensayo estériles procoagulantes de 5 ml y transferirlos inmediatamente a 4 °C durante 15 minutos para permitir una coagulación completa. Centrifugar los tubos de ensayo coagulados a 2.500 × g durante 10 min a 4 °C.
3. Deseche los tubos que muestran signos de hemólisis (suero rosa-rojo). Recoger el suero (color amarillo) con una pipeta de 5 ml y filtrarlo a través de un filtro de 0,22 μm. Inactivar el suero inmediatamente en un baño de agua a 56 °C durante 45 min.
4. Prepare 1-1.5 ml de alícuotas del suero inactivado y guárdelas a -80 °C durante un máximo de seis meses. Si es necesario, envíe a -70 °C con hielo seco.
5. Para la recolección de suero sanguíneo humano en adultos, extraiga sangre de adultos sanos y aísle inmediatamente el suero siguiendo el mismo protocolo descrito para el suero de sangre de cordón umbilical. Guarde el HBS como alícuotas inactivadas por calor y filtradas a -80 °C durante un máximo de seis meses.
   NOTA: El suero del cordón umbilical humano y el suero humano adulto preparado recién hecho internamente dieron resultados superiores al suero disponible comercialmente. Recolectar HCS de mujeres sanas, mayores de 18 años y menores de 40 años programadas para el parto por cesárea. Excluya a las mujeres que dieron a luz vaginal y a las mujeres con cualquier enfermedad crónica o afecciones médicas activas, incluida la diabetes gestacional o la hipertensión.

3. Cultivo con rodillos ex utero de embriones de E7.5 a E11

1. Instalación de la incubadora de cultivo de rodillos y el regulador de gas
   1. Cultivo E7.5 o embriones más avanzados utilizando el sistema de incubadora de cultivo con rodillos. Encienda el rotador y la unidad de calentamiento a 37 °C durante al menos 1 h antes de las disecciones embrionarias. Agregue agua en autoclave a la botella de entrada de gas y al tubo de ensayo de salida.
      NOTA: Coloque un termómetro adyacente al tambor giratorio y verifique con frecuencia la estabilidad de la temperatura dentro de la incubadora. Abra la incubadora lo más rápido posible, ya que el tiempo de apertura prolongado aumentará la temperatura y afectará el desarrollo del embrión. Cuando sea necesario, agregue más agua en autoclave a la botella de entrada de gas y al tubo de ensayo de salida para mantenerlos a un mínimo de la mitad de su capacidad durante el cultivo. Proteja los embriones dentro de la incubadora de la luz cubriendo la incubadora con un paño.
   2. Encienda el módulo regulador de gas presionando el interruptor principal y, posteriormente, encienda los controladores de oxígeno/nitrógeno y _CO2 (Figura 1A). Ajuste los valores de oxígeno y _CO2 al 5% utilizando los controladores respectivos. Abra el regulador de gas y ajuste la presión del gas a ~ 6.5-7 libras por pulgada cuadrada (psi) moviendo el interruptor de voltaje en el transmisor de presión (Figura 1B). Confirme el valor de la presión del gas mediante un manómetro digital.
   3. Controle el flujo de gas comprobando la tasa de burbujas creadas dentro del tubo de ensayo lleno de agua de salida asignado dentro de la incubadora de precisión. Ajuste la velocidad de burbuja adecuada cerrando / abriendo la válvula de flujo de gas en la tapa de la botella de agua. Asegúrese de que el flujo de gas permita la formación de burbujas a una velocidad de 2-4 burbujas por segundo o establezca el flujo de burbujas en el primer punto donde el burbujeo sale al tubo de salida lleno de agua.
   4. Llene las botellas de cultivo con 2 ml de medio de cultivo y conéctelas al tambor giratorio ahuecado para la preequilibración durante 1 h. Use los tapones de silicio ahuecados para sellar las botellas al tambor. Mantenga sellados los espacios vacíos en el tambor giratorio utilizando los tapones sólidos.
      NOTA: La ausencia de burbujas en el tubo de salida (sin gas que entre por el sistema) o un flujo de gas excepcionalmente alto pueden afectar el desarrollo embrionario. En el caso de una falta de flujo de burbujas al tubo de ensayo de salida, verifique que todos los tapones de silicio estén colocados correctamente en el tambor giratorio y selle el sistema, y verifique que la botella de agua esté cerrada correctamente y que todos los tubos estén conectados correctamente. La falta de burbujeo que entra en la botella de agua puede indicar un mal funcionamiento en el regulador de gas.
2. Disección de embriones de ratón de ratones preñados
   1. Preequilibrar el medio de disección dentro de una incubadora a 37 °C y 5% de _CO2 durante un mínimo de 1 h. Deje la tapa ligeramente abierta para permitir el intercambio de gases.
   2. Sacrificar a la hembra embarazada por luxación cervical, limpiar el abdomen de la hembra con etanol al 70% y cortar la piel y la pared abdominal con tijeras. Localice un extremo del útero y corte en la intersección entre el ovario y el útero. A continuación, corte a lo largo del útero hasta el otro extremo y transfiéralo a una placa de Petri de 100 mm llena de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco a temperatura ambiente.
      NOTA: Se recomienda el uso de hembras no preparadas con hormonas y apareadas naturalmente.
   3. Lave rápidamente los conceptos en DPBS y córtelos en pares para facilitar el manejo de embriones. Mueva todos los pares de conceptuses a un medio de disección preequilibrado en una placa de Petri de 60 mm y córtelos en conceptuses individuales.
   4. Retire la pared uterina de los conceptuses rasgando el tejido uterino con un par de fórceps gruesos. Use pinzas microquirúrgicas finas para cortar la punta de la decidua en forma de pera. Inserte los fórceps junto al embrión paralelos a su eje largo y abra los fórceps para dividir la decidua en mitades.
   5. Finalmente, deje el cono ectoplacental intacto unido al cilindro de huevo agarrando el embrión de la decidua y pelando el saco vitelino parietal del embrión con fórceps finos.
      NOTA: Para evitar afectar al embrión, realice disecciones en un microscopio equipado con una placa calefactora a 37 °C en un plazo máximo de 30-40 min. Diseccionar una camada de embriones a la vez.
   6. Inmediatamente después de la disección, transfiera los embriones a una nueva placa llena de medio de disección equilibrado utilizando una pipeta Pasteur de vidrio para evitar que los embriones se peguen a los restos de tejido.
   7. Seleccione aquellos embriones en la etapa de placa neural / pliegue temprano de la cabeza que no muestren daño en el epiblasto y transfiera 5-6 embriones por botella a las botellas de cultivo de vidrio preequilibradas.
      NOTA: Para preparar la pipeta Pasteur de vidrio, corte la abertura de la pipeta a un tamaño adecuado para que quepa los embriones utilizando un cortador de vidrio, y manténgala en etanol para evitar la contaminación. Lave la pipeta de vidrio con PBS antes de transferir embriones. Al transferir los embriones al frasco de cultivo, asegúrese de llevar el menor volumen posible del medio de disección para evitar diluir el EUCM.
   8. Coloque las botellas en el sistema de cultivo giratorio a 37 °C, en una atmósfera de 5% de _O2 y 5% de _CO2.
   9. Cada día de cultivo, retire las botellas una por una de la incubadora para evaluar el desarrollo embrionario bajo un estereomicroscopio. Asegúrese de cerrar el orificio vacío en el tambor con un tapón sólido al retirar una botella. Cortar la punta de una pipeta Pasteur de plástico estéril para que se ajuste al tamaño del embrión y mover los embriones a una placa de Petri para facilitar la observación. Asegúrese de que los embriones estén siempre cubiertos por medio.
      NOTA: Minimizar el tiempo durante el cual los embriones están fuera de la incubadora para evitar efectos perjudiciales en los embriones debido a una disminución de la temperatura corporal. Manipule los embriones con cuidado para evitar la ruptura de los vasos sanguíneos del saco vitelino, lo que afecta la supervivencia del embrión.
   10. En el día de cultivo 1 (equivalente a E8.5), transfiera grupos de 3 embriones a un nuevo frasco con 2 ml de EUCM fresco y preequilibrado que contenga 3 mg/ml adicionales de D-glucosa y una mezcla de gases de 13% de _O2, 5% de _CO2.
   11. Después de 48 h (equivalente a E9.5), transfiera grupos de dos embriones a una nueva botella con EUCM fresco precalentado más 3,5 mg/ml de glucosa en una atmósfera gaseosa de 18% _O2 y 5% _CO2.
   12. A las 72 h de cultivo (equivalente a E10,5), mover cada embrión a un frasco individual que contenga 1,5-2 ml de medio fresco suplementado con 4 mg/ml de glucosa y un suministro de gas de 21% de _O2 y 5% de _CO2.
       NOTA: Los embriones alcanzan su máximo crecimiento alrededor de la medianoche del día 4 de cultivo.
   13. Use fórceps finos para eliminar el saco vitelino y el amnios, y desprenda el cordón umbilical para la observación adecuada de la morfología embrionaria. Apague el módulo de regulación de gas y la incubadora de precisión.
       NOTA: Preequilibrar el medio de cultivo durante 1 hora mediante incubación dentro de una botella de vidrio en el cultivo de rodillos con una atmósfera de gas adecuada según la etapa embrionaria. Limpie las botellas de cultivo y toda la cristalería de la incubadora después de cada uso realizando tres lavados con agua destilada corriente seguida de un lavado nocturno sumergido en etanol al 70%. Vuelva a lavar tres veces con agua destilada corriente, deje que las botellas se sequen durante la noche y esterilize en autoclave. Del mismo modo, autoclave los tapones de silicio regularmente. Limpie a fondo todas las herramientas de disección con etanol al 70% y esterilícelas en seco.

4. Cultivo embrionario extendido de E5.5/E6.5 a E11

1. Cultivo de embriones de pregastración (E5.5) y gastrulación temprana (E6.5) hasta la etapa temprana de somita (E8.5) en placas estáticas.
2. Preequilibrar el medio de disección durante 1 h en una incubadora con 5% de _CO2 a 37 °C.
   NOTA: Para permitir el intercambio de gases, no cierre la tapa del tubo por completo.
3. Prepare las placas de cultivo agregando 250 μL de EUCM recién preparado a cada pozo. Coloque las placas dentro de una incubadora de _CO2 a 37 °C para el preequilibrio.
   NOTA: Aunque las placas de 8 pocillos son adecuadas para el crecimiento embrionario, el cultivo se puede hacer en cualquier otra placa ajustando el volumen del medio de acuerdo con el tamaño de la placa.
4. Diseccionar embriones de cilindro de óvulo fuera del útero siguiendo la técnica descrita para E7.5. Retire el saco vitelino parietal del embrión y deje el cono ectoplacental intacto unido al cilindro del huevo.
5. Transfiera embriones individuales a cada pocillo de la placa de 8 pocillos usando una micropipeta y coloque la placa dentro de la incubadora con un 5% de _CO2 a 37 ° C.
6. Imagine los embriones bajo un estereomicroscopio y seleccione para el cultivo solo aquellos con una cavidad amniótica bien formada, sin daños evidentes y sin la membrana de Reichert.
   NOTA: Utilice puntas de pipeta de 20 μL para transferir embriones E5.5 y puntas de 200 μL para transferir embriones E6.5. En el caso de cultivos a partir de E6.5, HCS puede ser reemplazado por HBS recién recolectado.
7. Retire la mitad del medio y agregue 250 μL de EUCM precalentado recién preparado después de 24 h de cultivo, asegurando que los embriones estén siempre inmersos en el medio de cultivo. En el caso de cultivos a partir de E5.5, después de dos días de cultivo (equivalente a E7.5), retire 200 μL y agregue 250 μL de nuevo EUCM.
   NOTA: Durante el cultivo estático, los embriones pueden adherirse a la placa (principalmente cuando se usan placas de plástico), lo que comprometerá gravemente el desarrollo embrionario. La unión del embrión a la placa es más frecuente en el primer día de cultivo de embriones E5.5. Para evitar la fijación, empuje cuidadosamente los embriones lejos de la superficie de la placa con fórceps finos y estériles. Verifique que solo el cono ectoplacentario permanezca unido a la superficie de la placa.
8. Transferir los embriones al cultivo con rodillos en la etapa temprana de somita (4-7 somitas; después de tres días de cultivo para embriones explantados a E5.5 y dos días para cultivos iniciados en E6.5), siguiendo las mismas indicaciones descritas anteriormente para embriones en etapa E8.5.
   NOTA: La transferencia de los embriones al cultivo con rodillos en etapas de somita diferentes a las indicadas anteriormente da como resultado el fracaso del desarrollo posterior. A diferencia de los cultivos ex utero de E7.5, es posible mantener los embriones en una atmósfera constante de 21% de oxígeno y 5% de _CO2, proporcionando una eficiencia ligeramente mayor de desarrollo embrionario que las atmósferas con concentración dinámica de oxígeno.

Las condiciones de cultivo con rodillos descritas para embriones E7.5 (etapa de gastrulación tardía) apoyan un crecimiento embrionario constante y normal con una eficiencia promedio cercana al 75% después de 4 días de cultivo (Figura 2 y Tabla 1). La eficiencia del desarrollo embrionario puede variar entre diversos antecedentes genéticos de ratón, pero es consistentemente robusta (Figura 2C). La suplementación con HBS en lugar de HCS produce una eficiencia de ~ 68% después de 4 días de cultivo ex utero , dependiendo de los antecedentes genéticos de los ratones (Figura 2D y Tabla 2). Los embriones desarrollados ex utero recapitulan el desarrollo adecuado hasta aproximadamente la etapa 44-somita. Después, los embriones presentan anomalías embrionarias debido a la ausencia de la placenta alantoica, lo que resulta en una oxigenación y suministro de nutrientes insuficientes dado el aumento del tamaño corporal en esta etapa.

El desarrollo de embriones E6.5 (raya temprana) en placas estáticas se recapitula correctamente con una eficiencia de >90% hasta el estadio temprano de somite E8.5, utilizando EUCM con HCS y HBS (Figura 3, Tabla 3 y Tabla 4) (^ver8,13 para una descripción detallada de la estadificación embrionaria entre E5.5 a E8.5). El cultivo ex utero desde la gastrulación hasta la organogénesis avanzada mediante la combinación de cultivos en placas estáticas seguidos por el cultivo de rodillos en una atmósfera de oxígeno constante del 21% da una eficiencia estimada de desarrollo adecuado del 55% y 26% a la etapa de 44 somitas, utilizando HCS y HBS, respectivamente (Figura 3A, Tabla 3 y Tabla 4). Hay un retraso de 1-2 pares de somitas en estos embriones en comparación con los embriones desarrollados en el útero. La mayor caída en la eficiencia ocurre en la transición de E8.5 a E9.5 debido a la falla del giro axial y el cierre del tubo neural.

Los cultivos a partir de embriones pregastrulantes de E5.5 muestran una eficiencia de desarrollo adecuado hasta la etapa temprana de somita (E8.5) de aproximadamente el 46%, y casi el 17% de los embriones completarán el desarrollo adecuado después de seis días de cultivo después de ser transferidos al cultivo con rodillos (Figura 4 y Tabla 5). El cultivo ex utero extendido prolonga el retraso en el desarrollo de los embriones, con embriones explantados a E5.5 que muestran un retraso de 2-4 pares de somitas en comparación con los embriones in vivo . Sin embargo, la morfogénesis y el desarrollo tisular proceden adecuadamente hasta aproximadamente la etapa de 42-somita.

Los defectos más comunes observados en los embriones para cultivos iniciados a partir de E7.5, E6.5 y E5.5 se ejemplifican en la Figura 5A-C. En el momento de la disección, los embriones con daños incluso menores en el epiblasto o la región extraembrionaria, así como los embriones que conservan la membrana de Reichert, deben descartarse. Del mismo modo, los embriones tempranos no crecerán adecuadamente (ver Figura 5B para embriones muertos) o mostrarán retrasos severos en el desarrollo (ver Figura 5B para un embrión retrasado). La unión del epiblasto embrionario a la superficie de la placa afectará el desarrollo dependiendo de la posición y el grado de unión. La unión de una parte del epiblasto o de todo el embrión causará el fracaso de un mayor desarrollo (ver Figura 5B para un embrión adjunto).

Las principales anomalías observadas en el porcentaje de embriones defectuosos en E8.5 (etapa temprana de somita) son el desarrollo de la región posterior fuera del saco vitelino o defectos en el crecimiento de los pliegues neurales (Figura 5A, B). En el caso de los cultivos iniciados en E5.5, un defecto de desarrollo observado con frecuencia es la presencia de un epiblasto pequeño y subdesarrollado (Figura 5C). En el tiempo equivalente a E9.5, los defectos en el cierre de los pliegues neurales, la falla del giro axial o una deficiencia en el crecimiento cerebral representan las anomalías más comúnmente observadas (Figura 5). Los defectos de desarrollo observados con mayor frecuencia en E10.5/E11 son anomalías en la región de la cabeza, interrupción de la circulación sanguínea normal en el saco vitelino y derrame pericárdico (Figura 5). La ruptura de un vaso sanguíneo principal y la salida de sangre pueden causar la muerte posterior del embrión. En particular, el crecimiento adecuado del embrión en sí podría alcanzarse incluso en ausencia de circulación evidente del saco vitelino. Los embriones mantenidos en cultivo más allá de la etapa equivalente a E11 exhiben contracción corporal y muerte después de unas pocas horas debido a la falta de oxigenación adecuada de los tejidos.

Figura 1: Sistema de regulación de gas y presión adaptado a una incubadora de cultivo de rodillos. (A) Vista superior del módulo de regulación de gas conectado a la incubadora de cultivo de rodillos. El _N2 y el _CO2 entran en el regulador de gas para permitir un control preciso de las concentraciones de oxígeno/_CO2 y la presión del gas. Los gases se dirigen hacia la caja de mezcla, en la que se mezclan mediante un soplador centrífugo y se inyectan en la incubadora mediante una bomba que genera presión positiva. El gas fluye a través de la entrada en una botella de agua y más tarde a las botellas selladas. (B) Configuración interna del módulo electrónico para la regulación de gas y presión. El valor de voltaje establecido en el transmisor de presión regula la presión generada por la bomba dentro de la caja de mezcla de gas (5-6 V para alcanzar una presión de 6-7 psi en este modelo específico). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La plataforma de cultivo ex utero apoya el crecimiento de embriones E7.5 hasta la organogénesis avanzada. (A) Diagrama que representa el protocolo de cultivo de embriones ex utero E7.5. (B) Imágenes representativas de campo brillante de grupos de embriones cultivados que se desarrollan ex utero durante 4 días, desde la gastrulación tardía (E7.5) hasta la etapa de 44 somitas (E11). Se indica la variación típica en el número de somitas evaluada cada 24 h. Barras de escala = 500 μm. (C, D) Porcentaje de embriones desarrollados normalmente a 1-4 días de cultivo a partir de E7.5 dividido por cepas parentales de ratón y suplementación sérica (C, suero sanguíneo del cordón umbilical humano; D, suero sanguíneo humano adulto). El Grupo A ha sido modificado de ¹³. Abreviaturas: EUCM = medio de cultivo embrionario ex utero ; HCS = suero sanguíneo del cordón umbilical humano; HBS = suero sanguíneo humano adulto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Protocolo de cultivo ex utero extendido para el cultivo de embriones de ratón de gastrulación temprana de E6.5 hasta la organogénesis tardía. (A) Ilustración esquemática del protocolo de cultivo ex utero extendido que combina placas estáticas y sistemas de botellas giratorias. (B) Imágenes de campo brillante de embriones cultivados ex utero durante cinco días desde E6.5 hasta la etapa de 44 somitas. Se indica la variación típica en el número de somitas evaluada cada 24 h. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cultivo continuo ex utero de embriones de ratón de pregastración desde E5.5 hasta etapas tardías de organogénesis. (A) Representación esquemática del cultivo ex utero el protocolo para embriones E5.5. (B) Imágenes representativas de campo brillante de embriones cultivados ex utero durante seis días desde E5.5 hasta la etapa de 42 somitas. Se indica la variación típica en el número de somitas evaluada cada 24 h. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Defectos representativos del desarrollo observados en embriones cultivados ex utero. (A-C) Imágenes de microscopía de campo brillante de embriones de ratón anormales cultivados ex utero a partir de E7.5 (A), E6.5 (B) o E5.5 (C). Se proporciona una descripción general del defecto en cada imagen. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Eficiencia del desarrollo adecuado de embriones aislados a E7,5 días post coitum. Los embriones se cultivaron ex utero durante 4 días en EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). [-] indica cultivos no continuados debido a requisitos experimentales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Eficiencia del desarrollo adecuado de embriones aislados en E7.5, cultivados ex utero durante 4 días, reemplazando el Suero Sanguíneo del Cordón Umbilical Humano por suero Sanguíneo Humano Adulto recién aislado. [-] indica cultivos no continuados debido a requisitos experimentales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Eficiencia del desarrollo adecuado de embriones (B6D2F1/ICR) aislados a E6.5 y cultivados ex utero durante 5 días utilizando EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). El cultivo ex utero se realizó en cultivo estático durante dos días (21% _O2) seguido de tres días en botellas rotativas al 21% _O2. [-] indica cultivos no continuados debido a requisitos experimentales. Abreviatura: NA = no adquirido. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Eficiencia del desarrollo adecuado de embriones (B6D2F1/ICR) aislados en E6.5 y cultivados ex utero durante 5 días utilizando EUCM (reemplazando Human Umbilical Cord Blood Serum con Human Adult Blood Serum recién aislado). Los embriones se desarrollaron en cultivo estático durante dos días (21% _O2) seguidos de tres días en botellas giratorias al 21% _O2. [-] indica cultivos no continuados debido a requisitos experimentales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Eficiencia del desarrollo adecuado de embriones (B6D2F1/ICR) aislados a E5.5 y cultivados ex utero durante 6 días utilizando EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). Los embriones se desarrollaron en cultivo estático durante tres días (21% _O2) seguidos de tres días en botellas giratorias al 21% de _O2. [-] indica cultivos no continuados debido a requisitos experimentales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

El protocolo de cultivo presentado aquí puede mantener un desarrollo embrionario de ratón adecuado y continuo ex utero durante un máximo de seis días, desde E5.5 hasta E11. Anteriormente, los embriones en estas etapas de desarrollo podían desarrollarse normalmente en cultivo solo por períodos cortos (hasta 48 h)¹⁵. El acoplamiento del módulo de regulación de gas a la incubadora de cultivo de rodillos para un control preciso de la concentración de oxígeno y la presión de gas hiperbárico es fundamental para el cultivo adecuado de embriones de ratón descrito en este documento. El aumento de la presión del gas a 7 psi mejora la difusión de oxígeno, permitiendo el desarrollo embrionario hasta E11 en una atmósfera de hasta 21% de _O2/5% de _CO2, en contraste con las condiciones empleadas anteriormente de 95% de _O216, que pueden ser perjudiciales para el embrión a largo plazo. Además, se sabe que la concentración de oxígeno desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario, ya que la embriogénesis postimplantacional temprana tiene lugar en condiciones ^hipóxicas17. En consecuencia, el cultivo exitoso de embriones de gastrulación tardía requiere una atmósfera inicial de _O2 del 5%, con un aumento dinámico en la concentración de oxígeno a medida que el embrión crece. Sorprendentemente, el cultivo de embriones pre/gastrulados tempranos en cultivo estático al 5% de _O2 disminuyó drásticamente la eficiencia del desarrollo embrionario adecuado en comparación con el 21% de _O2, y no pudieron desarrollarse más allá de E9.5. Esto último podría explicarse por la menor velocidad de difusión de nutrientes y oxígeno a través de los tejidos embrionarios en el cultivo estático en comparación con el cultivo en botellas ^{rotativas1,10}.

Además, el alto contenido de suero sanguíneo de cordón umbilical de rata y humano proporciona resultados más consistentes para el crecimiento de embriones postimplantados tempranos que los medios suplementados con solo suero de ^rata13,18. Es importante destacar que el suero utilizado para el cultivo de embriones debe prepararse a partir de sangre recién extraída. Aunque el suero de rata de alta calidad para el cultivo de embriones enteros está disponible comercialmente, el suero humano debe aislarse internamente. La suplementación con suero sanguíneo del cordón umbilical humano puede ser reemplazado por suero aislado de sangre humana adulta, que es ampliamente accesible y aún proporciona un crecimiento embrionario consistente y eficiente.

El desarrollo embrionario exitoso y eficiente ex utero también depende en gran medida del aislamiento preciso del embrión. En primer lugar, el procedimiento de disección debe realizarse en medio de disección calentado a 37 °C, y los embriones disecados deben transferirse a los frascos/placas de cultivo en un plazo de 30 min. En segundo lugar, el aislamiento preciso del embrión de la decidua y la eliminación de la membrana de Reichert sin dañar el epiblasto es clave para obtener una alta eficiencia del desarrollo embrionario. En tercer lugar, solo los embriones en la etapa adecuada deben seleccionarse para el cultivo, ya que los embriones tempranos / retrasados no crecerán adecuadamente.

El manejo de los embriones durante la transferencia es otro punto esencial durante el cultivo ex utero , principalmente después del desarrollo del saco vitelino embrionario. Los embriones deben transferirse con cuidado porque el daño a los vasos sanguíneos principales del saco vitelino podría afectar el desarrollo adecuado. En general, cuanto más largo sea el período de cultivo embrionario, menor será la eficiencia del desarrollo embrionario normal, es decir, los embriones explantados en E7.5 se desarrollarán con mayor eficiencia que los explantados en E6.5 o E5.5. Además, la presencia de antibióticos en el medio es fundamental para evitar la contaminación si no se dispone de un microscopio de disección asignado dentro de una campana biológica.

No se puede descartar que otras plataformas, niveles de presión o condiciones puedan permitir resultados similares o mejorados a los resultados obtenidos con el presente protocolo. Se necesita una mayor optimización de las condiciones descritas en este estudio para alcanzar una eficiencia del desarrollo embrionario igual a la observada por el desarrollo intrauterino. Además, el desarrollo futuro de un medio libre de suero definido podría ayudar a definir los requisitos metabólicos y químicos específicos durante el desarrollo de embriones de mamíferos y reducir la variabilidad sérica de lote a lote. La necesidad de una mezcla constante de nutrientes y gases después de E8.5 utilizando el cultivo de botellas giratorias en la configuración actual limita las capacidades de imagen a largo plazo durante las etapas de organogénesis. El desarrollo futuro de dispositivos de microfluídica que permitan la mezcla de gases y nutrientes en cultivos estáticos acoplados a configuraciones de microscopía podría ayudar a superar este desafío.

Los embriones cultivados ex utero pueden manipularse experimentalmente y mantenerse en cultivo hasta etapas avanzadas de organogénesis fuera del útero. Previamente demostramos la capacidad de introducir diversas perturbaciones en embriones en desarrollo, como la manipulación genética por electroporación o infección lentiviral, imágenes vivas, injertos celulares y estudios teratogénicos13. En última instancia, esta plataforma puede ayudar a descubrir la especificación del destino celular y los mecanismos de formación de órganos en mamíferos al permitir la experimentación en tiempo real en embriones de ratón vivos durante hasta seis días de desarrollo postimplantacional temprano.

J.H.H es asesor de Biological Industries Ltd y ha presentado una solicitud de patente que cubre las condiciones de cultivo estático y de rodillos descritas en este documento (presentada por J.H.H. y el Instituto Weizmann de Ciencias). Otros autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Este trabajo fue financiado por Pascal e Ilana Mantoux; Consejo Europeo de Investigación (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Consejo de Investigación Médica de Auxiliares de Vuelo (FAMRI); Cátedra del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel (ICRF), BSF, Instituto Helen y Martin Kimmel para la Investigación de Células Madre, Premio Helen y Martin Kimmel a la Investigación Innovadora; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, el Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella and Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.