Seguimiento de partículas 3D para el análisis in vivo no invasivo de la dinámica sináptica de los microtúbulos en dendritas y uniones neuromusculares de Drosophila

Este estudio presenta una estrategia de imagen neuronal intravital no invasiva combinada con una nueva estrategia de software para lograr un seguimiento y análisis automatizados e imparciales de la dinámica de los microtúbulos (MT) en vivo en el extremo positivo de las dendritas sensoriales y las uniones neuromusculares de Drosophila.

Los microtúbulos (MT) desempeñan un papel fundamental en el desarrollo neuronal, pero aún quedan muchas preguntas sobre los mecanismos moleculares de su regulación y función. Además, a pesar de los avances en la comprensión de las MT postsinápticas, se sabe mucho menos sobre las contribuciones de las MT presinápticas a la morfogénesis neuronal. En particular, los estudios de la dinámica de la MT in vivo en dendritas sensoriales de Drosophila proporcionaron información significativa sobre el comportamiento a nivel de polímero. Sin embargo, los desafíos técnicos y analíticos asociados con la obtención de imágenes en vivo de la unión neuromuscular de la mosca (NMJ) han limitado estudios comparables de la dinámica presináptica de la MT. Además, si bien existen muchas estrategias de software altamente efectivas para el análisis automatizado de la dinámica de la TA in vitro y ex vivo, los datos in vivo a menudo requieren una participación significativa del operador o un análisis completamente manual debido a la relación señal-ruido inherentemente inferior en las imágenes y la compleja morfología celular.  Para abordar esto, este estudio optimizó una nueva plataforma de software para la detección automatizada e imparcial de partículas in vivo. Se realizó un análisis multiparamétrico de imágenes confocales de lapso de tiempo en vivo de MT marcadas con EB1-GFP tanto en dendritas como en NMJ de larvas de Drosophila y encontró diferencias sorprendentes en el comportamiento de MT. Además, se analizó la dinámica de la MT tras la eliminación de la proteína asociada a la MT (MAP) dTACC, un regulador clave del desarrollo de la sinapsis de Drosophila, y se identificaron cambios estadísticamente significativos en la dinámica de la MT en comparación con el tipo salvaje. Estos resultados demuestran que esta nueva estrategia para el análisis multiparamétrico automatizado de la dinámica de la MT pre y postsináptica a nivel de polímero reduce significativamente los criterios de human-in-the-loop. Además, el estudio muestra la utilidad de este método en la detección de distintos comportamientos de la MT tras el knockdown de dTACC, lo que indica una posible aplicación futura para pantallas funcionales de factores que regulan la dinámica de la MT in vivo. Las aplicaciones futuras de este método también pueden centrarse en dilucidar el tipo de célula y/o los comportamientos de MT específicos del compartimento, y la obtención de imágenes correlativas multicolor de EB1-GFP con otros marcadores celulares y subcelulares de interés.

Las células se organizan para formar estructuras funcionales a través de la coordinación de cambios intra e intercelulares a través de la morfogénesis. Un ejemplo notable de morfogénesis es el desarrollo de la estructura neuronal altamente especializada. Las neuronas muestran una polarización notable, en la que extienden dos tipos de procesos estructural y funcionalmente distintos, dendritas y axones¹, que pueden alcanzar longitudes inmensas. La complejidad del desarrollo neuronal surge no solo del gran tamaño de las dendritas y axones, sino también de la dificultad para formar sus geometrías intrincadamente ramificadas ^2,3. La morfogénesis neuronal y sus consecuencias en el aprendizaje y la memoria⁴ motivan la investigación continua tanto de su control genético como de los mecanismos biológicos celulares subyacentes. Tales mecanismos incluyen, pero no se limitan a, el transporte de la membrana intracelular y los muchos reordenamientos del esqueleto necesarios para los cambios en la morfología neuronal ^1,2,3.

Los estudios de la morfogénesis neuronal han producido una variedad de técnicas de visualización avanzadas. Los métodos estáticos, como la microscopía electrónica o la microscopía de fluorescencia de sondas fijas, se utilizan ampliamente para realizar análisis morfológicos y estructurales de alta resolución. Sin embargo, además de los artefactos que son inevitables para cualquier método de preservación, la visualización estática no puede capturar los cambios dinámicos que sustentan la morfogénesis. Por lo tanto, muchos conocimientos fundamentales se originaron a partir de la microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo de tejidos vivos. Los primeros trabajos de Lichtman y sus colegas ^5,6,7 utilizaron imágenes in vivo del sistema nervioso de los mamíferos para investigar la regeneración/degeneración de los axones, la organización de los componentes sinápticos y el transporte axonal de largo alcance. Además, los estudios seminales en explantes neuronales primarios fueron críticos para establecer la importancia de la dinámica de los microtúbulos (MT) para la elongación y motilidad axonal ^8,9. De manera crucial, los primeros estudios de explantes neuronales establecieron el uso de proteínas de la familia de unión a extremos (EB) marcadas con fluorescencia para obtener información invaluable sobre la dinámica de extremos positivos de MT en neuronas en desarrollo a nivel de polímeros MT individuales¹⁰. Estos estudios surgieron a partir de la observación de que el miembro de la familia EB EB1 se localiza preferentemente en MT más extremos¹¹ en S. cerevisiae¹² y en células cultivadas¹³. Desde entonces, EB1 y otras proteínas de seguimiento de punta plus (+TIPs)^14,15 han sido ampliamente utilizadas en estudios in vivo de la inestabilidad dinámica de la MT¹⁶, incluso en el contexto del desarrollo neuronal¹⁷.

Drosophila es un potente modelo para los estudios de imagen in vivo de la dinámica de la MT durante el desarrollo neuronal debido a las vastas herramientas genéticas y de imagen disponibles para los estudios con moscas^18,19, así como a las similitudes en la estructura y función entre Drosophila y las neuronas de vertebrados¹. Un estudio temprano clave de la unión neuromuscular (NMJ) de las larvas de Drosophila realizó imágenes repetidas y no invasivas de un marcador de membrana fluorescente a través de la cutícula translúcida de animales intactos para documentar la morfogénesis terminal presináptica²⁰. Utilizando un método similar para obtener imágenes de larvas de Drosophila vivas y enteras, se proporcionó una demostración inicial de análisis subcelular, a nivel de partículas, del movimiento procesal de las cargas motoras en los axones²¹. Más recientemente, los meticulosos estudios realizados por Rolls y sus colegas en las dendritas sensoriales de las larvas intactas de Drosophila 22,23,24,25,26,27 caracterizaron la dinámica postsináptica de la MT en el extremo positivo mediante la realización de un seguimiento de partículas y el análisis de EB1 marcado con proteína verde fluorescente (GFP). Tales estudios en Drosophila 22,23,24,25,26,27 y otros sistemas 28,29,30,31,32 han avanzado significativamente en la comprensión del comportamiento de un solo polímero de los extremos más de MT en las dendritas de las neuronas en desarrollo ³³.

A pesar de los impresionantes estudios in vivo de la dinámica de la MT postsináptica 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, ha habido muchos menos estudios comparables de la dinámica de la MT presináptica en el terminal axónico en desarrollo. La dinámica de la MT en la NMJ larvaria de Drosophila se ha estudiado mediante microscopía de moteado fluorescente (FSM) y recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)³⁴. Estas técnicas evalúan la cinética general de la tubulina, pero no el comportamiento de los extremos positivos de MT individuales. En el momento de escribir este artículo, ha habido una única investigación de los extremos positivos individuales de la MT en el NMJ de Drosophila: este estudio combinó imágenes de lapso de tiempo en vivo con el análisis manual de quimógrafos para caracterizar una población de MT dinámicos, EB1-GFP etiquetados como "MT pioneros" que parecían distintos de una población más amplia de MT estabilizados³⁵. Esta falta de investigación sobre la dinámica presináptica de la TA puede deberse, al menos en parte, a la anatomía: si bien es relativamente sencillo obtener imágenes de las dendritas debido a su proximidad a la cutícula de la larva, los NMJ están obstruidos por otros tejidos, lo que dificulta la adquisición de imágenes con una relación señal-ruido suficiente para el análisis a nivel de partículas. No obstante, dada la importancia bien establecida de las MT presinápticas para la morfogénesis y la estabilización sináptica³⁶, así como sus vínculos con los trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo³⁷, es probable que cerrar esta brecha entre la comprensión de las MT presinápticas y postsinápticas proporcione información invaluable.

Un desafío adicional para el análisis de la dinámica de la MT in vivo en general, en contraste con el análisis in vitro o ex vivo, son las limitadas herramientas de software automatizadas que pueden extraer parámetros de dinámica de datos in vivo. En la actualidad, una de las técnicas más populares y potentes para el análisis de los extremos positivos de la TA marcados con +TIP es plusTipTracker^38,39, un software basado en MATLAB que permite el seguimiento y el análisis automatizados de múltiples parámetros dinámicos. En particular, plusTipTracker mide no solo el crecimiento de la TA sino también la contracción y los rescates: mientras que las etiquetas +TIP como EB1-GFP solo se asocian con extremos positivos crecientes, plusTipTracker puede inferir algorítmicamente las tasas de contracción y los eventos de rescate. Sin embargo, mientras que plusTripTracker se ha aplicado con mucho éxito en muchos contextos, incluido el análisis multiparamétrico previo de la dinámica de MT ex vivo en células S2 de Drosophila⁴⁰, plusTipTracker no es óptimo para el análisis de datos in vivo dada su menor relación señal-ruido. Como resultado, los estudios in vivo de la dinámica del extremo positivo en las dendritas 22,23,24,25,26,27 y en el NMJ³⁵ de Drosophila se han basado en la generación manual y el análisis de kymographs utilizando software como ImageJ 41, o en estrategias semiautomatizadas que involucran numerosos componentes humanos.

Este estudio presenta un flujo de trabajo experimental y analítico que reduce la sobrecarga experimental y analítica necesaria para realizar análisis no invasivos a nivel de polímero de la dinámica presináptica de la MT tanto en las dendritas sensoriales como en el terminal del axón motor de las larvas de tercer estadio de Drosophila. El protocolo utiliza larvas inmovilizadas e intactas y, por lo tanto, evita lesiones que se sabe que desencadenan respuestas al estrés, así como otras condiciones no fisiológicas que podrían perturbar la dinámica de la MT in vivo. Para etiquetar los extremos positivos de la MT dinámica, EB1-GFP se expresa panneuronalmente utilizando el sistema Gal4/UAS ⁴², lo que permite la visualización de las MT tanto en las dendritas como en la NMJ con un solo controlador. Si bien algunos pasos iniciales están inevitablemente sujetos a la toma de decisiones humanas, como la selección de especímenes de animales y la identificación de regiones para obtener imágenes, los pasos posteriores a la adquisición de datos están en gran medida automatizados. Fundamentalmente, la optimización de un nuevo software permitió un análisis automatizado e imparcial que requiere una intervención humana mínima. Si bien existen otros métodos de seguimiento de partículas 43,44,45, este estudio utiliza un software patentado porque era algorítmicamente adecuado para abordar los desafíos particulares de este conjunto de datos en particular. El software ahora está disponible para los usuarios para una variedad de aplicaciones. Específicamente, el uso del filtrado de difusión que mejora la coherencia⁴⁶ es integral para la segmentación automatizada y la eliminación de fondo, y se implementan algoritmos personalizados específicamente para automatizar la detección y el seguimiento de partículas. Esta estrategia podría manejar de manera efectiva la baja relación señal-ruido inherente a los datos de este estudio, así como otros desafíos, como el movimiento de los cometas EB1-GFP a través de diferentes planos focales. Si bien no es factible probar exhaustivamente el rendimiento de este software en comparación con todos los demás software de análisis de partículas, el rendimiento de la presente estrategia igualó o se acercó al rendimiento humano estándar. Además, hasta donde saben los autores, no ha habido ningún otro software entrenado específicamente con datos in vivo de dendritas sensoriales y el terminal presináptico. Dado que el rendimiento de los algoritmos de análisis de imágenes es a menudo muy específico de los datos para los que fueron diseñados y que la visión generalizada por computadora aún no es posible, se espera que el entrenamiento del software descrito para los datos in vivo específicos de interés sea el enfoque más racionalmente sólido.

Dado el extenso trabajo sobre las MT dendríticas 22,23,24,25,26,27, así como la calidad constante de los datos que se pueden adquirir de este sistema, la estrategia de adquisición de imágenes y análisis de software se validó por primera vez en dendritas sensoriales de Drosophila. Es importante destacar que se encontró en las dendritas que el uso de diferentes controladores neuronales de Gal4, incluso en fondos de tipo salvaje idénticos, da como resultado diferencias significativas en la dinámica de EB1-GFP debido a las diferencias en el fondo genético, lo que enfatiza la importancia de usar un solo controlador de Gal4 para obtener resultados consistentes. Esta estrategia se utilizó posteriormente para el análisis multiparamétrico de la dinámica de EB1-GFP en el terminal presináptico de la NMJ. Para ilustrar aún más el valor investigativo de este método, se utilizó esta estrategia de imagen y software para evaluar la dinámica pre y postsináptica de EB1-GFP después de la eliminación de dTACC, el homólogo de Drosophila de la familia TACC (bobina en espiral ácida transformante) altamente conservada^47,48. El trabajo previo en las células^{S2 de} Drosophila 40, así como el trabajo de Lowery y sus colegas en el cono de crecimiento de Xenopus 49,50,51, han demostrado que los miembros de la familia TACC regulan la dinámica del extremo positivo de la MT. Además, la evidencia reportada recientemente de imágenes de inmunofluorescencia confocal y de súper resolución mostró que dTACC es un regulador clave de las MT presinápticas durante la morfogénesis neuronal⁵², lo que plantea la pregunta de si dTACC regula la dinámica de la MT en vivo. Este informe demuestra un método que puede detectar diferencias en los comportamientos de MT en vivo tras el derribo de dTACC. Por lo tanto, este estudio presenta un método in vivo que puede identificar y caracterizar de manera efectiva los reguladores clave de la dinámica de MT dentro de la neurona en desarrollo, particularmente en el compartimento presináptico.

1. Generación de ejemplares de Drosophila

1. Seleccione un marcador de extremo superior MT adecuado. En este estudio se utilizó EB1 marcado con GFP, un marcador de extremo positivo bien caracterizado con una señal fuerte y clara ^11,12. Las alternativas incluyen otros +TIPs como EB3^10,13, CLASP/Orbit⁵³ y CLIP-170⁵⁴.
2. Obtener o generar moscas con el marcador MT bajo el control de un promotor UAS (por ejemplo, UAS-EB1-GFP).
3. Elija el controlador Gal4 específico para tejidos adecuado. Este estudio utilizó el controlador panneuronal elaV-Gal4^58,59 para impulsar la expresión tanto en las dendritas sensoriales como en el NMJ y 221-Gal4^60,61 para la expresión específica de la dendrita.
4. Cría moscas utilizando técnicas estándar de cría de moscas^55,56. Se recomienda mantener las moscas en incubadoras humidificadas a 25 °C para una expresión óptima de Gal4/UAS.
5. Utilizando técnicas genéticas estándar de moscas^55,56, se realizan cruzamientos para generar moscas que expresen el marcador MT plus-end en las células/tejidos deseados.
   NOTA: Para cualquier combinación de controlador Gal4 y transgén, el diseño experimental debe incluir experimentos de prueba de concepto y validación para caracterizar el sistema y evitar artefactos de sobreexpresión.

2. Configuración del equipo

1. Instale una estación de trabajo, que incluya las moscas, los reactivos anestésicos, los materiales de construcción de portaobjetos, el microscopio estereoscópico y la fuente de iluminación, cerca del microscopio confocal (es decir, en la misma habitación) para minimizar el tiempo que transcurre entre la preparación de la muestra y la obtención de imágenes para prolongar la salud y la viabilidad de las larvas.
2. Prepare el anestésico mezclando una mezcla de cloroformo al 9% (0,1 mL de cloroformo y 1,0 mL de aceite de halocarbono) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Para evitar la separación, mezcle bien invirtiendo el tubo antes de preparar cada nuevo portaobjetos.
3. Prepare la diapositiva de vidrio: Corte cuatro tiras de cinta adhesiva de doble cara (~15 mm de ancho). Alinee dos de las piezas en el portaobjetos de vidrio, dejando un espacio de ~5 mm entre las tiras. Coloque las dos piezas restantes encima de las dos primeras para duplicar el grosor de la cinta (Figura 1C).
4. Agregue una gota grande (~ 100 μL) de la mezcla de cloroformo / aceite en el portaobjetos de vidrio en el espacio de 5 mm entre las piezas de cinta (Figura 1C).

3. Preparación de muestras de larvas para la obtención de imágenes

1. Llene un recipiente (por ejemplo, una placa de 6 pocillos) con 1x PBS.
2. Recoja las larvas del^3er estadio del frasco de mosca con pinzas o un instrumento similar. Identifique las larvas en la etapa adecuada por su comportamiento de rastreo y por la presencia de 9 a 12 ganchos bucales prominentes y dentados. Utilice un microscopio estereoscópico para ayudar a estadificar las larvas (Figura 1D).
3. Coloque una larva en el PBS y muévala suavemente para lavar cualquier resto de comida u otros desechos. Seque la larva suavemente sobre un pañuelo delicado.
4. Anestesiar la larva colocándola en una gota de cloroformo/aceite en el portaobjetos de la sección 2 (Figura 1C).
   NOTA: La orientación dorsal/ventral de la larva no es crítica porque tanto las neuronas sensoriales como las motoras se pueden detectar a través de la cutícula translúcida ajustando la platina del microscopio al plano focal adecuado, independientemente de la orientación del espécimen.
5. Coloque un cubreobjetos # 1.5 en la parte superior. Adherir el cubreobjetos a la cinta aplicando una presión suave, inmovilizando así la larva sin dañarla (Figura 1C).
6. Sella la cámara con vaselina o esmalte de uñas.

4. Imágenes confocales de lapso de tiempo de muestras vivas

1. Prepare el microscopio confocal y la lente del objetivo de 60x con inmersión en aceite. Coloque la muestra en la plataforma (Figura 1A,B).
2. Utilice el software de adquisición para configurar experimentos.
   NOTA: Para este estudio, cada serie de imágenes se adquirió en un solo plano focal en lugar de una pila z.
   1. Establezca la duración del lapso de tiempo en 30 s en un intervalo de 2 s, para un total de 16 fotogramas.
   2. Ajuste la exposición y la intensidad del láser para garantizar una señal suficiente y evitar la saturación y el fotoblanqueo.
   3. Para las imágenes EB1-GFP, el láser de 488 nm se ajustó a un tiempo de exposición de 100 ms y una intensidad del 30%. Estos valores pueden variar para diferentes usos de este protocolo y deben modificarse empíricamente.
3. Utilice los oculares del microscopio para encontrar la larva con una iluminación verde de campo amplio. Encuentre las dendritas o NMJ ajustando la etapa lentamente. No exponga la larva a la iluminación (de campo amplio o confocal) durante más tiempo del necesario.
   1. Las dendritas aparecen como delgadas redes de nervios de color verde brillante que se distinguen fácilmente de los gruesos y largos haces de axones (Figura 1E).
   2. Las NMJ aparecen como grupos de botones individuales de color verde brillante, de aproximadamente 5 μm de diámetro, en los extremos de haces de axones largos y gruesos que divergen del cordón nervioso (Figura 1F).
4. Con la transmisión de la cámara en vivo, concéntrese rápidamente en la región de interés con la iluminación de 488 nm. Detenga inmediatamente la iluminación una vez que se encuentre el enfoque adecuado para evitar la fototoxicidad.
5. Iniciar la adquisición de imágenes. Los cometas EB1 son reconocibles como brillantes y móviles punctae.
6. Consulte los protocolos publicados anteriormente para obtener detalles adicionales y directrices sobre las imágenes de fluorescencia en vivo⁵⁷.

5. Procesamiento y análisis de imágenes basado en software

1. Analice cada archivo de video individualmente. Dentro del software (interfaz de usuario que se muestra en la Figura 2), seleccione Archivo | Importación | Secuencia de imágenes y arrastre los archivos TIF en el cuadro que aparece. Vista previa del video.
2. En el menú Parámetros de detección , ajuste los parámetros del software para garantizar la detección solo de puntos claramente visibles y evitar la detección de objetos espurios. Por ejemplo, la reducción de la intensidad de las partículas da como resultado una mayor sensibilidad del software a los puntos, pero aumenta los posibles falsos positivos. Los valores precisos de los parámetros variarán empíricamente. Las descripciones de los parámetros de detección y seguimiento están disponibles a petición de los autores.
3. Aplique la receta de seguimiento de partículas neuronales para analizar la imagen con el botón Desde el principio (flecha azul, Figura 2B). El software enviará los resultados de los parámetros de seguimiento enumerados en la Tabla 1 a la hoja de cálculo de resultados (cuadro verde, Figura 2B). Para facilitar el análisis y la interpretación posteriores, los resultados se pueden almacenar en un software de hoja de cálculo utilizando la función Exportar que se encuentra en la sección Hoja de cálculo de resultados .
4. Desplácese con el cursor hasta los puntos detectados en el paso anterior y haga clic con el botón izquierdo para seleccionar o anular la selección. Se pueden seleccionar varios puntos simultáneamente usando Ctrl + clic izquierdo.
   NOTA: Dependiendo de los objetivos y aplicaciones del proyecto, se pueden utilizar heurísticas adicionales para filtrar los puntos. Por ejemplo, los puntos con una vida útil de menos de 8-10 s (4-5 fotogramas) pueden omitirse porque no presentan suficiente información sobre todo el evento de crecimiento. La necesidad de tales heurísticas variará empíricamente. Los autores pueden solicitar detalles adicionales sobre la funcionalidad del software.

Las moscas se criaron a partir de stocks estables que expresan constitutivamente el transgén UAS-EB1-GFP ya sea panneuronalmente (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)^58,59 o en neuronas sensoriales (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)^60,61. Se eligió EB1 para este estudio porque se localiza específicamente en los extremos en crecimiento y se disocia inmediatamente después de la pausa y la contracción^14,15 y se ha demostrado a través de múltiples estudios, incluso en Drosophila 22,23,24,25,26,27,35, para ser un marcador robusto que no tenga efectos perjudiciales significativos en la biología subyacente del organismo. Las imágenes de las larvas errantes del tercer estadio se realizaron en un microscopio confocal de disco giratorio invertido después de la preparación de muestras intactas (Figura 1A-C). Las larvas se clasificaron en función de su comportamiento (arrastre activo a lo largo de las paredes del vial) y la presencia de ganchos bucales grandes y extendidos con 9-12 dientes (Figura 1D). Cada serie de imágenes se adquirió en un solo plano focal. Se tomaron imágenes de dendritas sensoriales ubicadas superficialmente cerca de la cutícula larvaria (Figura 1E) para proporcionar comparaciones con los datos publicados 22,23,24,25,26,27,35, mientras que las NMJ ubicadas en planos de imagen más profundos en la superficie del músculo de la pared corporal dentro del animal (Figura 1F) se fotografiaron para definir los parámetros dinámicos presinápticos de la MT.

Después de la adquisición de imágenes como se describe en el protocolo anterior, se realizó un análisis automatizado e imparcial de los cometas EB1-GFP (Figura 2), produciendo mediciones para nueve parámetros dinámicos (Tabla 1).  El análisis estadístico, incluido el análisis exploratorio de datos y la prueba de hipótesis, se realizó en MATLAB. Se observó a través de la visualización de datos y la prueba de Anderson-Darling que los datos contenían valores distribuidos no normalmente. Por lo tanto, para evitar hacer suposiciones sobre la distribución subyacente de los datos, todas las pruebas de hipótesis se realizaron utilizando la prueba no paramétrica de Wilcoxon-Mann-Whitney.

La dinámica de EB1-GFP bajo el control de los controladores elaV-Gal4 y 221-Gal4 se comparó en fondos de tipo salvaje equivalentes (Figura 3). Curiosamente, hubo diferencias muy significativas (P < 0,005) en varios parámetros medidos (por ejemplo, aceleración media, sinuosidad, longitud de crecimiento). Si bien generalmente no se espera que EB1 interrumpa la biología nativa de la MT en un grado adverso^10,54, las MT son, sin embargo, altamente sensibles a las perturbaciones en la expresión de EB1^62,63. Las diferencias observadas entre los dos impulsores podrían surgir de sus distintos patrones de expresión: elaV-Gal4 podría impulsar la expresión de UAS-EB1-GFP panneuronalmente, así como en los progenitores neuronales y la glía^58,59, mientras que 221-Gal4 podría impulsar la expresión únicamente en las dendritas sensoriales^60,61. Las diferencias en la expresión de UAS-EB1-GFP también podrían deberse a un inicio temporal diferente de elaV-Gal4 y 221-Gal4, o a cualquier otra serie de variaciones en el fondo genético de las dos líneas conductoras. Para evitar cualquier daño de estos y otros factores potencialmente confusos, todos los experimentos posteriores tanto en dendritas como en el NMJ se llevaron a cabo utilizando solo el controlador panneuronal elaV-Gal4.

Este método se validó por primera vez en dendritas sensoriales (Figura 4), y todo el protocolo se repitió en la NMJ (Figura 5). Para evaluar el potencial de esta estrategia para investigar el papel de moléculas específicas en la dinámica de MT, se comparó la dinámica de EB1-GFP entre controles de tipo salvaje y animales que expresan UAS-dtacc-RNAi. Se eligió dTACC porque es un regulador conocido de la dinámica del extremo positivo de la MT 40,49,50,51 en otros sistemas, y también se basó en la evidencia reciente de que regula las MT presinápticas en el NMJ⁵² de Drosophila. Para mejorar la expresión de dtacc-RNAi, elaV-GAL4 también se utilizó para expresar UAS-Dcr2, una endonucleasa que promueve el procesamiento de dsRNAs largos a siRNAs.

Al reducir la expresión de dTACC a ~50%⁵², se encontraron cambios significativos en la dinámica de EB1-GFP tanto en las dendritas (Figura 4) como en el NMJ (Figura 5). En particular, los efectos de la reducción de dTACC en las dendritas se asemejaron mucho a los efectos de la reducción de dTACC observados previamente en las células S2⁴⁰. Por el contrario, se observaron diferencias notables entre las dendritas y el NMJ tras el derribo de dTACC. Si bien la pérdida de dTACC afectó a siete parámetros en las dendritas y a tres parámetros en el NMJ, todos los parámetros, excepto dos (velocidad máxima del cometa y sinuosidad) eran exclusivos de las dendritas o del NMJ. Además, mientras que la sinuosidad se vio afectada por la pérdida de dTACC en ambos contextos, el efecto fue opuesto entre las dendritas (aumento) y la NMJ (disminución). Por lo tanto, este protocolo no solo puede identificar diferencias significativas en la dinámica de la MT entre los antecedentes genéticos, sino que también puede demostrar distintas funciones para un solo regulador de la MT en diferentes contextos.

Figura 1: Configuración experimental. (A) Esquema y (B) ejemplo real de configuración de imágenes. Las larvas anestesiadas de montaje completo se obtuvieron en un microscopio confocal de disco giratorio invertido. (C) Ejemplo de preparación de portaobjetos utilizando larvas de tercer estadio. (D) Las larvas se clasificaron por su comportamiento de rastreo y por la presencia de 9 a 12 ganchos bucales prominentes y dentados. Las imágenes se realizaron en (E) dendritas de neuronas sensoriales, que tienen una ubicación relativamente superficial cerca de la cutícula externa, y (F) el terminal presináptico de la NMJ, que se encuentra más profundamente dentro del animal. Barra de escala = 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Demostración del análisis de dendritas y NMJ basado en software. (A) Resumen de la canalización de procesamiento de análisis automatizado. Un problema común de los enfoques morfológicos típicos para la eliminación de fondo es la mejora de la señal de imagen a lo largo de los bordes de estructuras pequeñas y estrechas (por ejemplo, dendritas). Para abordar esto, se aplicó un filtro de difusión⁴⁶ que mejora la coherencia a la imagen en bruto para extraer toda la estructura de dendrita/NMJ como fondo y para aislar los cometas EB1 en la imagen. Este enfoque permitió la identificación y el seguimiento de los cometas incluso donde el contraste entre la estructura de fondo y el cometa EB1 era bajo. (B) La integración del flujo de trabajo mediante la interfaz del software permite al usuario 1) optimizar los parámetros de análisis para una imagen determinada y 2) revisar el análisis. La flecha azul resalta el botón utilizado para ejecutar la receta, y el cuadro verde indica la hoja de cálculo con los resultados del análisis. Los autores pueden solicitar detalles adicionales sobre la funcionalidad del software. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comparación de los controladores elaV- y 221-Gal4 en dendritas de control de tipo salvaje. Para determinar los efectos de los niveles de expresión de UAS-EB1-GFP dependientes de Gal4 en la dinámica de EB1-GFP, elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP y 221-Gal4; UAS-EB1-GFP se expresaron en un fondo de control w¹¹¹⁸ . Se observaron diferencias altamente significativas en la aceleración media, la sinuosidad y la longitud del crecimiento. ** P < 0,005, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney; las barras de error indican ± SEM; número de NMJs cuantificados indicados en el gráfico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: La eliminación neuronal del ARNi de TACC afectó la dinámica de EB1-GFP en dendritas sensoriales. (A) Imágenes representativas de lapso de tiempo de la dinámica del cometa EB1-GFP en el control elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 x w¹¹¹⁸ dendritas sensoriales. La serie de imágenes de la derecha muestra una vista detallada de la región indicada por el cuadro de la imagen de la izquierda. En cada panel, la flecha blanca continua indica la posición del cometa EB1-GFP en el punto de tiempo más reciente, mientras que la flecha hueca indica la posición original del cometa en t = 0 s. (B) Comparación de la dinámica de EB1-GFP en elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 x w¹¹¹⁸ y elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 x UAS-tacc-rnai dendritas. La reducción de dTACC afectó significativamente a todos los parámetros dinámicos, excepto a la aceleración media y la vida útil del crecimiento. * P < 0,05, ** P < 0,005, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney; las barras de error indican ± SEM; número de NMJs cuantificados indicados en el gráfico; barra de escala = 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: La eliminación neuronal del ARNi de TACC afectó a la dinámica de EB1-GFP en el NMJ. (A) Imágenes representativas de lapso de tiempo de la dinámica del cometa EB1-GFP en el terminal presináptico del control elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 x w¹¹¹⁸ NMJs. La serie de imágenes de la derecha muestra una vista detallada de la región indicada por el cuadro en la imagen de la izquierda. En cada panel, la flecha blanca continua indica la posición del cometa EB1-GFP en el punto de tiempo más reciente, mientras que la flecha hueca indica la posición original del cometa en t = 0 s. (B) Comparación de la dinámica de EB1-GFP en elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 x w¹¹¹⁸ y elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 x UAS-tacc-rnai NMJs. La caída de dTACC afectó significativamente la velocidad máxima, la aceleración media y la sinuosidad. * P < 0,05, ** P < 0,005, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney; las barras de error indican ± SEM; número de NMJs cuantificados indicados en el gráfico; barra de escala = 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Parámetros dinámicos del extremo positivo analizados

En este artículo se discute un protocolo para realizar imágenes intravitales no invasivas de la dinámica de la MT en las dendritas y en la NMJ durante el desarrollo. Se requiere la participación humana durante las etapas experimentales, como en la selección de animales para obtener imágenes, y puede introducir sesgos en el proceso de recopilación de datos que no se pueden eliminar razonablemente. Por lo tanto, un objetivo clave del protocolo es minimizar el sesgo siempre que sea posible mediante la realización de análisis automatizados con un nuevo software (sección 5) que se optimizó para manejar la baja relación señal-ruido inherente a los datos in vivo. Es importante destacar que los algoritmos utilizados en este estudio permiten la detección de partículas basada en máquinas, la generación de quimogramas y el análisis de seguimientos, lo que reduce la necesidad de intervención humana en comparación con los métodos tradicionales. En cualquier caso, los usuarios del software deben evaluar los resultados y establecer los parámetros de seguimiento y detección para filtrar los falsos positivos (por ejemplo, agregados o ruido). Estas modificaciones deben ajustarse empíricamente en función de los datos y el uso únicos de cada usuario. También vale la pena señalar que el análisis presentado aquí no es completamente equivalente al posible con plusTipTracker: si bien es posible inferir eventos de contracción y rescate con plusTipTracker, los algoritmos del software actual no pueden realizar tales mediciones. Además, debido a que cada serie de imágenes se adquiere en un solo plano focal, el movimiento de los cometas EB1 en el eje z no se puede capturar completamente utilizando el protocolo actual. No obstante, a pesar de estas limitaciones, dadas las considerables limitaciones en la calidad de los datos que son inherentes a los datos in vivo, este método avanza hacia el logro de un análisis de datos automatizado y reproducible in vivo.

Debido a que la calidad de los datos brutos también es primordial, independientemente de las capacidades del software de análisis, la preparación óptima de la muestra también es una consideración crítica. Si bien se debe hacer todo lo posible para reducir los efectos nocivos sobre la larva (por ejemplo, utilizando muestras intactas), los estreses como el cloroformo y la fototoxicidad son inevitables. Por lo tanto, se debe tener cuidado al establecer los parámetros de imagen para garantizar la salud del espécimen, basándose tanto en las pautas generales⁵⁷ como en el seguimiento empírico. Se comprobó que la agilización de los pasos experimentales mediante el trabajo rápido y la disposición de una estación de preparación de muestras en la misma sala que el microscopio confocal (sección 2) ayudaba a mitigar el deterioro de las muestras y a prolongar la viabilidad de las larvas. Otro aspecto clave del método es encontrar una dosis de cloroformo que sea lo suficientemente potente pero no demasiado dañina. Sin embargo, cabe destacar que la anestesia general puede influir en la dinámica de la MT⁶⁴. El uso de métodos no químicos para inmovilizar las larvas, como la adherencia de las larvas a una almohadilla de agarosa²⁵ o cámaras microfluídicas^65,66, puede mejorar aún más los resultados al eludir los posibles efectos secundarios de la anestesia.

Otro paso crucial es el método por el cual se expresa EB1-GFP utilizando el sistema Gal4/UAS para etiquetar la dinámica MT (sección 1). Como ya se ha señalado, es imperativo mantener un fondo genético consistente a lo largo de todas las comparaciones debido a la posibilidad de múltiples variables de confusión que pueden influir en la dinámica de EB1-GFP (Figura 3). Una consideración adicional cuando se utiliza Gal4/UAS u otros sistemas de expresión dirigidos similares es el efecto de la sobreexpresión en la dinámica endógena de la MT. Por lo tanto, una posible mejora futura sería utilizar etiquetas fluorescentes knock-in para evitar artefactos de ganancia de función, aunque en la actualidad, Gal4 / UAS sigue siendo un método muy utilizado en estudios de la dinámica de MT en vivo en Drosophila 22,23,24,25,26,27,35. Un problema relacionado con el uso de +TIP marcados con fluorescencia que se debe tener en cuenta es el posible efecto ectópico de la etiqueta en la función +TIP. Por lo tanto, cualquier nuevo constructo de fusión debe validarse a través de experimentos de rescate, y el análisis y la interpretación de los datos deben realizarse teniendo en cuenta estos puntos.

Se observaron efectos significativos sobre múltiples parámetros de dinámica de MT al derribar dTACC tanto en las dendritas como en el NMJ. Esto demuestra que este método puede ser una herramienta de cribado potencial para los reguladores de la dinámica sináptica de la MT y, además, identifica un papel potencial para el dTACC en las dendritas. Si bien se ha establecido el papel del dTACC presináptico en el desarrollo del terminal axónico motor⁵², se desconocen las funciones del dTACC postsináptico. Por lo tanto, los estudios futuros pueden centrarse en el papel de la dTACC postsináptica, ya sea en las dendritas sensoriales y/o en el músculo de la NMJ.

Se observaron diferencias clave en los efectos de la reducción de dTACC sobre la dinámica de la MT en las dendritas sensoriales y el NMJ, lo que indica claras diferencias biológicas entre los dos contextos. Esto plantea la cuestión de si la dinámica de la MT difiere entre los tipos de neuronas, entre los distintos compartimentos de una sola neurona, o entre ambos. Las diferencias observadas entre las dendritas y la NMJ podrían reflejar diferencias entre las neuronas sensoriales y motoras, pero también podrían indicar diferencias entre los compartimentos dendrítico y axonal, independientemente del tipo neuronal. Debido a que el enfoque en el presente estudio se centró en el desarrollo de una metodología robusta en lugar de una caracterización completa de la dinámica neuronal de la MT, aún no se ha realizado el análisis de las dendritas de las neuronas motoras o las terminales axónicas de las neuronas sensoriales. Debido a su ubicación menos accesible dentro del animal, estas estructuras son más difíciles de visualizar y analizar en comparación con las estructuras que se discuten actualmente. Los esfuerzos futuros se centrarán en la aplicación de este protocolo optimizado para mejorar la obtención de imágenes de regiones menos accesibles para permitir estudios de las diferencias entre compartimentos y tipos de células en la dinámica de la MT.

Posiblemente, esta estrategia de imagen y análisis in vivo será de valor para los investigadores interesados en una comprensión detallada de los comportamientos dinámicos de la MT durante las etapas críticas del desarrollo neuronal. Una innovación futura clave sería la obtención de imágenes multicolor a través de la coexpresión de EB1-GFP con otros marcadores, como los que etiquetan la membrana celular (es decir, CD8⁶⁷, myristol⁶⁸), el citoesqueleto de actina (es decir, moesin⁶⁹, LifeAct⁷⁰) y otras estructuras de interés. Esto permitiría un análisis correlativo de las interacciones espacio-temporales de las MT con otras estructuras celulares clave. Si bien este tipo de imágenes multicolor se han utilizado para estudiar las interacciones MT-actina en el cono de crecimiento neuronal^71,72, no se han empleado en dendritas o en el terminal axonal presináptico. Por lo tanto, el desarrollo de un método comparable para los estudios in vivo de Drosophila será una adición significativa al conjunto de herramientas de imagen para comprender el papel de las MT en el contexto más amplio del desarrollo neuronal.

Los autores Hoyin Lai, Michael Jones, Hideki Sasaki, Luciano A.G. Lucas, Sam Alworth (anteriormente) y James Shih-Jong Lee son empleados de DRVision Technologies LLC, que produce el software utilizado en este protocolo.

Agradecemos a nuestros colegas en el laboratorio de Van Vactor y en DRVision, además de a los Dres. Max Heiman, Pascal Kaeser, David Pellman y Thomas Schwarz, por su útil discusión. Agradecemos a la Dra. Melissa Rolls por proporcionar generosamente el elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 y 221-Gal4; Existencias de UAS-EB1-GFP utilizadas en este estudio. Agradecemos a las Dras. Jennifer Waters y Anna Jost del Centro de Imágenes Nikon de Harvard por su experiencia en microscopía óptica. Este trabajo está financiado por los Institutos Nacionales de Salud (F31 NS101756-03 a V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D a J.S.L.).