Etiquetado Covalente Con Dietilpirocarbonato Para El Estudio De La Estructura De Orden Superior De Proteínas Por Espectrometría De Masas

Se describen los procedimientos experimentales para realizar el etiquetado covalente a base de dietilpirocarbonato con detección espectrométrica de masas. El dietilpirocarbonato simplemente se mezcla con la proteína o complejo proteico de interés, lo que lleva a la modificación de residuos de aminoácidos accesibles al disolvente. Los residuos modificados se pueden identificar después de la digestión proteolítica y la cromatografía líquida / análisis de espectrometría de masas.

Caracterizar la estructura de orden superior de una proteína es esencial para comprender su función. La espectrometría de masas (EM) ha surgido como una poderosa herramienta para este propósito, especialmente para los sistemas de proteínas que son difíciles de estudiar por métodos tradicionales. Para estudiar la estructura de una proteína por EM, se realizan reacciones químicas específicas en solución que codifican la información estructural de una proteína en su masa. Un enfoque particularmente efectivo es utilizar reactivos que modifican covalentemente las cadenas laterales de aminoácidos accesibles con disolventes. Estas reacciones conducen a aumentos de masa que se pueden localizar con la resolución del nivel de residuos cuando se combinan con la digestión proteolítica y la espectrometría de masas en tándem. Aquí, se describen los protocolos asociados con el uso de dietilpirocarbonato (DEPC) como un reactivo de etiquetado covalente junto con la detección de MS. DEPC es una molécula altamente electrofílica capaz de etiquetar hasta el 30% de los residuos en la proteína media, proporcionando así una excelente resolución estructural. DEPC se ha utilizado con éxito junto con la EM para obtener información estructural de pequeñas proteínas de un solo dominio, como la β2-microglobulina, a grandes proteínas multidominio, como los anticuerpos monoclonales.

Las proteínas son biomoléculas esenciales en prácticamente todos los procesos fisiológicos. La variedad de funciones que realizan las proteínas son posibles debido a las estructuras que adoptan y las interacciones que tienen con otras biomoléculas. Para entender la función de la proteína en un nivel más profundo, se necesitan herramientas bioquímicas y biofísicas para dilucidar estas importantes características e interacciones estructurales. Tradicionalmente, la cristalografía de rayos X, la microscopía electrónica criogénica y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) han proporcionado el detalle a nivel atómico deseado para revelar la estructura de la proteína. Sin embargo, numerosos sistemas de proteínas no pueden ser interrogados por estas técnicas debido a un comportamiento de cristalización deficiente, disponibilidad limitada de proteínas, heterogeneidad excesiva de la muestra o limitaciones de peso molecular. En consecuencia, han surgido nuevos métodos de análisis que superan estas limitaciones. Entre las técnicas emergentes que pueden proporcionar información estructural de proteínas se encuentra la espectrometría de masas.

La espectrometría de masas (MS) mide la relación masa-carga (m/z) de una molécula, por lo que la información estructural de orden superior de la proteína debe obtenerse mediante la codificación de la información estructural deseada en la masa de la proteína. Se han desarrollado varios enfoques para codificar esta información, incluyendo el intercambio hidrógeno-deuterio (HDX)^1,2,3,4,reticulado químico (XL)^5,6,y etiquetado covalente (CL)^7,8,9,10. En HDX, los hidrógenos de amida de columna vertebral se intercambian por deuterios ligeramente más masivos a tasas que dependen de la accesibilidad del disolvente y la extensión del enlace H. La extensión de HDX se puede localizar digiriendo rápidamente la proteína en fragmentos del péptido antes de separar y de medir estos fragmentos por el espectrómetro de masa o disociando la proteína en un experimento de arriba hacia abajo. La determinación del tipo de cambio proporciona más información sobre la dinámica de las proteínas. HDX ha demostrado ser una herramienta valiosa para caracterizar la estructura de las proteínas a pesar de los desafíos asociados con el intercambio posterior y la necesidad de equipos especializados para maximizar la reproducibilidad. En XL-MS, las proteínas se reaccionan con reactivos bifuncionales que unen covalentemente las cadenas laterales de residuos adyacentes dentro de una proteína dada o entre dos proteínas. Al hacerlo, XL-MS puede proporcionar restricciones de distancia que se pueden utilizar para caracterizar la estructura de la proteína. Las regiones de la proteína que están reticenladas pueden ser identificadas por digestión proteolítica seguida de cromatografía líquida (LC)-análisis de MS. Si bien XL-MS es una herramienta versátil que se ha utilizado para estudiar una variedad de complejos de proteínas, incluidas las células internas, la identificación de los productos XL es un desafío y requiere un software especializado.

Cl-MS ha surgido recientemente como una herramienta complementaria y a veces alternativa basada en MS para estudiar la estructura de las proteínas y las interacciones. En CL-MS, una proteína o complejo proteico se modifica covalentemente con un reactivo mono-funcional que puede reaccionar con cadenas laterales expuestas al solvente (Figura 1). Al comparar las extensiones de modificación de una proteína o complejo de proteínas bajo diferentes condiciones, se pueden revelar cambios de conformación, sitios de unión e interfaces proteína-proteína. Después de la reacción del CL, la información sitio-específica, a menudo en el solo nivel del aminoácido, se puede obtener usando los flujos de trabajo típicos de la proteómica de abajo hacia arriba en los cuales las proteínas se digieren proteolytically, los fragmentos del péptido son separados por el LC, y los sitios modificados se identifican usando el ms en tándem (MS/MS). La rica historia de la química bioconjugada ha hecho que numerosos reactivos estén disponibles para experimentos cl-ms. Los reactivos cl se dividen en dos categorías generales: (i) específicos y (ii) no específicos. Los reactivos específicos reaccionan con un solo grupo funcional (por ejemplo, aminas libres)^8,10 y son fáciles de implementar, pero tienden a proporcionar información estructural limitada. Los reactivos no específicos reaccionan con una amplia gama de cadenas laterales, pero a menudo requieren equipos especializados como láseres o fuentes de sincrotrón para producir estas especies altamente reactivas. Los radicales hidroxilo son el reactivo inespecífico más comúnmente utilizado, habiéndose aplicado en la huella de radicales hidroxilo (HRF)^7,11,12,13 experimentos para estudiar una amplia gama de proteínas y complejos proteicos bajo una variedad de condiciones.

Nuestro grupo de investigación ha utilizado con éxito otro reactivo relativamente inespecífero llamado dietilpirocarbonato (DEPC) para estudiar la estructura de las proteínas y las interacciones en el contexto de los experimentos CL-MS^{14,15, 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.} DEPC ofrece la simplicidad de reactivos de etiquetado específicos (es decir, no se necesita ningún equipo especializado para realizar las reacciones), mientras que reacciona con hasta un 30% de aminoácidos en la proteína promedio. Como reactivo altamente electrofílico, DEPC es capaz de reaccionar con el N-terminal y las cadenas laterales nucleofílicas de cisteína, histidina, lisina, tirosina, serina y residuos de treonina. Típicamente, se genera un solo producto de estas reacciones, resultando en un aumento de masa de 72.02 Da. Este único tipo de producto contrasta con los hasta 55 productos diferentes que se pueden producir cuando las proteínas reaccionan con los radicales hidroxilo⁷. Esta química simple facilita la identificación de sitios etiquetados.

Aquí, proporcionamos protocolos para el uso de CL-MS basado en DEPC para estudiar la estructura de las proteínas y las interacciones. Los detalles asociados a la preparación del reactivo, a las reacciones de la DEPC-proteína, a las condiciones de la digestión de la proteína, a los parámetros de LC-MS y de MS/MS, y al análisis de datos se describen. También demostramos la utilidad del etiquetado DEPC proporcionando resultados de ejemplo de proteína-metal, proteína-ligando, y las interacciones proteína-proteína, así como las proteínas que sufren cambios estructurales en el calentamiento.

1. Preparación de proteínas y reactivos

Nota : este protocolo incluye un flujo de trabajo de ejemplo para etiquetar una proteína con DEPC. Algunas condiciones y concentraciones de reactivos enumeradas pueden variar según la proteína de elección.

1. Prepare todas las soluciones de reactivos en tubos microcentrífugos de 1,5 mL.
2. Preparar una solución proteica de la concentración deseada, generalmente en el rango de decenas de μM, en un tampón de ácido 3-(N-morfolino)propanesulfónico (MOPS) de 10 mM a pH 7.4. Alternativamente, prepare una solución de proteína de intercambio tampón existente en 10 mM pH 7.4 MOPS si la muestra contiene un tampón nucleofílico que sería reactivo con DEPC. También se pueden utilizar otros tampones (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), siempre y cuando no tengan grupos funcionales nucleófilos.
3. Prepare una solución DEPC de 100 mM en acetonitrilo seco (ACN) pipeteando 1,45 μL de la solución de DEPC de 6,9 M en 98,55 μL del ACN.
   NOTA: No hay un solo conjunto de concentraciones que funcionen con cada proteína, aunque las concentraciones óptimas se pueden estimar en función del número de residuos de His y Lys^23. Por ejemplo, con 50 μL de una solución de 50 μM de β2-microglobulina, reaccione la proteína con 0,2 μL de los 100 mM de DEPC para una concentración final de DEPC de 200 μM (igual a 4x la concentración de proteínas) para asegurar la relación molar deseada utilizando este ejemplo general (Tabla 1). El etiquetado DEPC es una reacción de^2º orden, por lo que cambiar la concentración de proteína o DEPC en la mezcla de reacción cambiará la velocidad de etiquetado.
4. Prepare la solución de imidazol de 1 M pesando 10 mg de imidazol y disolviendo en 146,9 μL de agua de grado HPLC.

2. Etiquetado covalente de proteína intacta

1. Ajuste la temperatura del baño de agua a 37 °C y espere a que el baño alcance una temperatura estable.
   NOTA: Las concentraciones y volúmenes de reactivos para un ejemplo de protocolo de etiquetado se pueden encontrar en la Tabla 1.
2. En un nuevo tubo de microcentrífuga, mezcle el tampón MOPS y la solución proteica en los volúmenes enumerados en el Cuadro 1.
3. A la proteína y al tampón añadir 0,2 μL de la solución DEPC, asegurándose de mezclar correctamente la solución resultante, y luego colocar el tubo que contiene la mezcla de reacción en el baño de agua de 37 °C durante 1 minuto.
   NOTA: El volumen de ACN añadido no debe exceder el 1% del volumen total de la reacción para evitar la perturbación de la estructura de la proteína durante la reacción de etiquetado. El tiempo de reacción depende del usuario, aunque una reacción de 1 minuto en las condiciones de ejemplo minimiza el sobreetiquetado y la hidrólisis potencial de DEPC^14.
4. Después de 1 minuto, retire el tubo que contiene la mezcla de reacción del baño de agua y saciar la reacción con 1 μL de la solución de imidazol de 1 M para limpiar el DEPC restante sin reaccionar.
   NOTA: La concentración final de imidazol en la mezcla de reacción debe ser igual a 50 veces la concentración de DEPC en la mezcla de reacción. Esto asegurará que el DEPC restante sin reaccionar sea borrado.

3. Preparación del resumen de la proteína para la LC-MS de abajo hacia arriba

NOTA: Elija las condiciones de digestión que son susceptibles a la proteína de interés. Los pasos comunes implican desplegar la proteína y reducir y alquilear cualquier enlaces disulfuro.

1. Despliegue la proteína añadiendo un reactivo de despliegue apropiado a la mezcla de reacción.
   NOTA: Los agentes de despliegue comunes incluyen ACN, urea y clorhidrato de guanidina (GuHCl).
2. Preparar soluciones de Tris(2-carboxiletil)fosfina (TCEP) e iodoacetamida (IAM) pesando 5 mg de cada una y disolviéndolos en nuevos tubos de microcentrífuga en 174,4 y 270,3 μL de tampón de 10 mM pH 7,4 MOPS, respectivamente, para las etapas de reducción y alquilación.
3. Reducir los enlaces disulfuro añadiendo 2 μL de la solución TCEP (concentración final de 2 mM en mezcla de reacción) a la solución de 100 mM en mezcla de reacción y reaccionando durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: La concentración final de TCEP debe ser igual a 40 veces la concentración de proteína por enlace disulfuro presente en la solución.
4. El alquilato redujo las cisteinas con 4 μL de la solución iam de 100 mM (concentración final de 4 mM en la mezcla de reacción) durante 30 minutos en la oscuridad. Iam es sensible a la luz y se descompone bajo luz directa.
   NOTA: La concentración final de IAM en solución debe ser el doble de la concentración utilizada para TCEP, o 80 veces la concentración de proteína por enlace disulfuro.
5. Digiera la proteína con una enzima apropiada como la tripsina o la quimotripsina. Una relación proteína:enzima de 10:1 para una digestión de 3 horas a 37 °C con enzima inmovilizada a una tasa de agitación de 300 golpes/min es típicamente suficiente para las proteínas etiquetadas con DEPC. Ver Discusión.
6. Después de la digestión, separe la enzima inmovilizada de los péptidos digeridos por centrifugación a 12.000 rpm durante 5 minutos.
7. Analice la muestra inmediatamente por LC-MS/MS o flash-congele la muestra con nitrógeno líquido para minimizar la degradación de la muestra y la pérdida de la etiqueta. Almacene las muestras congeladas a < -20 °C hasta que estén listas para el análisis LC-MS/MS.

4. Análisis LC-MS/MS

NOTA: Los parámetros estándar de LC-MS/MS para la proteómica de abajo hacia arriba se pueden utilizar para identificar sitios etiquetados en los fragmentos de péptido proteolítico. A continuación se describe un ejemplo general.

1. Separe los péptidos marcados con DEPC utilizando una fase estacionaria C18 de fase invertida. Utilice una fase móvil LC típica de dos disolventes: (A) agua + 0,1% de ácido fórmico y (B) ACN + 0,1% de ácido fórmico utilizando un gradiente (por ejemplo, figura 2)para lograr la mejor separación de péptidos.
   NOTA: El tiempo de separación se puede optimizar en función de la complejidad de la muestra, y el caudal de fase móvil depende de si se utiliza LC capilar o nano.
2. Utilice un espectrómetro de masas capaz de hacer LC-MS y MS/MS en línea para identificar los sitios de modificación de DEPC en el péptido. En nuestros experimentos, hemos utilizado con éxito varios tipos de espectrómetros de masas. Cualquier espectrómetro de masas capaz de realizar automáticamente MS/MS de muchos péptidos durante el curso de un análisis LC-MS debe ser adecuado. Los parámetros relevantes de la EM incluyen: voltaje de la fuente ESI = -4000 V para ESI regular; -2000 V para nanospray; Resolución de Orbitrap = 60.000; Duración de exclusión dinámica = 30 s; Tipo de activación de MS/MS: CID, ETD o ambos; Rango de exploración masiva = 200-2,000; Control automático de ganancia = 4.0E5 (MS¹ en Orbitrap) y 5.0E4 (MS² en trampa de iones cuadrupolo lineal).
3. Cargue e inyecte la muestra de proteína digerida y etiquetada en el sistema LC y comience la adquisición de LC-MS/MS. Si la muestra ha sido congelada por flash, descongele antes del análisis. Desvíe el efluente LC a residuos durante los primeros 5 minutos para evitar que las sales excesivas entren en la fuente de ESI.
   NOTA: Generalmente se utiliza un bucle de inyección de 5 μL, lo que permite la inyección de aproximadamente 2,5 μg de proteína a la LC-MS/MS. Esto depende de las condiciones de carga de la LC para no obstruir el inyector de la muestra.

5. Análisis de datos

1. Identifique los sitios de la etiqueta DEPC y cuantifique las áreas pico del péptido usando el software apropiado para el espectrómetro de masas que se utiliza.
2. Incluya la adición de DEPC (72.02 Da) y la carbamidometilación (57.02 Da) como modificaciones variables. Los parámetros de búsqueda adicionales para el análisis de MS/MS son los siguientes: Escisión máxima omitida = 3; Tipos de iones de fragmentos = b e y; Tolerancia del precursor m/z = 10 ppm (este valor debería ser mayor si se utiliza un espectrómetro de masas de trampa de iones cuadrupolo); Tolerancia m/z del fragmento = 0,5 Da (este valor debe ser menor si se utiliza un espectrómetro de masas de alta resolución para un escaneo iónico del producto); Carga precursora = 1-4.
   NOTA: Diferentes algoritmos de búsqueda de base de datos tienen diferentes sistemas de puntuación, y muchos pueden tener dificultades para identificar péptidos modificados por DEPC porque los niveles de modificación pueden ser bajos. Ajustar el punto de corte de puntuación puede ser necesario para identificar más péptidos etiquetados. Si es así, entonces la interrogación manual de los datos de MS/MS se debe utilizar para verificar los péptidos de baja puntuación. El producto de la hidrólisis de la etiqueta DEPC no se incluye en la búsqueda de datos porque el DEPC hidrolizado ya no es reactivo hacia las cadenas laterales nucleofílicas.
3. Determinar los porcentajes de modificación del nivel de residuos utilizando las áreas de pico cromatográfico de las versiones modificadas y no modificadas de los péptidos.
   NOTA: Cualquier péptido que contenga el residuo modificado de interés debe ser considerado y todos los estados de carga que se incluyen deben estar presentes en todas las muestras medidas. Los péptidos que tienen diferentes eficiencias de ionización y eluting en diferentes momentos hace que este valor sea una medida relativa en lugar de absoluta de la modificación de un sitio específico.
   
   donde A_i,z representa el área máxima de cualquier péptido dado (i) que contiene el residuo de interés y considera todos los estados de carga detectados (z).
4. Determine si un cambio de etiquetado entre una muestra de control y experimental es significativo mediante una evaluación estadística. Tres mediciones de réplica para cada muestra es típica, y las pruebas t se utilizan con mayor frecuencia con intervalos de confianza de 95 o 99%.

Identificación de sitios de modificación de DEPC y porcentajes de modificación
La adición de masa debida al etiquetado covalente puede medirse en los niveles (a) de proteínas intactas y (b)^{péptidos 8,9.} A nivel intacto, se puede obtener una distribución de especies de proteínas con diferentes números de etiquetas a partir del análisis directo o LC-MS de muestras de proteínas etiquetadas. Para obtener información estructural de mayor resolución (es decir, datos de etiquetado específicos del sitio), las mediciones deben realizarse a nivel de péptido. Después de los pasos de etiquetado y temple, las proteínas etiquetadas se someten a análisis proteómicos de abajo hacia arriba (es decir, reducción de disulfuro, alquilación, digestión proteolítica y LC-MS/ MS). La Figura 3 muestra cómo se identifican los sitios etiquetados con DEPC y se calculan sus niveles de modificación para un experimento DEPC CL-MS en la proteína β-2-microglobulina (β2m)21. Ms/ms se utiliza para secuenciar los péptidos etiquetados y localizar sus sitios etiquetados de DEPC, mientras que los porcentajes de modificación se calculan a partir de sus áreas de pico relativas en cromatogramas de iones extraídos (Ver Figura 3A).

Mapeo de la superficie de proteínas utilizando DEPC CL-MS
Debido a la relación entre la topología de proteínas y la tasa de etiquetado, dePC se ha utilizado para estudiar los cambios en la estructura de orden superior de proteínas (HOS) e identificar los sitios de interacción de proteínas^8,9. Un ejemplo es el efecto de la unión de Cu(II) sobre la estructura de β2m. Los coeficientes de tasa de modificación de DEPC de fragmentos peptídicos de β2m no unidos y β2m unido a Cu (II) (b2m-Cu) pueden medirse(Tabla 2)variando las concentraciones de DEPC y generando gráficas cinéticas de segundo orden^14,24. La reactividad de DEPC de residuos en β2m-Cu revela cambios significativos en la tasa de etiquetado para His31, Ser33 y Thr4, mientras que otros sitios, incluidos diferentes residuos de His, no han cambiado estadísticamente. Estos datos son consistentes con el hecho de que His31, pero no otros residuos de His en β2m, se une a Cu causando cambios estructurales cerca de His31 (es decir, Ser33) y cerca del N-terminal (es decir, Thr4)(Figura 4)^14,26,27.

DEPC CL-MS para identificar cambios en HOS
El etiquetado DEPC con detección de EM también es una herramienta valiosa para caracterizar los cambios de HOS en las proteínas, lo que tiene implicaciones importantes para la terapéutica de proteínas, que actualmente son el segmento de más rápido crecimiento del mercado farmacéutico²⁸. DEPC CL puede identificar regiones proteicas específicas que sufren cambios estructurales tras el estrés térmico y oxidativo^18. Después de que β2m se expone al estrés por calor, muchos residuos que sufren disminuciones significativas en las extensiones de etiquetado (N-terminal, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58) se agrupan en un lado de la proteína, lo que sugiere que esta región de la proteína sufre un cambio conformacional o posiblemente media la agregación (Figura 5A). Además de estos residuos, después de que la proteína se expone al estrés oxidativo, otros residuos con una disminución en el etiquetado (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) forman un racimo en otra cara de la proteína, lo que indica que los cambios conformacionales inducidos por la oxidación ocurren en otra parte (Figura 5B). Otros trabajos de nuestro grupo también han demostrado que DEPC CL-MS puede detectar e identificar sitios de cambios conformacionales en la terapéutica de anticuerpos monoclonales estresados por calor^20.

DEPC CL-MS para estudiar las interacciones proteína-proteína
La comprensión de los sitios de interacción proteína-proteína y las interfaces de agregación para proteínas formantes de amiloide se puede obtener utilizando también el etiquetado DEPC⁹. Las disminuciones en los niveles de modificación de los residuos en la formación de oligómeros pueden revelar las interfaces de unión. DEPC CL-MS se utilizó para caracterizar los oligómeros pre-amiloides de β2m, que es la proteína que forma amiloides en la amiloidosis relacionada con diálisis^29,después de iniciar la formación de amiloide con Cu (II)^15,16,26. La comparación de la reactividad DEPC del monómero β2m con el dímero pre-amiloide β2m que se forma 2 h después de añadir Cu(II) muestra que nueve residuos sufren disminuciones en el etiquetado, mientras que seis residuos no experimentan ningún cambio o ligero aumento en el etiquetado (Figura 6A). Al mapear estos cambios en el β2m, es inmediatamente evidente que la interfaz del dímero involucra las láminas β ABED de monómeros β2m (Figura 6B)¹⁵.

DEPC CL-MS para estudiar la unión proteína-ligando
La unión de ligandos a proteínas conduce a disminuciones en la accesibilidad a disolventes de residuos que interactúan con el ligando, y CL-MS basado en DEPC se puede utilizar para identificar sitios de unión a ligandos en proteínas. Por ejemplo, los sitios de unión de epigallocatequina-3-galato (EGCG) en β2m en condiciones de formación de amiloide pueden identificarse por disminuciones significativas en el etiquetado DEPC en los residuos enterrados por la unión a EGCG. En presencia de ECGC, Lys6 y Lys91 tienen porcentajes de modificación de DEPC más bajos(Figura 7),y estos residuos se agrupan en una región de la proteína, lo que indica la protección de residuos debido a la unión de ligandos. El N-terminal, Thr4, y His31, mientras tanto, experimentan aumentos en las extensiones de etiquetado (Figura 7), que son indicativos de cambios estructurales inducidos por ECGC y sugieren que los sitios de unión de Cu (II) en β2m (N-terminal y His31)^14,30,31 pueden ser interrumpidos como resultado de la unión de ECGC³². Además, los sitios de unión de los otros dos inhibidores de moléculas pequeñas de la formación de amiloide β2m, rifamicina SV y doxiciclina, se han identificado utilizando CL-MS^19. En este estudio, sin embargo, los resultados del etiquetado DEPC por sí solos no fueron suficientes para mapear los sitios de unión con suficiente resolución estructural. Los resultados de tres reactivos diferentes de CL, a saber, DEPC, BD y 1-etil-3-(3-(dimetilamino)propil)carbodiimida - glicina éster etílico (EDC/GEE) par fueron necesarios para identificar mejor los sitios de unión¹⁹.

Mejora de la resolución estructural y reducción de la aleatorización de etiquetas
A pesar de que el etiquetado DEPC causa la formación de un enlace covalente, puede ocurrir una pérdida de etiqueta debido a la hidrólisis, especialmente para los residuos de Ser, Thr y Tyr(Figura 8). La pérdida de etiquetas se puede minimizar disminuyendo el tiempo entre la reacción DEPC CL y el análisis LC-MS utilizando digestiones proteolíticas cortas (por ejemplo, digestión de 2 h con enzimas inmovilizadas) en lugar de digestiones nocturnas. Las digestiones rápidas dan como resultado que se midan más residuos modificados, lo que aumenta la cantidad de información estructural de proteínas. Por ejemplo, una digestión de 2 h con quimotripsina inmovilizada conduce consistentemente a la identificación de más residuos modificados por DEPC en β2m(Figura 9)^17. Con una digestión nocturna se detecta aproximadamente el 75% de los residuos de Ser, Thr, Tyr, His y Lys en β2m, pero cuando el tiempo entre el etiquetado y lc-ms se reduce mediante el uso de una digestión de 2 h, se detecta el 95% de estos residuos en β2m. La mayoría de los residuos modificados recientemente detectados son residuos de Tyr y Thr que son propensos a la hidrólisis.

En el transcurso de nuestro trabajo con DEPC, hemos notado que en algunas proteínas, los residuos de Cys que provienen de enlaces disulfuro son modificados por DEPC, a pesar de que los enlaces disulfuro están intactos durante las reacciones de etiquetado DEPC. Tal etiquetado de los residuos de Cys se produce porque los tioles libres pueden reaccionar con otros residuos modificados en solución (Figura 10), lo que lleva a la llamada "aleatorización de etiquetas" ya que el grupo carbethoxy se transfiere al residuo de Cys. La aleatorización de etiquetas disminuye los niveles de modificación en otros residuos y proporciona información estructural de proteínas incorrecta. Para evitar la aleatorización de la etiqueta, los tioles cys libres deben estar completamente alquilados justo después de la reducción del disulfuro³³.

Figura 1: Espectrometría covalente de masas de etiquetado (CL-MS). Un reactivo monofuncional se utiliza para modificar aminoácidos accesibles al solvente y se puede utilizar para proporcionar información específica del sitio sobre cambios conformacionales o interfaces de interacción en proteínas (imagen superior frente a imagen inferior). La proteína modificada se digiere proteolíticamente, y los péptidos resultantes se analizan por cromatografía líquida (LC) junto con MS y MS en tándem (MS/MS). La figura ha sido adaptada de Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Interactions. Métodos 144, 79-93 (2018). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Tabla 1. Protocolo general de etiquetado DEPC.

Figura 2. Ejemplo de gradiente LC para la separación de péptidos. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3 Ilustración de cómo se identifican los sitios etiquetados de DEPC y se calculan sus niveles de modificación. Después del etiquetado DEPC y la digestión proteolítica, (A) se realiza el análisis LC-MS de la proteína digerida. Las áreas pico de los péptidos (B) no etiquetados y (C) etiquetados en un cromatograma se utilizan para calcular el porcentaje de etiquetado. Durante lc-ms, los péptidos se someten a CID MS / MS. Espectros de masas en tándem de (D) sin etiquetar y (E) & (F) etiquetados péptidos obtenidos en tiempos de retención específicos se utilizan para la secuenciación de péptidos y la identificación de sitios etiquetados DEPC. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Cuadro 2 Coeficientes de tasa de modificación de DEPC específicos del sitio (k, M^-1s^-1) para b2m en ausencia y presencia de Cu (II).

Figura 4 Uso de DEPC CL-MS para determinar el efecto de la unión de Cu(II) sobre la estructura de β2m: (A) Mapeo de la superficie de proteínas de los residuos con disminuciones significativas en las tasas de etiquetado de DEPC (azul), lo que indica cambios en su accesibilidad al disolvente sobre la unión a Cu(II), y aquellos sin cambios significativos en la tasa de etiquetado (magenta) (código de adhesión PDB 1JNJ). (B) Ejemplo de parcelas cinéticas de segundo orden específicas del sitio de la reacción de β2m con diferentes concentraciones de DEPC en presencia y ausencia de Cu(II). El coeficiente de velocidad de etiquetado (k) se puede obtener de la pendiente de la gráfica cinética. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5 Resultados de etiquetado covalente para β2m estresados frente a nativos: (A) Estrés térmico - calentamiento a 75 °C durante 24 h y (B) estrés oxidativo - con 3% H₂O₂ durante 24 h. Los cambios significativos en los porcentajes de modificación se muestran en azul (disminución en el etiquetado) y rojo (aumento en el etiquetado), mientras que los residuos sin cambios significativos en el etiquetado se muestran en verde pálido (código de adhesión PDB 1JNJ). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6 Uso de DEPC CL-MS para determinar la interfaz del dímero para el dímero pre-amiloide de β2m: (A) Resumen de los cambios en el nivel de modificación de DEPC para residuos modificados en el monómero (es decir, t = 0) y el dímero 2 h después de añadir Cu(II). Los residuos con disminuciones significativas en la extensión del etiquetado se indican con un asterisco (*). (B) Resultados del etiquetado covalente mapeados en la estructura β2m. Los residuos con etiquetado disminuido se muestran en azul y los residuos sin cambios o ligeros aumentos en el etiquetado se muestran en rojo (código de adhesión PDB 1LDS). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 7 Resultados de etiquetado covalente para EGCG-limitado contra b2m sin consolidar. Los porcentajes de modificación de DEPC se muestran para los residuos mostrados. Las diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de etiquetado covalente se denotan con un asterisco (*). Los aumentos en el etiquetado sobre la unión a ECGC se muestran en rojo, mientras que las disminuciones se muestran en azul. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 8 Reacciones de etiquetado covalente DEPC (sustitución nucleofílica de acil) y pérdida de etiqueta (hidrólisis de residuos carbetoxilados) Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 9 Mapeo de los sitios de modificación medidos en β2m. (A) sitios etiquetados después de la digestión de noche convencional, y (b) sitios etiquetados después de una digestión de 2 h con quimotripsina inmovilizada. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 10 Mecanismo hipotético de la aleatorización de la etiqueta DEPC (captura cys de carbethoxylated His) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Pasos críticos
Se deben considerar varios puntos relacionados con el diseño experimental para garantizar resultados de etiquetado confiables. En primer lugar, para maximizar el etiquetado de proteínas, es necesario evitar los tampones con grupos fuertemente nucleófilos (por ejemplo, Tris) porque pueden reaccionar con DEPC y reducir el alcance del etiquetado. También es concebible que tales tampones puedan reaccionar con residuos etiquetados, causando la eliminación de la etiqueta y, por lo tanto, la pérdida de información estructural. Recomendamos MOPS como un tampón, pero la solución salina tamponada de fosfato también funciona. En segundo lugar, el ditiothreitol se debe evitar para la reducción de los enlaces del disulfuro porque los tioles libres en este reactivo pueden reaccionar con los residuos marcados y quitar la modificación de DEPC. Esta misma química es la razón por la que es esencial alquilar disulfuros reducidos porque cys libre puede causar la aleatorización de etiquetas intra-proteína³³. En tercer lugar, el paso de temple con imidazol (paso de protocolo 2.4) es fundamental para detener la reacción de etiquetado, por lo que cualquier DEPC restante no puede continuar reaccionando con la proteína.

También es importante apreciar que la reacción de etiquetado DEPC es de^2º orden, lo que significa que cambiar la proteína o la concentración de DEPC afectará el alcance del etiquetado. Hemos encontrado empíricamente que una relación de concentración de 4:1 DEPC:proteína es un valor razonable cuando la proteína tiene una concentración en los 10 de rango de μM, ya que tiende a evitar cualquier cambio estructural inducido por el etiquetado^14. Sin embargo, la relación óptima de concentración de DEPC:proteína es dependiente de la proteína, así como dependiente de la concentración, y algunas proteínas requieren proporciones más altas para lograr un etiquetado suficiente. La concentración óptima de DEPC para minimizar la perturbación estructural del etiquetado de una proteína dada se puede estimar a partir del número de disolventes accesibles a los residuos de His y Lys^23.

Para evitar la variabilidad en las extensiones de etiquetado debido a la degradación de los reactivos a lo largo del tiempo, lo ideal es que el control y las reacciones experimentales se realicen el mismo día. DEPC se somete a una hidrólisis rápida cuando se expone al agua y también se degradará durante el almacenamiento, por lo que las buenas prácticas de laboratorio y el manejo de reactivos son clave. Cuando no esté en uso, la botella de stock DEPC debe almacenarse en un desecador.

Modificaciones y solución de problemas
Debido a que DEPC CL es una reacción cinéticamente controlada, la tasa de etiquetado, y por lo tanto el nivel de modificación, están controlados por las concentraciones de proteínas y reactivos, el tiempo de etiquetado y la temperatura. Como se indicó anteriormente, a menudo de DEPC CL se realiza durante 1 minuto a 37 °C con una relación de DEPC a la proteína molar de 4 a 1. En esta relación molar (4x), las proteínas pueden ser etiquetadas con seguridad sin perturbaciones estructurales¹⁴. Depc: las proporciones molares de proteína que son mayores que 4 se pueden utilizar para algunas proteínas, y no es sorprendente que las concentraciones más altas de DEPC resulten en un etiquetado más extenso y más información estructural. La forma más segura de utilizar concentraciones más altas de DEPC sin perturbar la estructura es generar gráficas dosis-respuesta en las que la reactividad de los fragmentos proteolíticos de una proteína se mide en función de la concentración de DEPC (ver Figura 4B)^14,24. Sin embargo, este enfoque puede llevar mucho tiempo, ya que requiere varias mediciones. Recientemente, hemos demostrado que la concentración óptima de DEPC puede estimarse para una proteína dada a partir del número y SASA de residuos de His y Lys en esa proteína^23. En trabajos recientes, también hemos sugerido formas alternativas de evaluar que la estructura de una proteína no está perturbada durante cl^9,24.

La digestión proteolítica también es un paso importante en DEPC CL-MS, ya que los péptidos que se generan permiten localizar la información estructural después del análisis lc-ms/ms. En general, las proteasas de serina como la tripsina y la quimotripsina son eficaces para la digestión de proteínas. La tripsina se usa más comúnmente debido a su eficiencia de escisión y especificidad en el lado C-terminal de los residuos de Lys y Arg. Sin embargo, la tripsina generalmente no se escinde después de los residuos de Lys etiquetados con DEPC, lo que causa una escisión perdida en los residuos de Lys etiquetados que a veces pueden complicar el análisis de datos. La actividad de la quimotripsina, que se escinde después de residuos hidrofóbicos voluminosos, normalmente no se ve afectada por el etiquetado DEPC, pero esta enzima tiene menor eficiencia de escisión y especificidad que la tripsina. Además, para proteínas con numerosos residuos hidrofóbicos, la quimotripsina puede generar varios fragmentos de péptidos cortos que pueden ser difíciles de separar y detectar en condiciones estándar de LC-MS.

Los análisis LC-ESI-MS/MS de los resúmenes de proteínas requieren un electrospray estable para obtener resultados semicuantitativos fiables. Capilar y nano LC son plataformas de separación de uso común donde se puede obtener una separación eficiente con pequeñas cantidades de proteína. Sin embargo, en nuestra experiencia, la LC capilar proporciona información cuantitativa más confiable (es decir, niveles de modificación) que la nano LC debido a las cantidades de muestra más altas que se utilizan. Para las proteínas grandes que se digieren en un gran número de péptidos etiquetados y no etiquetados, la coelución de péptidos con hidrofobicidad similar puede ocurrir. En estos casos, se deben utilizar gradientes LC más largos para mejores separaciones.

La MS/MS rápida y eficiente es importante para una buena cobertura de secuencias y la identificación del sitio de etiquetas. Los espectrómetros de masas con trampas de iones cuadrupolos son excelentes instrumentos para este propósito. Generalmente, el CID es un método común y altamente eficaz para la disociación del péptido; sin embargo, hemos observado casos de aleatorización de etiquetas DEPC durante el CID de iones peptídicos etiquetados, resultando en ambigüedad en la identidad del sitio de etiquetado^34. En estos casos un tanto raros, ETD proporciona la información que es más confiable. En consecuencia, si es posible, alternar entre ambas técnicas de disociación puede ser útil. Debido a que DEPC puede etiquetar muchos tipos de residuos diferentes, es común que se generen isómeros de un fragmento de péptido dado que difieren en la cadena lateral que se modifica. Muchas veces, estos isómeros peptídicos pueden ser separados por LC, aunque tienden a eluir en momentos muy similares. Esta probabilidad debe tenerse en cuenta al establecer los tiempos de exclusión de MS/MS durante los análisis automatizados de LC-MS/MS. Por lo general, se deben utilizar tiempos de exclusión más cortos de lo habitual.

Limitaciones
Mientras que DEPC CL-MS es tremendamente beneficioso para el estudio de la estructura de la proteína y las interacciones, y se ha hecho un progreso significativo para abordar una amplia variedad de sistemas de proteínas, algunas limitaciones de esta técnica permanecen. Si las condiciones de etiquetado no están bien optimizadas (por ejemplo, utilizando una concentración demasiado alta de DEPC), el etiquetado excesivo puede perturbar la estructura de la proteína y dar lugar a información estructural inexacta^14,23,24. Además, la exactitud y precisión de los niveles de modificación medidos se ve afectada por varios factores, incluida la pérdida de la etiqueta si las muestras se sientan demasiado tiempo antes del análisis LC-MS y los errores en los pasos de etiquetado químico. La consistencia en cada paso experimental es importante para obtener resultados confiables. Uno de los problemas más desafiantes actualmente asociados con CL-MS basado en DEPC es el software de análisis de datos. Los programas de análisis de datos fácilmente disponibles no están optimizados para identificar con éxito péptidos con bajos porcentajes de modificación (por ejemplo, < 1%). En consecuencia, hemos desarrollado y utilizado software especializado para permitir que los péptidos con bajos niveles de modificación sean fácilmente identificados¹⁸.

A pesar de que DEPC CL-MS puede proporcionar una resolución estructural de proteínas moderada, no se puede obtener una estructura 3D detallada de la técnica de etiquetado. Recientemente, se han desarrollado algunas herramientas de predicción estructural basadas en datos de etiquetado^35,36. Sin embargo, se requieren más desarrollos para incorporar de manera óptima los resultados del etiquetado DEPC con modelos computacionales para predecir la estructura de las proteínas.

Importancia en comparación con métodos alternativos
La resolución estructural posible con CL-MS basado en DEPC es moderada en comparación con técnicas como la cristalografía de rayos X o rmn, por lo que es más apropiado comparar la técnica con HDX-MS, XL-MS y otros enfoques de CL-MS o huella. Como se mencionó en la introducción, CL-MS es complementario a HDX-MS porque proporciona información sobre las cadenas laterales de residuos en una proteína, mientras que HDX-MS informa sobre la estructura y dinámica de la columna vertebral. Esta complementariedad permite utilizar las dos técnicas juntas para obtener más información estructural, como han demostrado varios grupos^{37,38,39,40,41.} Una idea emergente relevante para CL-MS basado en DEPC es la información sinérgica que está disponible cuando se utiliza junto con HDX-MS^22. Debido a los plazos de etiquetado asociados con las dos técnicas, CL-MS basado en DEPC a menudo puede aclarar la ambigüedad con las regiones de proteínas que experimentan una disminución de HDX. La disminución de HDX puede surgir de la reducción de la accesibilidad al disolvente debido a la unión o a la disminución de la dinámica de las proteínas. Las reacciones DEPC son inherentemente 2-3 órdenes de magnitud más lentas que las reacciones HDX, por lo que el etiquetado DEPC no se ve afectado en gran medida por los cambios en la dinámica de las proteínas, siempre y cuando no vayan acompañadas de cambios en la accesibilidad del disolvente.

CL-MS tiene algunas ventajas sobre los experimentos HDX-MS en que la aleatorización de etiquetas y la pérdida de etiquetas son mínimas cuando se toman las precauciones adecuadas. En los experimentos de HDX, la pérdida de etiquetas o el intercambio de espaldas es una característica estándar de la técnica, y las digestiones rápidas y las separaciones de LC a pH bajo son intentos de minimizar este problema. Es importante reconocer, sin embargo, que el problema de intercambio posterior se contrarresta por el mayor número de sitios etiquetados que normalmente se miden en HDX-MS. La aleatorización del etiquetado es un problema mayor en HDX-MS porque se obtenería información incorrecta, por lo que las condiciones de análisis deben optimizarse para minimizar esta preocupación.

XL-MS y CL-MS tienen ventajas similares con respecto a la pérdida de etiqueta y aleatorización, ya que ambos implican la formación de un enlace covalente que es lo suficientemente robusto como para permanecer durante la digestión y los análisis de LC-MS. La secuenciación y la identificación de péptidos reticenlazados, sin embargo, es más difícil que para los péptidos etiquetados covalentemente, que requieren el uso de software especializado. Una ventaja clave que XL-MS tiene sobre CL-MS es su capacidad para proporcionar restricciones de distancia, que pueden ser valiosas al predecir o reducir las posibles estructuras de proteínas. Los datos de CL-MS se han utilizado para facilitar la predicción de la estructura de las proteínas^36,42,43,pero esta área requiere más trabajo para alcanzar plenamente su potencial.

En comparación con otros métodos de CL-MS, incluidos los que utilizan reactivos de etiquetado específicos o no específicos, DEPC tiene algunas ventajas y desventajas. Al igual que los métodos que utilizan reactivos específicos de aminoácidos, el etiquetado DEPC es sencillo; el reactivo sólo necesita ser añadido a la muestra de interés. Esta simplicidad contrasta con métodos como la oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) o la HRF basada en sincrotrón que requieren fuentes de luz sofisticadas para producir radicales hidroxilo. A diferencia de los métodos que utilizan reactivos específicos, DEPC puede etiquetar seis aminoácidos diferentes y el N-terminal, lo que le permite proporcionar una mayor resolución estructural. Sin embargo, el número de residuos que pueden ser etiquetados por DEPC son menores que el número que puede ser oxidado por los radicales hidroxilo, por lo que la resolución estructural obtenible por CL-MS basado en DEPC es menor. Una ramificación práctica de que menos residuos sean etiquetados por DEPC es que el uso del reactivo a veces no proporciona toda la información estructural deseada, por lo que puede beneficiarse de ser utilizado junto con otros reactivos de etiquetado. Recientemente hemos demostrado el valor del uso de DEPC junto con el par reactivo 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/éter etílico de glicina (GEE), que puede etiquetar residuos de glutamato y aspartato^19.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores reconocen el apoyo de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) bajo la Subvención R01 GM075092. El espectrómetro de masas Thermo Orbitrap Fusion utilizado para adquirir algunos de los datos descritos aquí fue adquirido con fondos de la subvención S10OD010645 de los Institutos Nacionales de Salud.