Análisis citométrico de flujo de biomarcadores apoptóticos en células de cáncer de cuello uterino SiHa tratadas con actinomicina D

La apoptosis se puede caracterizar mediante el análisis citométrico de flujo de biomarcadores apoptóticos tempranos y tardíos. La línea celular de cáncer cervical, SiHa, se analizó en busca de biomarcadores de apoptosis después del tratamiento con actinomicina D utilizando un citómetro de flujo de sobremesa.

Los biomarcadores de apoptosis se investigaron en células de cáncer de cuello uterino SiHa tratadas con actinomicina D utilizando un citómetro de flujo de sobremesa. Los biomarcadores tempranos (anexina V y potencial de membrana mitocondrial) y los biomarcadores tardíos (caspasas 3 y 7, y daño al ADN) de la apoptosis se midieron en cultivos experimentales y control. Los cultivos se incubaron durante 24 horas en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de_CO2. Luego, las células se separaron usando tripsina y se enumeraron mediante un ensayo de recuento de células por citometría de flujo. Las células se analizaron más a fondo para la apoptosis utilizando un ensayo de anexina V, un ensayo de potencial transmembrana electroquímico mitocondrial, un ensayo de caspasa 3/7 y un ensayo de daño en el ADN. Este artículo proporciona una visión general de la apoptosis y la citometría de flujo tradicional, y elabora protocolos citométricos de flujo para procesar y analizar células SiHa. Los resultados describen datos experimentales positivos, negativos y subóptimos. También se discuten la interpretación y las advertencias en la realización del análisis citométrico de flujo de la apoptosis utilizando esta plataforma analítica. El análisis citométrico de flujo proporciona una medición precisa de los biomarcadores tempranos y tardíos para la apoptosis.

La apoptosis, clasificada como muerte celular programada tipo 1¹, asegura un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular². La apoptosis es esencial durante el desarrollo humano, después de la lesión y para la prevención de enfermedades como el cáncer³. Las vías de señalización de muerte celular apoptótica intrínseca y extrínseca⁴ causan cambios intracelulares bioquímicos y morfológicos secuenciales ^2,5,6. Las características apoptóticas morfológicas pueden ser identificadas por microscopía, y la perturbación bioquímica puede ser analizada por ensayos bioquímicos, incluyendo citometría de flujo (FC)⁷.

El análisis citométrico de flujo para identificar la apoptosis y comprender los mecanismos intracelulares asociados ha florecido en las últimas dos décadas⁸. La FC es una metodología científica que analiza células en un fluido que pasa a través de láseres monocanal o multicanal (Figura 1)9,10,11. Las células en el fluido se enfocan en una sola fila por el sistema fluídico del citómetro de flujo utilizando enfoque hidrodinámico. A medida que las células pasan a través del láser, la luz se dispersa o se emite desde las células. La luz dispersa puede estar en la dirección hacia adelante (dispersión hacia adelante) o hacia el lado (dispersión lateral) y proporciona información sobre el tamaño de la celda y la granularidad de la celda o las estructuras internas, respectivamente.

Además, los reactivos fluorescentes, como los colorantes fluorescentes o los anticuerpos marcados con fluoróforos, detectan estructuras o moléculas específicas de superficie o intracelulares. Cuando el láser excita los fluoróforos, la luz se emite a una longitud de onda específica. Los detectores, comúnmente tubos fotomultiplicadores, cuantifican la luz dispersa y emitida de las muestras celulares. Los detectores producen una corriente cuantificable que es proporcional a la dispersión de luz y la emisión de fluorescencia. La salida electrónica se convierte en señales digitales mediante software informático para identificar poblaciones celulares basadas en el tamaño celular, la granularidad celular y la fluorescencia celular relativa de las moléculas marcadas con fluoróforos 9,12,13.

Figura 1: Esquema que describe el funcionamiento técnico y el flujo de trabajo de la citometría de flujo tradicional. Las células se tiñen con reactivos fluorescentes y se sondean con un láser. Las señales de fluorescencia generadas se detectan y se convierten en una salida electrónica, que se digitaliza y analiza mediante software informático y programas estadísticos. Abreviaturas: FSC = dispersión hacia adelante; SSC = dispersión lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La FC se utiliza tanto en investigación como en diagnósticos de salud. Los dos objetivos de la CF en necrobiología son la elucidación de las propiedades moleculares y funcionales de la muerte celular y la discriminación de varios modos de muerte celular 14,15,16,17,18. Las aplicaciones de FC incluyen enumeración celular, clasificación de poblaciones celulares, inmunofenotipado, detección de biomarcadores (por ejemplo, biomarcadores de apoptosis), estudios de toxicidad e ingeniería de proteínas¹². Además, la CF se aplica comúnmente al diagnóstico de salud para ayudar con el diagnóstico y monitoreo de pacientes con neoplasias hematológicas. Los avances en instrumentación, detección de fluoróforos y sistemas detectores están ampliando las aplicaciones de FC para incluir citometría de imágenes, citometría de masas y citometría espectral con aplicaciones de investigación más amplias¹².

El análisis citométrico de flujo de la apoptosis proporciona ventajas sobre las técnicas tradicionales utilizadas en la evaluación de la salud celular. FC puede analizar muchas células individuales en una muestra heterogénea de forma rápida y reproducible para estimar la apoptosis ^3,5. La capacidad de la CF para proporcionar información cuantitativa sobre fenotipos celulares sobre una base celular individual, y evitar el análisis a granel, ofrece una sensibilidad superior a Western blotting, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), fluorometría y técnicas de espectrofotometría utilizadas en el análisis de la apoptosis ^8,19. Además, la relativa facilidad del análisis de CF en contraste con los pasos manuales engorrosos y poco reproducibles de Western blots y ELISA es ventajosa. Por lo tanto, el análisis reproducible, preciso y de alto rendimiento de la CF es beneficioso en la investigación del cáncer²⁰.

La FC también permite el análisis simultáneo de parámetros del ciclo celular para poblaciones de células apoptóticas sanas y anormales²¹. Como la apoptosis es un proceso dinámico, diferentes métodos pueden producir resultados variables y dependen del momento en que las células son cosechadas²². La evaluación cuantitativa simultánea de múltiples parámetros del fenotipo celular permite la detección de subpoblaciones menores con alta precisión, por ejemplo, se pueden detectar subconjuntos celulares raros con una baja frecuencia de 0,01%²³. El análisis multiparamétrico de FC es especialmente útil ya que la muerte apoptótica ocurre a lo largo de un espectro de cambios bioquímicos tempranos y tardíos con células en varios puntos a lo largo del continuo apoptótico. Por ejemplo, el uso de tinción dual utilizando anexina V y yoduro de propidio en el análisis de FC de células apoptóticas permite la categorización de células apoptóticas tempranas, células apoptóticas tardías y células muertas²⁴. La detección precisa de la apoptosis en múltiples etapas evita la clasificación errónea y los resultados falsos negativos. Por lo tanto, el análisis multiparamétrico por FC mejora la especificidad general de la detección de fenotipos celulares y evita la clasificación errónea de poblaciones menores. Además, la clasificación celular por FC permite el aislamiento de poblaciones celulares con alta pureza para su posterior análisis⁷.

La desventaja de la CF incluye el uso de células en suspensión, lo que puede ser un desafío en el análisis de tejidos, ya que la desagregación del tejido en células puede alterar la función celular¹⁹. Además, la falta de estandarización de la configuración del instrumento FC, el análisis de datos y los informes de ensayo puede causar variación en los resultados¹⁹, enfatizando la necesidad de capacitar de manera óptima a los operadores de FC para realizar, analizar y reportar datos. Por ejemplo, la capacidad de FC para discriminar verdaderos desechos apoptóticos de núcleos apoptóticos requiere i) configuraciones de adquisición adecuadas, ii) el uso de perlas de calibración para identificar un pico de ADN diploide, y iii) controles celulares negativos y positivos que son específicos de la célula³. Además, el análisis multiparamétrico está limitado por el número de detectores, y es necesario realizar una compensación óptima para evitar resultados no específicos y el desbordamiento de la emisión fluorescente cuando se utilizan múltiples reactivos fluorescentes²⁵. Los avances en la tecnología de instrumentos y fluoróforos han mejorado la detección de parámetros a 30 parámetros¹².

La identificación de la muerte celular apoptótica no siempre es sencilla⁷, y se deben considerar biomarcadores sensibles y específicos. El Comité de Nomenclatura sobre Muerte Celular (NCCD) recomienda que se utilice más de un ensayo para estudiar y cuantificar el proceso de apoptosis²⁶. El análisis microscópico para las características apoptóticas clásicas²⁶ también se recomienda para confirmar la apoptosis y evitar resultados falsos positivos⁷. Cuatro características bioquímicas cardinales que abarcan eventos apoptóticos tempranos y tardíos son (1) pérdida de asimetría de la membrana celular; (2) disipación del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm); (3) activación de caspasas; y (4) daño en el ADN²⁶.

Durante la apoptosis temprana, la fosfatidilserina se exterioriza a la membrana celular externa 27 y puede ser detectada por la anexina V marcada fluorescentemente con ficoeritrina^27,28,29. Además, la tinción dual con el colorante fluorescente de unión al ADN, 7-aminoactinomicina D (7-AAD), distingue células vivas, apoptóticas tardías y muertas. Por lo tanto, las células apoptóticas tempranas se tiñen positivas para la anexina V y negativas para la 7-AAD, en contraste con las células apoptóticas tardías, que se tiñen positivas para ambos colorantes²⁴.

Las señales apoptóticas intrínsecas inducen la disipación del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm). El ΔΨm interrumpido provoca la liberación de proteínas proapoptóticas tempranas desde el espacio intermembrana mitocondrial hacia el citosol^27,29,30. El cambio en ΔΨm se puede evaluar mediante tinción dual con el colorante lipofílico cargado positivamente, éster etílico de tetrametilrodamina, TMRE y 7-AAD. El colorante TMRE se acumula dentro de la membrana interna de las mitocondrias intactas cuando el potencial de membrana es alto. Las mitocondrias despolarizadas demuestran una disminución de la fluorescencia. Las células vivas con mitocondrias polarizadas (membrana mitocondrial intacta) se tiñen positivas para TMRE y negativas para 7-AAD. Las células muertas con mitocondrias despolarizadas se tiñen negativas para TMRE y positivas para 7-AAD³¹.

Las caspasas son una familia de proteasas intracelulares que, cuando se activan, señalan y ejecutan la apoptosis^26,27. Las caspasas del verdugo terminal (3,6,7) efecto apoptosis tardía 29,32,33. Las actividades de las caspasa-3 y -7 se pueden medir mediante un sustrato marcado con fluorescencia, que, cuando se escinde, se une al ADN y emite una señal fluorescente. Además, cualquier compromiso con la integridad de la membrana celular se puede evaluar mediante tinción con 7-AAD. Las células apoptóticas se tiñen positivas para el tinte de unión al ADN pero negativas para 7-AAD. Las células apoptóticas tardías y muertas se tiñen positivas para ambos colorantes³⁴.

La apoptosis tardía se caracteriza por daño en el ADN^27,29,35, que puede evaluarse mediante la quinasa mutada fosforilada de ataxiatelangiectasia (ATM) y la histona H2A.X. Las roturas de ADN bicatenario (DSB) causan fosforilación de H2A.X. Anticuerpos marcados con fluorescencia contra ATM y H2A. X puede determinar el daño del ADN. Detección negativa tanto de ATM como de H2A. X indica que no hay daño en el ADN, mientras que la detección de ambos colorantes indica la presencia de roturas de doble cadena en el ADN³⁶.

La actinomicina D es un potente inductor de la apoptosis y actúa uniéndose al ADN para bloquear los eventos de transcripción y traducción³⁷. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la apoptosis bioquímica inducida por actinomicina D en la línea celular SiHa mediante el análisis de biomarcadores de apoptosis en etapa temprana y tardía. Cuatro biomarcadores bioquímicos de apoptosis evaluaron los pasos secuenciales en la cascada apoptótica que incluyeron la pérdida de asimetría de la membrana celular, el cambio en el potencial de la membrana mitocondrial, la activación de caspasas terminales y el daño al ADN.

NOTA: Este protocolo describe los pasos en la preparación celular, la enumeración celular, la tinción celular y el análisis de células SiHa tratadas con actinomicina D utilizando ensayos comerciales de citometría de flujo medidos y analizados en un citómetro de flujo de sobremesa (Figura 2).

Figura 2: Flujo de trabajo para la detección de biomarcadores apoptóticos bioquímicos mediante citometría de flujo. Las células se cultivan y tratan como se describe en el paso 1.1 del protocolo. (1) Las células se cultivan, (2) se enumeran y (3) se tiñen con reactivos fluorescentes, y (4) se analizan mediante un citómetro de flujo de sobremesa. Los datos se almacenan aún más y se analizan estadísticamente. Abreviaturas: 7-AAD = 7-aminoactinomicina D; PBS = solución salina tamponada con fosfato; PE = Ficoeritrina; TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación de cultivos celulares y tratamientos para citometría de flujo

NOTA: Asegúrese de que se sigue la técnica aséptica al manipular cultivos celulares.

1. Cultivar cultivos celulares en un ambiente humidificado de CO2 a 37 °C con 5% de_CO2. Asegúrese de que el cultivo celular sea aproximadamente 70% confluente en el matraz original antes de pasar las células para experimentos.
2. Retirar el medio del matraz, lavar las células con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y añadir 500 μL de tripsina para desprender las células. Después de que las células comiencen a redondearse y desprenderse del matraz, golpee bruscamente la base del matraz en el banco para separar las celdas. Luego neutralice la tripsina agregando aproximadamente 5 ml de medio de cultivo fresco suplementado con 10% de suero fetal de ternera antes de contar las células.
3. Células semilla a 15.000 células/ml en 3 ml de medio de cultivo celular en una placa de cultivo celular de 6 pocillos. Incubar las placas de cultivo durante la noche a 37 °C con 5% de_CO2 para permitir la unión de las células al fondo del pozo.
4. Tratar los cultivos experimentales con 100 ng/mL de actinomicina D y los controles de medio y disolvente con medio de cultivo fresco y dimetilsulfóxido (DMSO), respectivamente, durante 24 h. Recoja el medio gastado en un tubo de 15 ml y lave las celdas con 1x PBS. A partir de entonces, agregue el lavado 1x PBS al tubo y luego agregue 500 μL de tripsina al pozo. A continuación, neutralice la tripsina agregando 5 ml de medio de cultivo fresco.
   NOTA: (1) La incubación prolongada de tripsina o la neutralización incompleta pueden digerir las células y comprometer su membrana celular, lo que puede sesgar los resultados. Además, también puede cambiar la asimetría de la membrana celular y, por lo tanto, la accesibilidad a la fosfatidilserina. (2) Las células que se han desprendido y flotado a la superficie pueden incluirse en el análisis posterior centrifugando el medio eliminado a 300 × g durante 5 min y resuspendiendo las células en un medio de cultivo fresco.

2. Enumeración de células mediante el ensayo de viabilidad

1. Pipetear 450 μL de yoduro de propidio en un tubo de microcentrífuga. Añadir 50 μL de la suspensión celular al tubo de microcentrífuga. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 5 min. Enumerar las células por citometría de flujo (ver sección 4).
2. Diluir todas las muestras a una concentración de 1 × 10⁶ células/ml con medio de cultivo celular antes de proceder a los ensayos de apoptosis.

3. Tinción de células para citometría de flujo

NOTA: No se requieren condiciones estériles para esta parte del protocolo.

1. Detección de la externalización de fosfatidilserina mediante anexina V
   1. Añadir 100 μL de suspensión celular en un tubo de microcentrífuga. Añadir 100 μL de una mezcla 1:1 de anexina V conjugada fluorescente y reactivo 7-AAD. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min, protegido de la luz.
2. Análisis de la despolarización de la membrana mitocondrial
   1. Centrifugar 100 μL de la suspensión celular a 300 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
   2. Resuspender las células en 1 ml de 1x PBS, añadir 100 μL de solución de tinción TMRE a cada muestra y mezclar la suspensión mediante un suave pipeteo hacia atrás.
   3. Incubar las células durante 20 min en un ambiente humidificado de_CO2 a 37 °C. Envuelva las muestras en papel de aluminio limpio para protegerlas de la luz.
      NOTA: El potencial de la membrana mitocondrial es un marcador funcional que es sensible a cambios menores en el entorno celular. Por lo tanto, las muestras deben incubarse y medirse en condiciones idénticas (temperatura, pH y tiempo transcurrido entre el inicio de la incubación y la medición fluorescente) para mantener la reproducibilidad). Además, tenga en cuenta que la protección inadecuada de las muestras contra la luz causa fotoblanqueo de los fluoróforos, lo que resulta en una fluorescencia emitida falsamente baja.
   4. Después de la incubación, añadir 5 μL de la solución de tinción 7-AAD a cada muestra y mezclar. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
3. Detección de caspasa-3 y -7 terminales activadas utilizando sustrato de caspasa DEVD
   NOTA: Las siguientes soluciones se preparan antes de realizar este ensayo.
   1. Diluir el péptido de unión al ADN unido a DEVD en DMSO a una proporción de 1:8 con 1x PBS estéril para hacer que la solución de detección de caspasas funcione. Conservar la solución en hielo o a 2-8 °C, protegida de la luz.
      NOTA: Cada muestra requerirá 5 μL de esta solución.
   2. Agregue 2 μL de una solución madre de 7-AAD a 148 μL de 1x PBS para hacer que la solución de trabajo de 7-AAD. Conservar la solución en hielo o a 2-8 °C, protegida de la luz.
      NOTA: Cada muestra requerirá 150 μL de esta solución.
   3. Centrifugar 50 μL de la suspensión celular durante 5 min a 300 × g. Deseche el sobrenadante. Resuspender las células en 50 μL de 1x PBS, seguido de 5 μL de la solución de trabajo de detección de caspasas. Homogeneizar.
   4. Aflojar la tapa de los tubos e incubar durante 30 min en un ambiente humidificado de_CO2 a 37 °C, protegido de la luz. Añadir 150 μL de la solución de trabajo 7-AAD a cada muestra y mezclar. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
4. Detección de roturas de ADN de doble cadena y daño total del ADN
   1. Centrifugar 50 μL de la suspensión celular durante 5 min a 300 × g. Deseche el sobrenadante.
   2. Resuspender las células en 500 μL de 1x PBS. Añadir 500 μL de un tampón de fijación a base de formaldehído y mezclar. Incubar las muestras en hielo durante 10 min.
   3. Centrifugar durante 5 min a 300 × g y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 90 μL de 1x PBS en un tubo de microcentrífuga. Añadir 10 μL de la solución de anticuerpos al tubo de microcentrífuga. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
   4. Añadir 100 μL de 1x PBS y centrifugar durante 5 min a 300 × g. Deseche el sobrenadante. Resuspender las células en 200 μL de 1x PBS.

4. Coloque muestras en el citómetro de flujo.

1. Verifique el rendimiento analítico del citómetro de flujo ejecutando el kit de verificación del sistema del instrumento. No continúe con la ejecución de muestras hasta que se hayan completado y superado todas las comprobaciones.
2. Localice el ensayo deseado navegando por el catálogo de ensayos preprogramados en el instrumento y seleccione Ejecutar ensayo.
   1. Mezclar la muestra retropipeteando suavemente antes de cargar la muestra en el citómetro de flujo.
      NOTA: La mezcla adecuada asegura que las células permanezcan en suspensión y evita recuentos bajos de células.
   2. Primero, cargue una muestra de control negativo en el citómetro de flujo y seleccione Ejecutar (ajustar configuración) para que el instrumento comience a aspirar la muestra y proporcione una vista previa en tiempo real de los eventos detectados. Consulte la Tabla de materiales para conocer el nombre y los detalles del instrumento.
   3. Usando la vista previa en vivo, ajuste los umbrales de fluorescencia y tamaño de celda y dibuje una puerta rectangular alrededor de la población celular. Arrastre el marcador de umbral para excluir los desechos celulares. Seleccione Siguiente (Establecer perfil de estado) para continuar.
      NOTA: Es importante conocer el tamaño de las celdas. Arrastre los controles deslizantes y observe los cambios en cómo se trazan los eventos detectados en la vista previa en tiempo real, ya que esto informará una selección precisa de los umbrales. Si los desechos celulares no se excluyen en esta etapa, no se pueden eliminar en los análisis posteriores a la adquisición.
   4. Toque y arrastre los marcadores del cuadrante para separar las poblaciones de celdas y para que el instrumento trace los eventos detectados en tiempo real. Utilice estos gráficos para guiar al usuario final sobre la colocación adecuada de los marcadores de cuadrante. Seleccione Siguiente (Verificar muestras) para continuar de modo que el instrumento muestre un resumen de la configuración. Después de revisar la configuración, seleccione Siguiente (Verificar configuración) para aplicar esta configuración a todas las muestras del experimento.
      NOTA: El instrumento proporciona una vista previa en vivo de 2 minutos de las celdas utilizadas para ajustar la configuración del instrumento. Si este límite de tiempo expira, el instrumento liberará la muestra, y los pasos 4.2.2-4.2.4 deberán repetirse. Retire la muestra y mezcle bien antes de volver a cargar y continuar.
   5. Puerta a una población de celdas dibujando una región alrededor de la población celular. Ajuste los umbrales de fluorescencia y tamaño de celda utilizando los controles deslizantes ubicados en los ejes x e y de la vista previa en vivo. Aplique esta configuración para todas las muestras del experimento.
   6. Mezclar la primera muestra retropipeteando suavemente y cargar la primera muestra en el citómetro de flujo y seleccionar Siguiente. Asigne un nombre al ejemplo y seleccione Ejecutar para que el sistema comience a ejecutarlo.
      NOTA: El instrumento sólo puede ejecutar una muestra a la vez.
   7. Una vez que se hayan ejecutado todas las muestras, guarde el experimento dándole un título apropiado. Guarde la configuración del experimento actual para recuperarla en futuras ejecuciones (opcional).

5. Análisis posterior a la adquisición

1. Si es necesario, realice ajustes finos de puertas o marcadores de cuadrante después de la adquisición.
2. Localice el experimento que necesita ajustes navegando por el explorador de archivos del sistema y abra el experimento.
3. Toque la vista previa en miniatura de la trama para ampliarla. Toque en las esquinas superior izquierda o inferior derecha de la puerta de la celda para ajustar las dimensiones de la puerta. Para ajustar los marcadores del cuadrante, toque la intersección de las líneas verticales y horizontales para mover los marcadores tal como están. Para ajustar el ángulo de cualquiera de las líneas, toque la línea y arrastre el controlador.
4. Ajuste los marcadores (como se describió anteriormente en los pasos 4.1.3-4.1.4) como desee y aplique esta configuración a todas las muestras del experimento seleccionando el icono de marca de verificación , marcando todas las muestras y seleccionando Aceptar.

6. Análisis estadístico

1. Realizar pruebas por triplicado y realizar un análisis de varianza (ANOVA) con una prueba de Bonferroni post-hoc para evaluar diferencias significativas entre las muestras tratadas y los controles.
   NOTA: La prueba estadística de elección depende del investigador y de las variables que se analizan.

Los resultados del recuento de células y la viabilidad (Figura 3) mostraron que el 95,2% de las células de la muestra estaban vivas y el 4,8% estaban muertas. La concentración total de células en la muestra original fue de 6,20 x 10⁶ células/ml.

El ensayo de anexina V y muerte celular (Figura 4) mostró un aumento significativo (p < 0,0001) en células apoptóticas en células SiHa tratadas con 100 ng/mL de actinomicina D en comparación con los controles. Debido a que la tinción de anexina V aumenta en las células durante la apoptosis en etapa temprana, este hallazgo sugiere que 100 ng / ml de actinomicina D indujo apoptosis en células SiHa.

El ensayo de potencial transmembrana electroquímico mitocondrial (Figura 5) demostró una disminución significativa (p < 0,0001) en los perfiles de salud celular (vivo, despolarizado y vivo, despolarizado y muerto, muerto) entre actinomicina D, control del medio y control del disolvente. Estos datos sugieren que 100 ng/mL de actinomicina D indujeron la despolarización mitocondrial en las células SiHa.

El ensayo de caspasa 3/7 (Figura 6) demostró una activación significativa (p < 0,0001) de las caspasas 3 y 7 en células SiHa tratadas con 100 ng/mL de actinomicina D en comparación con los controles. Este hallazgo demuestra que 100 ng/mL de actinomicina D indujeron apoptosis en células SiHa.

El ensayo de daño del ADN (Figura 7) mostró que 100 ng/mL de actinomicina D indujeron significativamente (p < 0,0001) marcadores de daño en el ADN, ATM y H2A. X, en células SiHa. Este hallazgo sugiere un aumento significativo en el daño del ADN en las células SiHa tratadas con actinomicina D.

Los resultados de experimentos subóptimos (Figura 8) demuestran consideraciones analíticas en todos los ensayos. La concentración celular afecta la precisión de los datos. En la Figura 8A, el recuento de células es inaceptablemente bajo. Las poblaciones de células cerradas en los 4 cuadrantes del diagrama de puntos tienen baja intensidad de señal. El fabricante optimiza el ensayo para 300-700 células/μL en el volumen de muestra final. Este ejemplo ilustra la importancia de utilizar la concentración de muestra correcta prescrita por el fabricante.

Además, las altas concentraciones celulares también causaron resultados erróneos (Figura 8B). Los cultivos medios y experimentales demostraron 99.95% y 100% de células vivas, respectivamente. El caudal para ambos ensayos superó la concentración optimizada del fabricante de 100-500 células/μL y requirió dilución con 1x tampón de ensayo para evitar análisis inexactos.

Debe evitarse la aglutinación celular durante la preparación de cultivos experimentales, ya que produce resultados falsos debido al aumento de los índices de tamaño celular, como se ilustra en el ensayo de la anexina V. La Figura 8C muestra un doble problema de alta concentración de células que excede las instrucciones del fabricante y aglutinación celular, como lo demuestran los índices de tamaño de celda superiores a 4 en el control de medio SiHa. La alta concentración celular se ilustra con el enchapado de células que forman un plano rojo brillante de células en cultivos medios, lo que demuestra poblaciones de células apoptóticas discordantemente altas.

La tinción prolongada de cultivos puede dar lugar a una unión no específica de proteínas y dar lugar a resultados falsos, como se demuestra en el ensayo de anexina V. La Figura 8D muestra resultados similares para cultivos medianos y experimentales debido a la tinción prolongada.

El manejo deficiente de la muestra, la tripsinización prolongada de las células adherentes, el pipeteo vigoroso durante los pasos de lavado y los pasos de centrifugación prolongada y de alta velocidad causan lisis celular y altas cantidades de desechos celulares. En la Figura 8E, los cultivos analizados por el ensayo de caspasa 3/7 demuestran un aumento de los desechos celulares evidenciado por un índice de tamaño de células pequeñas (índice de tamaño de células <2.2). Por lo tanto, se debe tener cuidado al preparar muestras para la adquisición de datos.

Figura 3: Recuento de células y ensayo de viabilidad. El perfil de la población separa los desechos de las células vivas y muertas. El diagrama de puntos bidimensional está cerrado y divide las poblaciones de células vivas y muertas. El panel de información proporciona datos cuantitativos sobre el recuento de células, el porcentaje del total de células viables y el número total de células viables en la muestra. Estos datos se pueden utilizar para estandarizar el recuento de células en todas las muestras para análisis posteriores de apoptosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Ensayo de anexina V. Todas las muestras muestran parámetros de compuerta idénticos, y el análisis estadístico de cada subpoblación revela un aumento significativo de la apoptosis en las células tratadas con actinomicina D. Todos los ensayos se realizaron como tres experimentos independientes, y cada experimento se ensayó por triplicado. Los datos se presentan como media ± DE, y p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Ensayo de potencial transmembrana electroquímico mitocondrial. Todas las muestras muestran parámetros de activación idénticos, y el análisis estadístico de cada subpoblación revela una perturbación significativa en el potencial de membrana mitocondrial en las células tratadas con actinomicina D. Todos los ensayos se realizaron como tres experimentos independientes, y cada experimento se ensayó por triplicado. Los datos se presentan como media ± DE, y p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Ensayo de detección de Caspasa 3/7. Todas las muestras muestran parámetros de activación idénticos, y el análisis estadístico de cada subpoblación revela un aumento significativo en la actividad de la caspasa 3/7 en las células tratadas con actinomicina D. Todos los ensayos se realizaron como tres experimentos independientes, y cada experimento se ensayó por triplicado. Los datos se presentan como media ± DE, y p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Ensayo de daño del ADN. Todas las muestras muestran parámetros de activación idénticos, y el análisis estadístico de cada subpoblación revela un aumento significativo en el daño del ADN de doble cadena y el daño total del ADN en las células tratadas con actinomicina D. Todos los ensayos se realizaron en tres experimentos independientes, y cada experimento se ensayó por triplicado. Los datos se presentan como media ± DE, y p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Las condiciones experimentales subóptimas arrojan resultados deficientes . (A) baja concentración de células, (B) alta concentración de células, (C) aglutinación y agregación celular evidente por el alto índice de tamaño celular, (D) tinción prolongada de muestras celulares evidente por el aumento de la tinción positiva en ambas muestras, y (E) manejo deficiente de muestras evidente por el aumento de los desechos celulares (índice de tamaño celular < 2.2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este estudio, las células SiHa tratadas con actinomicina D analizadas por FC revelaron biomarcadores tempranos y tardíos significativos para la apoptosis. Las condiciones subóptimas para la preparación, enumeración y tinción de células identificaron resultados inexactos, enfatizando la necesidad de un estricto cumplimiento de las instrucciones del fabricante al realizar FC.

Este estudio de la apoptosis por identificación temprana y tardía de biomarcadores se ajusta a las directrices NCCD¹ para investigar la apoptosis. Los cultivos de SiHa tratados con actinomicina D demostraron biomarcadores positivos para las etapas apoptóticas tempranas y tardías. El ensayo Annexin V/PI y el ensayo de permeabilidad mitocondrial mostraron que la actinomicina D indujo un patrón PS-flip y la disipación de la transición de la membrana mitocondrial, respectivamente. Una vez que las células apoptóticas alcanzan el punto de no retorno inducido por la perturbación mitocondrial, las caspasas terminales se activan ^3,7. La activación de las caspasas terminales 3 y 7 observadas en este estudio indica apoptosis en etapa tardía. Además, la activación de la caspasa terminal causa escisión internucleosómica del ADN y fragmentación extensa del ADN, que clásicamente ha sido reportada como un patrón de escalera escalonada observado por electroforesis en gel^28,38.

El daño nuclear con el ATM y H2A. El ensayo de daño de ADN de X FC mostró roturas de doble cadena en el ADN y daño total del ADN. Estos resultados confirmaron el daño nuclear apoptótico clásico inducido por caspasa aguas abajo (cariorrexis y cariorrisis) en cultivos experimentales. El uso de biomarcadores citométricos de flujo múltiple detectó así los eventos secuenciales de múltiples etapas en la apoptosis e identificó de manera precisa y reproducible las poblaciones celulares en las etapas apoptóticas tempranas y tardías. Estos hallazgos son consistentes con las características pro-apoptóticas conocidas de la actinomicina D en el tratamiento del cáncer en humanos 37,39,40,41 y apoyan aún más el uso de la actinomicina D como un control positivo en experimentos de cultivo celular de FC que investigan la apoptosis.

La activación de las poblaciones celulares en este estudio fue informada por controles negativos de medio y solvente, que separaron las células apoptóticas de las sanas. Alternativamente, también se puede usar una mezcla de poblaciones de controles positivos y negativos para definir poblaciones de células vivas y apoptóticas para establecer puertas de población celular ^7,9. Una vez que los estados celulares enfermos y saludables están definidos y cerrados, la configuración de la plantilla se puede aplicar a todas las culturas experimentales y de control posteriores.

El estricto cumplimiento del protocolo FC es esencial para evitar resultados falsos. Durante la optimización del protocolo, se observaron los siguientes problemas: (1) baja concentración celular, (2) alta concentración celular, (3) aglutinación celular, (4) tinción prolongada y (5) manejo deficiente de la muestra. Estos problemas se pueden prevenir mediante el estricto cumplimiento de los requisitos de protocolo optimizados. Esto enfatiza la naturaleza crucial de los pasos preanalíticos y analíticos para que CF obtenga datos precisos. Durante la preparación celular, la tripsinización, el pipeteo, la centrifugación y las diluciones deben realizarse con cuidado. La tripsinización excesiva y el pipeteo vigoroso pueden dar lugar al cizallamiento químico y mecánico de las células, respectivamente. La centrifugación prolongada y de alta velocidad puede resultar en la descomposición celular y altos recuentos de desechos celulares. Se requiere una concentración celular óptima para minimizar la adquisición incorrecta de eventos celulares. Por lo tanto, las suspensiones celulares primarias deben diluirse para obtener una concentración celular óptima.

Además, al manipular las muestras, se debe tener cuidado para evitar la aglutinación y fragmentación celular y garantizar que las células permanezcan en suspensión durante el análisis. El manejo de muestras para evitar la aglutinación celular permite el flujo de células laminares individuales, evita el bloqueo mecánico de los tubos capilares del instrumento y frena los índices espurios de tamaño de celda grande. Otra advertencia es proteger los cultivos contra la luz para evitar la fotooxidación y el enfriamiento de los fluoróforos en los ensayos para evitar resultados falsos negativos. Se debe tener cuidado para garantizar una exposición mínima a la luz en la etapa de tinción de las células y los pasos de procesamiento posteriores. Además, los tiempos prolongados de inmunotinción pueden dar lugar a resultados falsos positivos, ya que las proteínas se tiñen de forma no específica. Por lo tanto, la adherencia a los períodos de tinción de incubación prescritos por el fabricante es importante.

En resumen, la FC puede detectar con precisión la apoptosis y discriminar entre biomarcadores de apoptosis temprana y tardía en cultivo celular. Además, los avances en la tecnología han llevado a la fabricación de citómetros de flujo de sobremesa para científicos no expertos para estudiar la salud celular y las complejas vías de señalización intracelular.

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El estudio fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Investigación (NRF) y el Consejo de Investigación Médica de Sudáfrica (SAMRC). Nos gustaría agradecer al Servicio Nacional de Laboratorios de Salud (NHLS) por la compra del analizador de células de guayaba Musa. Todas las figuras de esta publicación fueron creadas con Biorender.com.