Minería de genes y análisis de secuencias de purina nucleosidasa basadas en RNA-Seq

En este protocolo, se describió un método para la minería de genes y el análisis de secuencias de purina nucleosidasa (PN, EC:3.2.2.1) basado en RNA-Seq. Se aplicó el análisis ProtProm para mostrar las estructuras secundarias y terciarias únicas de la NP. Además, el gen PN se clonó a partir del transcriptoma para verificar la fiabilidad de los resultados de RNA-Seq.

El hongo oruga (Ophiocordyceps sinensis) es uno de los hongos más valorados de la medicina tradicional china (MTC), y contiene muchos ingredientes activos como la adenosina. La adenosina se considera un ingrediente biológicamente eficaz que tiene una variedad de actividades antitumorales e inmunomoduladoras. Con el fin de dilucidar aún más el mecanismo de la nucleosidasa de purina (PN) en la biosíntesis de adenosina, se extrajo con éxito un gen que codifica PN y se analizó más a fondo sobre la base de datos RNA-Seq de hongos oruga. El ADNc completo de la PN fue de 855 pb, que codificó 284 aminoácidos. El análisis BLAST mostró la homología más alta del 85,06% con la nucleósido hidrolasa en NCBI. El análisis ProtProm mostró que el peso molecular relativo fue de 30,69 kDa y el punto isoeléctrico fue de 11,55. La estructura secundaria de la NP fue predicha por Predict Protein; Los resultados mostraron que la estructura de hélice alfa representó el 28,17%, la estructura de hebra representó el 11,97% y la estructura de bucle representó el 59,86%. Además, el gen PN se clonó a partir del transcriptoma y se detectó mediante electroforesis en gel de agarosa para su verificación. Este estudio proporciona una base científica más suficiente y nuevas ideas para la regulación genética de la biosíntesis de adenosina en la medicina tradicional china fúngica.

La medicina tradicional china (MTC) fúngica tiene abundantes recursos de especies ^1,2. El hongo oruga (Ophiocordyceps sinensis) es un conocido hongo de la medicina tradicional china y se considera una fuente de fármacos innovadores ^3,4. El hongo oruga es una mezcla combinada de gusanos y hongos que se encuentra en la meseta tibetana en el suroeste de China, donde Hirsutella sinensis es parásito del cuerpo de la oruga⁵. Actualmente, H. sinensis se reporta como el único anamorfo del hongo oruga de acuerdo con la evidencia de biología molecular y morfológica ^6,7, y tiene menor toxicidad asociada y eficacia clínica similar en comparación con el hongo oruga silvestre⁸. Se reveló que H. sinensis posee una variedad de ingredientes biológicamente efectivos, como nucleósidos, polisacáridos y ergosteroles, con amplios efectos farmacológicos como la reparación de una lesión hepática ^9,10,11. La adenosina es un ingrediente activo típico aislado del hongo de la oruga, y es un tipo de alcaloide de purina¹². La adenosina tiene una variedad de actividades biológicas: antitumorales, antibacterianas e inmunomoduladoras^13,14. Desafortunadamente, el mecanismo biosintético de la adenosina, así como los genes clave involucrados, aún no están claros^15,16.

La adenosina muestra principalmente su efecto antitumoral a través de acciones inmunosupresoras en el microambiente tumoral¹⁷. Se relató que la adenosina mostró funciones inmunosupresoras, lo cual fue crítico para iniciar la reparación de los tejidos después de una lesión y para proteger los tejidos contra la inflamación excesiva^18,19. Además, se demostró que la represión de la inmunidad mediada por adenosina podría perjudicar gravemente la inmunovigilancia del cáncer, así como promover el crecimiento^{tumoral 20}. Por lo tanto, es urgente estudiar el mecanismo de biosíntesis de adenosina para su amplia aplicación en antitumorales.

Se informó que una visión completa de los genes expresados y sus niveles de expresión podría llevarse a cabo sistemáticamente mediante la secuenciación de próxima generación del transcriptoma²¹. Además, se aplicó la secuenciación y el análisis del transcriptoma para predecir los genes implicados en la ruta biosintética de los ingredientes activos e investigar más a fondo la interacción de diferentes vías biosintéticas²². La purina nucleosidasa (PN, EC 3.2.2.1) es una clase de nucleosidasa con especificidad de sustrato para los nucleósidos de purina, que pueden hidrolizar los enlaces glucósidos de los nucleósidos de purina en azúcares y bases²³. Por lo general, desempeña un papel importante en la biosíntesis de adenosina. Se reportó que se predijo la vía biosintética de la adenosina en la MTC fúngica; La qPCR y la expresión génica mostraron que el aumento de la acumulación de adenosina es el resultado de la regulación negativa del gen de la NP , lo que indica que el gen de la NP puede desempeñar un papel importante en la biosíntesis de adenosina¹⁵. Por lo tanto, el mecanismo de la NP en la biosíntesis de adenosina debe aclararse urgentemente. Sin embargo, la información de la secuencia y la estructura proteica de la NP, así como otros genes clave implicados en la biosíntesis de adenosina de la MTC fúngica, no se han estudiado más a fondo.

En este estudio, se extrajo una nueva secuencia del gen PN a partir de datos de RNA-Seq del hongo oruga y se verificó mediante clonación de genes. Además, se analizaron exhaustivamente las características moleculares y la estructura proteica de la NP, lo que podría proporcionar nuevas direcciones e ideas para la regulación génica de la biosíntesis de adenosina.

NOTA: Una cepa de hongo anamorfo de oruga (H. sinensis) fue depositada en nuestro laboratorio. Escherichia coli Los DH5 fueron preservados por el Hospital de Shenzhen de la Universidad de Medicina China de Beijing.

1. Preparación para RNA-Seq

1. Recolección de micelios
   1. Preparar el medio de fermentación para la fermentación de H. sinensis: harina de maíz en polvo (1%), pupas de gusano de seda (1,5%), extracto de levadura (0,5%), triptona (1%), glucosa (1,5%), salvado (1,5%), dextrina (0,5%), KH₂PO₄ (0,02%) y MgSO₄ (0,01%).
   2. Prepare la inoculación con un medio de fermentación al 10% para el cultivo a escala (agregue 10 mL de medio por cada 100 mL de medio). Realizar la fermentación sumergida a 16 °C en un agitador rotativo a 150 rpm durante 10 días.
   3. Se reproducen asexualmente y cosechan micelios del hongo anamorfo de la oruga durante 10 días. Centrifugar el medio fermentado y desechar el sobrenadante después de la centrifugación. Suspender el micelio añadiendo 100 mL de agua ultrapura durante 3 veces y eliminar el sobrenadante por centrifugación. Muele el micelio limpio hasta convertirlo en polvo con nitrógeno líquido.
2. Secuenciación de ARN
   1. Extraiga el ARN total del anamorfo del hongo oruga de acuerdo con los protocolos del fabricante (Tabla de Materiales) y posteriormente trate la muestra con DNasa I libre de ARNasa (Tabla de Materiales).
   2. Aísle el ARNm de los sistemas de aislamiento de ARNm PolyATtract de ARN total y aísle el ARNm poli(A) utilizando perlas con oligo(dT) de acuerdo con los protocolos del fabricante (Tabla de materiales).
   3. Tome los fragmentos cortos como plantillas para sintetizar el ADNc de primera hebra mediante hexámeros-cebadores aleatorios de acuerdo con los protocolos del fabricante (Tabla de Materiales). Realizar la síntesis de ADNc de segunda cadena de acuerdo con los protocolos del fabricante.
   4. Posteriormente, generar las librerías de secuenciación utilizando el Ultra RNA Library Prep Kit según los protocolos del fabricante (Tabla de Materiales).
   5. Purificar fragmentos cortos mediante kit de extracción por PCR según los protocolos del fabricante (Tabla de Materiales) y resolverlos mediante tampón EB, respectivamente.
   6. Conectar los fragmentos cortos (umbral de 300 pb) con adaptadores de secuenciación según el resultado de la electroforesis en gel de agarosa.
   7. A continuación, realice la amplificación con PCR utilizando las plantillas seleccionadas de los fragmentos adecuados.
   8. Secuenciación de la biblioteca por Illumina HiSeq 4000 con secuenciación de extremos emparejados de acuerdo con los protocolos del fabricante. Filtre las lecturas sin procesar de los datos de secuencia sin procesar para obtener datos limpios. Adopte el ensamblado denovo para obtener Unigenes con la menor cantidad de Ns que no se pueden extender en ninguno de los extremos.
   9. Alinee secuencias Unigene por blastx con bases de datos de proteínas como nr, Swiss-Prot, KEGG y COG (valor e < 0,00001). Recupere las proteínas con la mayor similitud de secuencia con los Unigenes dados junto con sus anotaciones funcionales de proteínas. Resumir los resultados de RNA-Seq (Tabla de Materiales).
      NOTA: Se utilizaron kits comerciales en los pasos anteriores y todas las operaciones se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2. Minería génica de la purina nucleosidasa

1. Descargue los archivos de los resultados de RNA-Seq en la computadora. Encuentre los archivos de resultados de anotación de Unigenes ensamblados a partir de los resultados de RNA-Seq.
   NOTA: Las lecturas de extremos emparejados se utilizaron nuevamente para el llenado de espacios de andamios para obtener secuencias con un mínimo de Ns que no se pueden extender en ninguno de los extremos. Tales secuencias se definieron como Unigenes. La anotación Unigene proporciona información de la expresión y la anotación funcional de Unigene.
2. Abra la ruta Archivos de anotación e introduzca el mapa 00230 en la barra de búsqueda; luego busque metabolismo de las purinas (map00230) en la clasificación KEGG de archivos de anotaciones.
3. Marque EC:3.2.2.1 (PN) en rojo en el mapa anotado 00230 e indique que se ensamblaron Unigenes que se han anotado en PN.
   NOTA: Había tres Unigenes (Unigene10777, Unigene14697 y Unigene17827) anotados en PN después de hacer clic en el número EC 3.2.2.1 y se muestran en el mapa anotado 00230.
4. Haga clic en el número EC 3.2.2.1 y muestre la información Unigenes anotada.
5. Abra el software LTFViewer e importe el archivo Unigene.fa con un acceso directo Ctrl-O y muestre la información de la secuencia de Unigenes ensamblados.
6. Busque información de secuencia de Unigene10777, Unigene14697 y Unigene17827 con un método abreviado Ctrl-F .
7. Descargue la información de secuencia de Unigene10777, Unigene14697 y Unigene17827 con los accesos directos Ctrl-C y Ctrl-V.
8. Elimine Unigene10777 y Unigene17827 con secuencias excesivamente cortas de marco de lectura abierto (ORF).
   NOTA: La información básica de la secuencia se mostraba en el software LTFViewer.
9. Seleccione Unigene14697 (tamaño 1.705 pb, espacio 0 0%) con la longitud adecuada de ORF para un estudio más detallado.

3. Análisis bioinformático

1. Análisis del ORF del gen PN mediante ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).
   1. Pega la secuencia en el cuadro. Elija los parámetros de la siguiente manera, longitud mínima de ORF (nt): 75, código genético: 1. estándar, codón de inicio de ORF a usar: ATG solamente. Haga clic en el botón Enviar para obtener la información de ORF.
2. Utilice la herramienta ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html) para calcular la masa molecular teórica y el punto isoeléctrico.
   1. Pegue la secuencia de aminoácidos (en código de una letra) en el cuadro y haga clic en el botón Calcular parámetros para obtener los resultados.
3. Aplique SignalP5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) para predecir los péptidos señal.
   1. Introduzca secuencias de proteínas en formato FASTA. Elija los parámetros de la siguiente manera, grupo de organismos: Eukarya, formato de salida: Salida larga. Haga clic en el botón Enviar para obtener los resultados.
4. Aplique BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para analizar la homología de las secuencias de proteínas.
   1. Haga clic en el botón Protein Blast e ingrese la secuencia en el cuadro. Elija los parámetros de la siguiente manera, base de datos: Secuencias de proteínas no redundantes (nr), algoritmo: blastp (proteína-proteína BLAST). Haga clic en el botón Explosión para obtener los resultados.
5. Aplique el programa Clustal X (http://www.clustal.org/) para alinear las secuencias ácidas de PN de diferentes hongos.
   1. Cargue un archivo o pegue las secuencias en el cuadro. Establezca los parámetros de la siguiente manera, formato de salida: ClustalW con recuentos de caracteres. Haga clic en el botón Enviar para obtener los resultados. Clustal X solo puede reconocer archivos en formato FASTA, y la ruta de los archivos solo puede incluir nombres en inglés.
6. Utilice MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/) para llevar a cabo el árbol filogenético.
   1. Abra el software y haga clic en el botón Archivo para cargar las secuencias. Seleccione el tipo de datos como Secuencias de proteínas, haga clic en el botón Aceptar para continuar con el siguiente paso. Posteriormente, haga clic en el botón Filogenia y seleccione Filogenia de prueba de Bootstrap, y luego haga clic en Árbol de unión de vecinos. Seleccione los parámetros predeterminados y haga clic en el botón Calcular para obtener los resultados.
7. Aplique InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) para identificar el dominio catalítico de la PN.
   1. Introduzca la secuencia en el cuadro. Seleccione los parámetros predeterminados y haga clic en el botón Buscar para obtener los resultados.
8. Aplique Predict Protein (http://www.predictprotein.org/) en línea para predecir la estructura secundaria de la proteína.
   1. Ingrese una secuencia de aminoácidos (código de una letra) en el cuadro y luego haga clic en el botón predictProtein para obtener los resultados.
9. Aplicar las herramientas en línea SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) para evaluar la estructura tridimensional de PN²⁴.
   1. Haga clic en el botón Iniciar modelado y pegue la secuencia de destino en el cuadro. Rellene el título del proyecto y la información del correo electrónico y haga clic en el botón Buscar plantillas para obtener los resultados.

4. Clonación de genes y construcción de plásmido recombinante

1. Los cebadores de diseño cuya imprimación inversa contenía un sitio NotI y la imprimación directa tenía un sitio EcoRI.
2. Muestre el cebador delantero como: AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3'), y el cebador reverso como: ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') de Primer Express.
3. Prepare los cebadores, así como el ADNc del hongo oruga para la clonación del gen PN . Realice la PCR de la siguiente manera: predesnaturalización a 95 °C durante 5 min, desnaturalización a 94 °C durante 45 s, renaturalización a 55 °C durante 60 s, extensión a 72 °C durante 90 s, repetición durante 35 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min.
4. Obtener los fragmentos de PCR y detectarlos mediante electroforesis en gel de agarosa para su verificación. Ligue los fragmentos de PCR con pMD18-T. Conduzca el sistema de ligadura de PMD18-T de la siguiente manera: 1 μL de PMD18-T, 4 μL de Solution1 y 5 μL de gen diana. Configure las condiciones de la siguiente manera: mantenimiento a 16 °C durante 16 h, inactivación a 65 °C durante 15 min.
5. Transfiera los plásmidos recombinantes a las células competentes de E. coli JM109 de acuerdo con el manual de operación²⁵.
6. Digiera los plásmidos recombinantes pMD18-T/PN y el vector ppic9K con EcoRI y Not I. Liguelos fragmentos después de la digestión por la ADN ligasa T4.
7. Construya el plásmido recombinante ppic9K/PN para una mayor expresión heteróloga.

La secuencia ORF del gen PN tenía una longitud de 855 pb, que codificaba 284 aminoácidos con una masa molecular calculada de 30,69 kDa y un punto isoeléctrico previsto de 11,55, lo que indica que la PN es una proteína alcalina. Se llevó a cabo la aplicación del servidor SignalP4.0 para identificar el péptido señal, y los resultados indicaron que la PN no tiene péptidos señal. Además, los resultados de la búsqueda BLASTP indicaron que la NP originada a partir de un hongo oruga compartía la identidad más alta (85,06%, valor E = 1e-88) con la nucleósido hidrolasa de Purpureocillium lilacinum (OAQ81830,1). Además, se aplicó el programa ClustalX para realizar el alineamiento de secuencias múltiples de PN y los resultados se mostraron en la Figura 1, que reveló que 11-166 aminoácidos eran las secuencias de aminoácidos conservadas del dominio inosina/uridina hidrolasa. Posteriormente, el resultado del árbol filogenético mostró que la PN del hongo oruga compartía la relación filogenética más cercana con otros nucleósidos hidrolasa del hongo entomógeno como Purpureocillium lilacinum (OAA82129.1, XP 018708456.1) en base a la similitud de las secuencias de aminoácidos (Figura 2). Mientras tanto, el resultado del análisis de InterPro Scan reveló que la PN tenía un dominio catalítico de nucleósido hidrolasa (IPR023186), que prefiere la inosina/uridina.

Posteriormente, la estructura secundaria de la proteína PN fue predicha por Predict Protein, los resultados se mostraron en la Figura 3, indicando que la estructura de hélice alfa representó el 28.17%, la estructura de la hebra representó el 11.97% y la estructura del bucle representó el 59.86%. La estructura terciaria de la proteína PN se construyó mediante simulación de modelo suizo (Figura 4), y los resultados fueron similares a los predichos por Predict Protein. Según el software de análisis en línea CDS, la PN pertenece a la familia de las nucleósidos hidrolasas y cataliza la hidrólisis de todos los nucleósidos de purina y pirimidina que se producen comúnmente en ribosa y la base asociada, pero tiene preferencia por la inosina y la uridina como sustratos.

El ORF del gen PN se amplificó por PCR; los productos de PCR se detectaron mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 5). Los resultados indicaron que los productos de PCR con los tamaños correctos se amplificaron con éxito.

Figura 1: Alineación múltiple de secuencias de aminoácidos para PN de TCM fúngica y otras nucleósidos hidrolasas. Las secuencias fueron las de Trichoderma guizhouense (OPB46800.1), Purpureocillium lilacinum (OAQ81830.1) y Purpureocillium lilacinum (XP_018180602.1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Árbol filogenético de PN que muestra la relación con otras especies en secuencias de aminoácidos de nucleósido hidrolasa. El árbol filogenético se construyó con MEGA 4.0 con el método Neighbor-Joining. La prueba de filogenia inferida fue Bootstrap para 1.000 réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Predicción de la estructura secundaria para PN. El azul representa la hebra y el rojo oscuro representa la hélice. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: La estructura terciaria de la proteína PN predicha por el modelo suizo. El tipo de familia de NP pertenece a la nucleósido hidrolasa que prefiere la inosina/uridina, que tiene preferencia por la inosina y la uridina como sustratos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Electroforesis en gel de agarosa del gen PN clonado del transcriptoma del hongo oruga. Carril M: Marcador de ADN Trans2K Plus II; carril 1, productos de PCR del gen PN . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La salud humana se enfrenta a una serie de problemas médicos importantes como enfermedades tumorales, cardiovasculares y cerebrovasculares^26,27. La medicina tradicional china ha sido considerada como la fuente de investigación y desarrollo de medicamentos innovadores, debido a sus ricos recursos de especies y a la diversa estructura y funciones de los ingredientes activos^28,29. El hongo oruga es un parásito fúngico en las larvas de lepidópteros, y es un vigorizante en la tradición china y considerado como uno de los mejores vigorizantes con Panax y Cuernos de Pilose³⁰. De la MTC^29,31 se pueden extraer una variedad de ingredientes activos como adenosina, esteroles, nucleósidos, terpenos y péptidos. Los ingredientes activos tienen una variedad de actividades fisiológicas y tipos estructurales, y pueden ser utilizados como fuente para la investigación y aplicación de medicamentos innovadores³².

Hasta ahora, ha habido muchos informes sobre los efectos farmacológicos de la adenosina. Sin embargo, los estudios sobre la biosíntesis de adenosina, así como los genes implicados en ella, fueron escasos^16,33. Sin embargo, se llevó a cabo la anotación KEGG de genes funcionales en Cordyceps militaris y se especuló sobre la vía biosintética de la adenosina; Se descubrió que la 5'-nucleotidasa puede ser un gen clave en la biosíntesis de adenosina³³. Otros estudios especularon sobre la vía biosintética de la adenosina; Se indicó que los genes de la adenosina quinasa y la 5'-nucleotidasa estaban involucrados en los procesos de fosforilación y desfosforilación en la vía metabólica de la adenosina^34,35. Además, se predijo la vía biosintética de la adenosina en la medicina tradicional china fúngica; Se demostró que el gen PN desempeña un papel importante en la biosíntesis de adenosina, ya que la regulación negativa del gen PN fue consistente con la acumulación de adenosina¹⁵. Desafortunadamente, los genes clave involucrados en la biosíntesis de adenosina carecían de minería y análisis en profundidad. Por lo tanto, es urgente realizar el estudio de la minería de genes y el análisis de secuencias de los genes clave involucrados en la biosíntesis de adenosina.

En general, el desarrollo de la biotecnología requiere cada vez más recursos genéticos³⁶. En comparación con los métodos tradicionales de minería de genes, incluido el cribado microbiano para la obtención de recursos genéticos mediante biología molecular³⁷, las técnicas metagenómicas para la extracción de nuevos recursos genéticos³⁸ y la clonación de la secuencia de proteínas naturales después de la purificación³⁹, el protocolo de minería de genes aplicado en este estudio es más eficiente y preciso. Además, este trabajo se centra en cómo realizar la minería de genes y el análisis de secuencias de enzimas funcionales implicadas en la biosíntesis de principios activos basados en RNA-Seq. Este protocolo podría ser de gran ayuda para estudiar el mecanismo de biosíntesis de otros principios activos de la MTC. Al mismo tiempo, otros investigadores también podrían referirse a este protocolo para extraer proteínas funcionales con valor de investigación y realizar investigaciones en profundidad sobre ellas. Sin embargo, este protocolo también tiene algunas limitaciones. En primer lugar, la minería de genes se basa en datos anotados de RNA-Seq, y RNA-Seq parece ser algo costoso. En segundo lugar, los resultados del análisis de secuencias basado en el análisis bioinformático son predictivos y deben ser verificados por experimentos.

En conclusión, el protocolo de minería de genes y análisis de secuencias proporcionó una base teórica importante para estudiar el mecanismo de la biosíntesis de adenosina, así como el papel clave de la NP en la biosíntesis de adenosina. En conjunto, este estudio también proporcionaría una base científica más adecuada para la regulación génica de la biosíntesis de adenosina y proporcionaría una nueva idea para promover el desarrollo industrial moderno de los ingredientes activos en la medicina tradicional china.

Los autores no reportan conflictos de interés.

Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31871244, 81973733, 81803652), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (2019A151501555, 2018A0303100007), la Fundación de Shenzhen de la Comisión de Salud y Planificación Familiar (SZBC2018016), el Fondo Especial para el Desarrollo Económico y Tecnológico del Distrito de Longgang de la ciudad de Shenzhen (LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361).