Un método de inoculación fácil y flexible para evaluar con precisión los fenotipos de infección por mildiú polvoriento de Arabidopsis y otras plantas

Presentamos un protocolo para construir un sistema simple de distribución de esporas que consiste en una caja de inoculación con una malla de ~ 50 μm y una cámara de plástico transparente. Esto se puede utilizar para inocular uniformemente las plantas con esporas de mildiú polvoriento, lo que permite una evaluación precisa y reproducible de los fenotipos de enfermedades de las plantas en estudio.

La reducción de las pérdidas de cultivos debido a enfermedades fúngicas requiere una mejor comprensión de los mecanismos que rigen la inmunidad de las plantas y la patogénesis fúngica, lo que a su vez requiere una determinación precisa de los fenotipos de enfermedades de las plantas tras la infección con un patógeno fúngico en particular. Sin embargo, el fenotipado preciso de la enfermedad con patógenos fúngicos biotróficos no cultivables, como el mildiú polvoriento, no es fácil de lograr y puede ser un paso limitante de la velocidad de un proyecto de investigación. Aquí, hemos desarrollado un sistema de fenotipado de enfermedades seguro, eficiente y fácil de operar utilizando la interacción Arabidopsis-mildiú polvoriento como ejemplo. Este sistema consta principalmente de tres componentes: (i) una caja de inoculación de madera equipada con una tapa extraíble montada con una malla de acero inoxidable o nylon de poros de ~ 50 μm para inocular un plano de plantas con esporas de hongos, (ii) una cámara de plástico transparente con una pequeña abertura frontal para minimizar el escape de esporas mientras se realiza la inoculación en el interior, y iii) un método de distribución y desplazamiento de esporas para una inoculación uniforme y eficaz. Los protocolos descritos aquí incluyen los pasos y parámetros para hacer la caja de inoculación y la cámara de plástico a bajo costo, y una demostración en video de cómo usar el sistema para permitir una inoculación uniforme con esporas de mildiú polvoriento, mejorando así la precisión y la reproducibilidad del fenotipado de la enfermedad.

El mildiú polvoriento es una de las enfermedades más comunes e importantes de numerosos cultivos alimentarios y plantas ornamentales¹. Los estudios de las enfermedades del mildiú polvoriento han sido muy populares, como lo demuestran más de 10,500 publicaciones como resultado de la búsqueda con "mildiú polvoriento" como palabra clave en Web of Science (a partir de noviembre de 2020). De hecho, el mildiú polvoriento (representado por Blumeria graminis) es considerado uno de los 10 principales patógenos fúngicos por la revista Molecular Plant Pathology². La cuantificación de la susceptibilidad a enfermedades es un paso necesario en la caracterización de los genes de las plantas que contribuyen a la resistencia o susceptibilidad a las enfermedades, o la identificación funcional de genes efectores candidatos en el mildiú polvoriento. Sin embargo, el fenotipado confiable de la enfermedad es mucho más difícil con el mildiú polvoriento en comparación con la mayoría de los otros patógenos fúngicos, en parte porque, a diferencia de las esporas de estos últimos, las esporas de especies de mildiú polvoriento (como Golovinomyces cichoracearum UCSC1 según nuestra experiencia de laboratorio) muestran una viabilidad reducida después de pasar por un proceso de suspensión de agua ^3,4 . La inoculación inadecuada y/o desigual de plantas de ensayo con un patógeno particular del mildiú polvoriento puede dar lugar a resultados de fenotipado inexactos.

Se informaron varios métodos de inoculación para estudios de mildiú polvoriento. Estos incluyen (i) cepillado de esporas directamente de las hojas infectadas para probar plantas⁵, (ii) pulverización de una suspensión de esporas para probar plantas⁶, (iii) soplado de esporas utilizando una torre de sedimentación operada por vacío a las plantas en la parte inferior de la torre⁷, y (iv) entrega de esporas mediante el uso combinatorio de una membrana de malla de nylon y vibración basada en el sonido⁸ . El método de cepillado de esporas (o desempolvado) es fácil de realizar pero de naturaleza desigual, por lo que puede no ser preciso para la evaluación cuantitativa. La pulverización de esporas es conveniente y uniforme, pero como se indicó anteriormente puede resultar en una germinación deficiente de las esporas⁴. Los dos últimos (es decir, iii-iv) son métodos muy mejorados capaces de lograr una inoculación uniforme; Sin embargo, ambos no son flexibles para ajustar su capacidad de inoculación en términos del número de plantas a inocular en un solo evento, por lo que cualquiera de los aparatos no es trivial, y su operación está restringida a áreas de laboratorio donde hay un vacío y / o fuente de electricidad.

Nuestro laboratorio ha estado trabajando con la interacción planta-mildiú polvoriento durante más de 20 años ^9,10. Durante la última década, probamos una serie de métodos de inoculación y recientemente desarrollamos un método de inoculación de mildiú polvoriento simple pero efectivo. Este método de cepillado de esporas basado en malla puede garantizar una inoculación uniforme, y es simple y escalable, por lo que debe ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio que trabaje con mildiú polvoriento.

1. Hacer una caja de inoculación estándar con una tapa superior extraíble montada con una malla

1. Compre un rollo de malla de membrana de nylon de 50 μm o malla de acero inoxidable de 48 μm (recomendado) en las tiendas. Asegúrese de pedir suficiente para cortar en múltiples piezas de 14 pulgadas x 26 pulgadas para reemplazar la malla desgastada.
2. Compre un tablero de fibra de densidad media o madera contrachapada de densidad media de 1/4 de pulgada x 2 pies de 2 pies x 4 pies, y corte dos de 24-1/2 pulgadas x 10 en pedazos y dos de 12 pulgadas x 10 en pedazos para hacer una caja de inoculación. Utilice 8 abrazaderas de esquina para apoyar los cuatro lados.
   NOTA: Si está orientado hacia el lado ancho del recinto, el lado izquierdo de 12 pulgadas x 10 pulgadas está unido permanentemente y el lado derecho de 12 pulgadas x 10 pulgadas es una puerta extraíble sostenida en su lugar por cuatro ganchos magnéticos (Figura 1A, B).
3. Coloque cuatro llaves de esquina de 2 pulgadas dos en cada esquina interior del lado izquierdo, a una pulgada de la parte superior y una pulgada de la parte inferior, marque y perfore un agujero. Use tornillos para fijar permanentemente el lado corto izquierdo a dos lados largos (delantero y posterior). La distancia interna entre los dos lados largos debe ser de 12 pulgadas y no de 11-1/2 pulgadas.
4. Con las abrazaderas de esquina todavía en su lugar y la alineación adecuada de la puerta derecha, marque y perfore la ubicación de las 4 trampas magnéticas para mantener la puerta desmontable correcta en su lugar. Instale una perilla de botón en la puerta. La parte superior de la puerta queda atrapada debajo de la tapa superior (Figura 1A, B).
5. Para hacer una tapa superior extraíble con una malla, corte la clavija cuadrada larga de madera en 2 juegos de 26 pulgadas y 12-3/4 pulgadas. Pegue y clave las cuatro piezas de tal manera que quepan alrededor de la caja: las dimensiones interiores del marco son un poco más grandes que las dimensiones exteriores de la caja, ya que la malla de la pantalla se unirá a este marco.
6. Corte la malla de la pantalla a un poco menos de 14 pulgadas x 26 pulgadas. No permita que la pantalla sobresalga más allá del marco para evitar bordes afilados. Tenga ayuda para estirar la pantalla en el marco. Sujete la malla con el marco mediante abrazaderas (Figura 1C) y use una pistola grapadora con las grapas adecuadas para asegurar la pantalla al marco.
7. Corte dos juegos de clavijas cuadradas de madera más cortas (21 pulgadas y 9 pulgadas) y use tornillos para intercalar firmemente la malla a lo largo del marco usando las 4 piezas más cortas de clavija cuadrada de madera (Figura 1C, D).

2. Hacer una cámara de inoculación

1. Compre láminas de acrílico transparente y artículos de ferretería en las tiendas apropiadas. Corte una ventana de apertura de 7 pulgadas x 20 en la hoja de acrílico frontal de la caja, como se muestra en la Figura 2C.
2. Ensamble los lados izquierdo y derecho, frontal (con ventana) y láminas de acrílico traseras en una caja usando 8 abrazaderas de esquina como se muestra en la Figura 2A. Asegúrese de que las medidas internas de la cámara sean iguales a las dimensiones de la hoja superior.
   NOTA: El lado derecho está ahí para soporte y no se unirá a las hojas delanteras o traseras. Es 1/2 pulgada más corto que las otras hojas a propósito. Este lado derecho se convertirá en una puerta de "solapa" de "bajada" sostenida en su lugar por una bisagra en ángulo recto en la parte inferior y dos trampas magnéticas en la parte superior como se muestra en la Figura 2C, D.
3. Utilice llaves de esquina para asegurar los paneles juntos (Figura 2B, C). Mantenga los aparatos ortopédicos en su lugar, marque con un marcador de sharpie, perfore el punzón central y luego perfore el agujero.
   NOTA: Perforar acrílico es diferente de perforar cualquier otra cosa, no fuerce o el lado del orificio opuesto al taladro puede agrietarse. Use remaches o tornillos. No apriete demasiado los tornillos o el acrílico puede agrietarse con el tiempo.
4. Gire la carcasa en su parte trasera y retire las 4 abrazaderas de esquina y coloque la hoja superior en su lugar. Marcar y perforar.
5. Instale la bisagra de ángulo recto, hecha de una abrazadera angular de 3/4 pulgadas. Use una tuerca de bloqueo de retención de nylon como varilla de bisagra. No apriete, deje un espacio para que la puerta gire sobre esta bisagra.
6. Marque, perfore centralmente, perfore y fije los dos imanes magnéticos de la puerta con tornillos de cabeza de bandeja # 6-32x3 / 4 ". Luego fije las placas de cierre con tornillos de cabeza plana #6-32x3/8", vea la Figura 2C, D.

3. Inoculación de plantas en pisos

1. Prepare esporas frescas de oídio como inóculos (p. ej., oídio de Arabidopsis Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Cultivar plantas mutantes ¹¹ de Arabidopsis inmunocomprometidas en una cámara de crecimiento (22 °C, 65% de humedad relativa durante 6-8 semanas) e inocular una o media plana de plantas pad4-1 para acumular suficientes esporas frescas de mildiú polvoriento (Figura 3A).
2. Cultive las plantas para determinar los fenotipos de infección en estándar 11 en x 21 en x 2.5 en pisos.
   NOTA: Las plantas de Arabidopsis cultivadas en días cortos (8 h de luz, 16 h de oscuridad; 22 °C) durante seis a ocho semanas son buenas para las pruebas de infección con mildiú polvoriento.
3. Cuando se disponga de esporas frescas de mildiú polvoriento de plantas infectadas a los 8-10 días después de la inoculación (dpi), mueva un plano de plantas para la prueba de infección a la caja de inoculación dentro de la cámara de inoculación (Figura 1B,2C).
4. Corte 15-20 hojas de Arabidopsis muy infectadas (o 4-6 rosetas infectadas, dependiendo del tamaño de la hoja / roseta y el nivel de inoculación), deje que las hojas se sequen si hay agua condensada.
5. Agarre 1-2 hojas o una roseta con un par de pinzas largas con una mano y mire las hojas boca abajo. Luego, coloque ambas manos a través de la abertura de la cámara y golpee suavemente el brazo de los fórceps con un par de tijeras mientras mueve lentamente las hojas / roseta por encima de la malla montada en la caja de inoculación (Figura 3B). Repita esto hasta que se usen todas las hojas o rosetas.
   NOTA: Las esporas maduras se desprenderán fácilmente de los conidióforos de las hojas infectadas. Trate de desalojar las esporas de la malla de la manera más uniforme posible.
6. Use uno o dos cepillos finos de abanicos-licuadores para cepillar suavemente las esporas a través de la malla (Figura 3C). Asegúrese de cepillar toda la superficie de la malla en diferentes direcciones durante cuatro o más veces para maximizar la distribución uniforme de las esporas en las plantas en el fondo de la caja de inoculación (Figura 3D). Golpee suavemente la malla varias veces con los cepillos para sacudir las esporas que están atrapadas en la malla.
7. Deje que las esporas se asienten durante medio minuto. Luego, saque el plano que contiene las plantas inoculadas de la caja de inoculación. Cubra el piso con una cúpula de plástico y colóquelo en una cámara de crecimiento (22 °C, 65% de humedad relativa). El fenotipado de la enfermedad se puede realizar a 5, o de 8 a 12 dpi ¹².

4. Inocular las plantas con cajas de inoculación más pequeñas

NOTA: En los casos en que se vayan a inocular menos plantas, todavía se puede utilizar la caja de inoculación estándar. Asegúrese de colocar las plantas en el centro de la caja. Desaloje y cepille las esporas en el área de la malla que cubre las plantas para asegurarse de que todas las plantas estén inoculadas mientras se guardan los inóculos. Alternativamente, y preferiblemente, se pueden usar cajas de inoculación más pequeñas (como se describe a continuación).

1. Convierte las cajas de cartón en una caja de inoculación. Simplemente retire los lados superior e inferior de la caja, pegue la esquina con cinta adhesiva para reafirmarla si es necesario y monte una malla de 50 μm del tamaño adecuado en la parte superior pegando o grapando (Figura 4A, B).
2. Mueva el plano que contiene las plantas dentro de la cámara de inoculación, coloque la caja de inoculación más pequeña en la parte superior del plano para cubrir las plantas.
3. Desaloje y cepille las esporas como se describió anteriormente.

5. Inocular hojas desprendidas en placas de Petri

NOTA: En los casos en que (i) las esporas frescas de mildiú polvoriento son muy limitadas y/o (ii) las plantas deben mantenerse limpias mientras que los fenotipos de la enfermedad y/o la localización subcelular de proteínas en las células infectadas deben evaluarse, las hojas desprendidas se pueden utilizar para la infección en placas de MS-agar.

1. Haga una mini caja de inoculación que sea solo un poco más grande que una placa de Petri.
2. Prepare placas de agar medio Murashige y Skoog (MS) de 1/2 fuerza (1.5%). Agregue tiabendazol (40 mg / L) para reducir la contaminación por moho si es necesario. Conservar los platos a 4 °C en nevera hasta su uso.
3. Corte una o dos hojas completamente expandidas de la base del pecíolo para cada planta individual a probar. Inserte el pecíolo de las hojas desprendidas en medio de agar en un ángulo de ~ 30 °.
   NOTA: Cada placa puede contener 20-40 hojas dependiendo del tamaño de las hojas y la placa utilizada (Figura 4C).
4. Inocular las hojas dentro de la cámara de inoculación como se describió anteriormente. Mueva la placa con la tapa a una cámara de crecimiento.
5. Corte una pequeña sección de una hoja y verifique la localización subcelular de las proteínas en puntos de tiempo específicos.
6. Para evaluar los fenotipos de infección, transfiera las hojas a una placa de MS-agar aséptica fresca a 4 o 5 dpi. Corte la base del pecíolo antes de insertar las hojas en el medio de agar fresco. Evaluar los fenotipos de la enfermedad a 8 o 9 dpi.

Aquí, presentamos un nuevo método de inoculación de esporas de mildiú polvoriento que es fácil de preparar, operar y ajustar. La Figura 1 muestra el montaje de la caja de inoculación estándar con énfasis en la marca de la tapa extraíble montada con una malla de membrana de 50 μm. La figura 2 muestra el montaje de la cámara de inoculación. La Figura 3 ilustra los pasos clave del proceso de inoculación utilizando este sistema. La Figura 4 muestra otras cajas de inoculación que se pueden usar para inocular una planta plana entera o menos, u hojas desprendidas en medio MS-agar. Finalmente, la Figura 5 proporciona datos para demostrar la uniformidad de la inoculación reflejada por la distribución de esporas o los fenotipos de infección de la planta.

Figura 1. Hacer una caja de inoculación. (A-B) Fotos que muestran la caja con la puerta cerrada (A) o abierta para insertar un piso de plantas de Arabidopsis (B). Tenga en cuenta que un par de trampas magnéticas de la puerta del gabinete se utilizan para sostener la puerta. (C) Una foto que muestra el montaje de una malla en el marco rectangular como un paso crítico para hacer la tapa de la caja. Tenga en cuenta que las abrazaderas y los soportes de esquina se utilizan para colocar la malla antes de que se fije con clavos atornillados. (D-E) Fotos que muestran la tapa extraíble de la caja con una nueva malla de acero inoxidable montada (D) o una caja ensamblada (E). Tenga en cuenta que la malla se fija entre 3/4 pulg. clavija cuadrada de madera con longitud indicada en D y E. Las líneas amarillas resaltan la medida del tamaño de la caja. Tener una caja de inoculación que se ajuste a un plano estándar puede mejorar en gran medida la eficiencia del fenotipado, especialmente cuando muchas plantas van a ser inoculadas (por ejemplo, durante una prueba genética). Una tapa extraíble montada con una malla facilita la limpieza o el reemplazo de la malla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Realización de una cámara de inoculación. (A) Una foto que muestra el montaje inicial de las cuatro láminas de acrílico utilizando abrazaderas de esquina. (B) Una foto que da una vista de arriba hacia abajo de la cámara de plástico. (C-D) Fotos que muestran el sistema de inoculación completamente ensamblado (C), y una de las dos ganchos magnéticos (superior) y bisagras de ángulo recto (abajo) instaladas en una lámina de acrílico lateral como puerta (D). Tenga en cuenta que la ventana de inoculación es para desalojar y cepillar las esporas por parte del usuario (representadas por líneas de platos). Las líneas amarillas resaltan la medida del tamaño de la caja. Tener una cámara de inoculación es una ventaja, pero sin ella, la inoculación todavía se puede realizar con una caja de inoculación en una pequeña habitación o entorno con viento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Ilustración del proceso de inoculación. (A) Imágenes que muestren mildiú polvoriento fresco en las hojas de las plantas indicadas. (B) Una imagen que muestra cómo sacudir las esporas de la malla golpeando suavemente las pinzas que agarran las hojas infectadas. (C) Imágenes que muestran dos finos cepillos de licuadora de abanico y cepillado suave de esporas en la malla. (D) Un dibujo esquemático que muestra las direcciones del cepillado de esporas en la malla que puede ayudar a dar como resultado una distribución uniforme de las esporas en las plantas en el fondo de la caja de inoculación. Es importante señalar que el uso de esporas frescas para la inoculación es fundamental para una infección exitosa. Según nuestra experiencia, los conidios producidos en hojas infectadas entre 8 y 12 dpi son frescos y pueden desprenderse fácilmente por agitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Cajas de inoculación de cartón simples y provisionales para pruebas de infección. (A) Una caja de cartón para inocular plantas en un piso estándar. (B) Cajas de inoculación de tamaño mediano para inocular menos plantas. (C) Una pequeña caja de inoculación para inocular hojas desprendidas en una placa de Petri cuadrada que contiene medio MS-agar. Las líneas amarillas resaltan la medida del tamaño de la caja. Se pueden usar cajas de cartón de otros tamaños si se ajustan a los pisos que contienen plantas que se van a probar. Las cajas de plástico no deben usarse porque las esporas pueden ser atraídas a la superficie del plástico debido a su electricidad estática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Evaluación de la uniformidad de la inoculación. (A) Un dibujo esquemático que muestra las posiciones de seis portaobjetos microscópicos en la parte inferior de un plano. Una micrografía representativa a la derecha muestra una distribución uniforme de esporas en el portaobjetos después de una inoculación pesada. Barra de escala = 200 μm. (B) Un gráfico de barras que muestra la densidad de esporas distribuidas en seis ubicaciones (1 a 6) como se muestra en (A) después de tres inoculaciones simuladas con esporas de cuatro (para inoculación ligera) o 15 (para inoculación pesada ) hojas infectadas completamente expandidas de plantas pad4-1 . Se contaron las esporas en un área de 4 x 0,25^cm2 delimitadas por un cubrebocado de vidrio cuadriculado (de ibidi USA Inc. o de fabricación propia) en la parte superior de cada diapositiva. No se detectaron diferencias significativas en la densidad de esporas entre seis portaobjetos en cada uno de los dos esquemas de inoculación (prueba t de Student; p > 0,5). Las barras de error indican SD. (C) Plantas representativas de Arabidopsis Col-0 de tipo silvestre y pad4-1 mutante infectadas con G. cichoracearum UCSC1 a los 12 días después de una inoculación pesada. Tenga en cuenta que todas las plantas pad4-1 mostraron una mayor susceptibilidad a las enfermedades en comparación con las plantas Col-0. Múltiples factores determinan la uniformidad de la inoculación. En general, es relativamente más fácil lograr una inoculación uniforme cuando se utilizan suficientes inóculos para alcanzar una densidad de > 50 esporas/^cm2. Los conidios frescos desalojados por agitación pueden desagregarse fácilmente y cepillarse individualmente a través de la malla. Los conidios viejos o muertos tienden a formar agregados, por lo que son difíciles de desalojar y dispersar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nuestro método de inoculación basado en caja mallada tiene varias ventajas sobre otros métodos de inoculación. En primer lugar, puede lograr una distribución uniforme de las esporas si se opera correctamente, como se demuestra en la Figura 5. En segundo lugar, el uso de malla de ~ 50 μm, más el desplazamiento de esporas mediante el suave movimiento de las hojas infectadas puede reducir la infección de las plantas por trips u otros insectos que infectan las plantas que están presentes en las plantas de origen. En tercer lugar, el uso de cajas de inoculación de diferentes tamaños para inocular plantas u hojas desprendidas dentro de la cámara de plástico (las cuales se pueden limpiar fácilmente rociando etanol al 75%) puede hacer un uso más efectivo del inóculo y reducir la contaminación cruzada. Encontramos que ninguna o muy pocas esporas de hongos escaparon de las cámaras de inoculación durante todo el proceso de inoculación.

Una caja de inoculación de buena calidad es clave para garantizar una inoculación uniforme. Encontramos que la caja de inoculación estándar se puede utilizar para inocular plantas jóvenes y maduras de Arabidopsis (Figura 1), plántulas de fresa, cardo de cerda y N. benthamiana (no se muestra). La altura de la caja puede aumentar aún más si las plantas miden más de cinco pulgadas para garantizar una distancia suficiente (> 5 pulgadas) desde la malla hasta las plantas debajo para permitir una distribución uniforme de las esporas. La altura de la cámara de plástico también puede aumentar en consecuencia para permitir el espacio adecuado para maniobrar el desprendimiento de esporas y el cepillado en la parte superior de la caja de inoculación.

El montaje uniforme y apretado de una malla de ~ 50 μm de elección en la tapa de la caja de inoculación es importante y requiere un cuidado adicional. El tamaño de poro es ligeramente más grande que las esporas de mildiú polvoriento que son en su mayoría de 30-40 μm de diámetro. La tapa se puede limpiar lavando con agua del grifo o rociando con etanol al 75% después de su uso. Recomendamos el uso de una malla de acero inoxidable de 48 μm, porque la malla es más duradera y durará más tiempo.

La cámara de inoculación crea un ambiente inmóvil y minimiza el escape de esporas durante el desplazamiento de esporas y / o el cepillado. La cámara está hecha de vidrio plástico transparente para que el usuario pueda ver a simple vista si las esporas desprendidas se distribuyen más o menos uniformemente en la malla antes del cepillado. Esto es especialmente importante si se requiere una inoculación ligera e uniforme. El cepillado suave pero rápido en diferentes direcciones también es importante, ya que puede dispersar las esporas agregadas y empujarlas a través de los poros individualmente, logrando una distribución uniforme después de que las esporas caen y se asienten en el fondo de la caja de inoculación. Para facilitar el manejo, la cámara de inoculación debe colocarse sobre una mesa con una altura adecuada de modo que el desplazamiento de esporas y el cepillado se puedan realizar fácilmente con las manos a través de la ventana de la cámara.

La inoculación basada en cajas malladas se puede ampliar o reducir mediante el uso de cajas de inoculación de diferentes tamaños. Las cajas de inoculación de malla simples y provisionales son fáciles de hacer y podrían lograr resultados satisfactorios si se usan correctamente. Es cierto que, en comparación con la inoculación con el método de torre de decantación accionada por vacío⁷, este método puede llevar más tiempo en el desplazamiento de esporas y el cepillado. Además, para inocular plantas grandes y altas, la caja de inoculación estándar descrita aquí puede ser demasiado pequeña, por lo que se debe usar una caja de inoculación más grande y una cámara más grande para lograr una inoculación uniforme. Para algunas especies de plantas como el tabaco y el pepino, las hojas desprendidas o los cotiledones pueden ser inoculados con este método para evaluar la susceptibilidad a enfermedades de toda la planta.

Los autores no tienen nada que revelar.

El trabajo fue apoyado por la National Science Foundation (IOS-1901566) a S. Xiao. Los autores desean agradecer a F. Coker y C. Hooks por el mantenimiento de la instalación de crecimiento de la planta, y a Jorge Zamora por la ayuda técnica asociada con la fabricación de la caja y la cámara de inoculación.