Medición de la secreción relativa de insulina mediante un sustituto de la Luciferase co-secretada

Este protocolo describe cómo realizar ensayos rápidos de luciferasa de bajo costo a rendimiento medio utilizando una Gaussia luciferase ligada a la insulina como un proxy para la secreción de insulina de células beta. El ensayo se puede realizar con la mayoría de los lectores de placas de luminiscencia y pipetas multicanal.

La realización de ensayos basados en anticuerpos para la recolección secreta de insulina después de la muestra suele requerir unas horas a un día de tiempo de ensayo y puede ser costoso, dependiendo del ensayo específico. Los ensayos de luciferasa secretas aceleran los resultados y reducen sustancialmente el costo del ensayo por muestra. Aquí presentamos un enfoque relativamente infrautilizado para medir la actividad secretora de insulina de las células pancreáticas mediante el uso de Gaussia luciferasa insertada genéticamente dentro del péptido C. Durante el procesamiento proteolítico de la proinsulina, el péptido C se extirparte liberando la luciferasa dentro de la vesícula secretora de insulina donde se co-secreta con insulina. Los resultados se pueden obtener en cuestión de minutos después de la recolección de muestras debido a la velocidad de los ensayos de luciferasa. Una limitación del ensayo es que es una medida relativa de la secreción de insulina y no una cuantificación absoluta. Sin embargo, este protocolo es económico, escalable y se puede realizar utilizando la mayoría de los lectores de placas de luminiscencia estándar. Las pipetas multicanal analógicas y digitales facilitan múltiples pasos del ensayo. Muchas variaciones experimentales diferentes se pueden probar simultáneamente. Una vez que se decide un conjunto focalizado de condiciones, las concentraciones de insulina deben medirse directamente utilizando ensayos basados en anticuerpos con curvas estándar para confirmar los resultados del ensayo de luciferas.

El método presentado aquí permite que la secreción de insulina de una línea de células beta modificadagenéticamente se ensaye rápida y asequiblemente en formato de 96 placas de pozo. La clave de este protocolo es una versión modificada de la insulina con la Gaussia luciferase naturalmente secretada (GLuc, 18 kDa) insertada (ver Figura 1) en el péptido C para generar insulina-Gaussia (InsGLuc)^1,2. Otras proteínas más grandes, como la GFP (25 kDa), se han insertado con éxito en el péptido C de la insulina y han exhibido el procesamiento post-traduccional esperado de la proinsulina-GFP a la insulina y el péptido GFP-C^3,4. Para el ensayo de este protocolo, GLuc ha sido optimizado para la expresión de mamíferos y sehan introducido dos mutaciones para mejorar la cinética brillante 5,^6. Múltiples combinaciones y réplicas de las condiciones de tratamiento se pueden probar fácilmente en formato 96-bien-placa y los resultados de la secreción se pueden obtener inmediatamente después del experimento.

Una ventaja importante, como se señaló anteriormente², es el bajo costo de esta medición de secreción basada en luciferasa (< $0.01/well) que la diferencia de los costos relativamente más altos y los aspectos técnicos de los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) ( > Ensayos de "2$/bien) y fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) u otros ensayos de anticuerpos basados en la transferencia de energía por resonancia de la familia (FRET) (> $1/bueno). En comparación con estos ensayos basados en anticuerpos, que miden la concentración de insulina haciendo referencia a una curva estándar, el ensayo InsGLuc mide la actividad secretora como una comparación relativa con los pozos de control en la placa. Por esa razón, cada experimento requiere la inclusión de controles adecuados. Esta distinción es una compensación para permitir mediciones rápidas y baratas. Sin embargo, se ha demostrado que la secreción de InsGLuc está altamente correlacionada con la secreción de insulina medida por ELISA^1,2. Esta tecnología se ha ampliado para el cribado de alto rendimiento^1,2,7 y ha llevado a la identificación de nuevos moduladores de la secreción de insulina, incluyendo un inhibidor del canal de potasio cerrado por voltaje⁷ así como un producto natural inhibidor de la función celular, cromomicina A₂⁸. El uso de InsGLuc es más adecuado para los investigadores que planean probar continuamente muchas condiciones de tratamiento diferentes para su impacto en la secreción de insulina. En los experimentos de seguimiento es necesario repetir los hallazgos clave en una línea celular de los padres, y de manera óptima en islotes murinos o humanos, y medir la secreción de insulina mediante un ensayo basado en anticuerpos.

1. Preparación de reactivos, medios y buffers (Tabla 1)

1. Preparar el medio completo de la min6 en 500 ml de medio águila modificado (DMEM) de alta glucosa (4,5 g/L) de Dulbecco con los siguientes aditivos: 15% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 292 g/ml de glutamina y 50 m lglutinamina y 50 ml -mercaptoetanol.
   NOTA: La línea celular estable en este caso se mantiene en 250 g/ml de antibiótico G418.
2. Preparar el tampón de bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) haciendo una solución que contenga 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO₃, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂y 1 mg/ml de aalbúmina de suero bovino de grado bovino (BSA). La glucosa se añadirá cuando se especifique a partir de una población de 2 M.
   NOTA: KRBH se utiliza para incubar las células con y sin estimulación con el fin de evaluar la insulina y / o secreción de gaussia luciferasa.
3. Prepare la solución de material de celenterazine (CTZ) de la siguiente manera. Preparar el metanol acidificado añadiendo 106 ml de HCl concentrado a 10 ml de metanol. A continuación, disolver CTZ liofilizado en metanol acidificado a 1 mg/ml y almacenar a -80 oC en tubos de tapa de tornillo.
   NOTA: Estas existencias conservan suficiente actividad en los ensayos de rutina de luciferasa, incluso después de 1 año de almacenamiento adecuado.
4. Preparar el tampones del ensayo Gaussia luciferase (GLuc) basado en la literatura 9, así como la información de patente¹⁰ para ayudar en la vida media del ensayo Gaussia luciferase en formato de placa de 96 pozos. Utilice la fórmula: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mg/ml Na₂PO₄, 300 mM de ascorbato sódico, 200 mM Na₂SO₃ en agua. Congele las existencias a -20 oC. Después de descongelar, almacene el tampón a 4oC.
5. Para preparar la solución de trabajo Gaussia luciferase, añada 4,2 l/ml de la solución de stock CTZ de 1 mg/ml (2,36 mM) al búfer de ensayo GLuc. Esto da como resultado una solución de trabajo de 2x de 10 M de CTZ que tendrá una concentración final de 5 M en el ensayo.

2. Cultivo de células InsGLuc MIN6 y sembrado para ensayos de secreción

1. Para cultivar células MIN6, tiza y sembra las células una vez por semana usando técnicas de cultivo celular estándar. Cambie los medios en las celdas cada dos o tres días. Incluya el antibiótico de selección adecuado, como 250 g/ml de G418 en los medios de comunicación.
   1. Para proporcionar un número suficiente de células semanalmente para los experimentos, mantenga las células en frascos T75. La sembración de 6 x 10⁶ células por T75 en 10 ml de medios normalmente producirá 30 x 10⁶ a 40 x 10⁶ celdas en total por T75 después de 7 días de cultivo.
2. Para preparar las células para el enchapado en placas de 96 pocillos, lave un confluente T75 de células InsGLuc MIN6 dos veces con PBS y agregue 2 ml de trippsina. Incubar a 37oC durante 5 min o hasta que las células se disocien del matraz. Determinar la concentración celular por mililitro.
   1. Diluir las células en un medio completo a 1 x 10⁶ celdas/ml para dar como resultado 1 x 10⁵ celdas en 100 ol por poca en una placa de 96 pocillos. Las células deben ser lo suficientemente confluentes para el ensayo después de 3-4 días.
      NOTA: Para extender el período de cultivo, se puede chapar la mitad de la concentración celular. No se requieren cambios en los medios antes del día del ensayo, a menos que las células deban someterse a tratamientos experimentales.

3. Ensayo de secreción de Gaussia luciferase estimulada por glucosa

1. El día del ensayo preparar suficiente KRBH para el experimento (paso 1.2). Se requiere un mínimo de 50 ml de KRBH por placa de 96 pocillos, por lo tanto, prepare al menos 75 ml para asegurar un búfer suficiente para el experimento. Prepare un tampón adicional si diferentes combinaciones de condiciones de tratamiento de medicamentos requerirán KRBH para la dilución.
2. Prepare un depósito con KRBH libre de glucosa. Decantar el medio de 96 placas de pozo sin invertir rápidamente la placa sobre un fregadero de laboratorio y luego blotar firmemente en una pila de toallas de papel para eliminar el exceso de medio.
3. Usando una pipeta electrónica o manual de 8 canales, pipeta 100 l /bien KRBH desde el depósito a través de la placa de 96 pocillos. Repita el proceso para un total de dos lavados.
4. (Paso opcional de los tratamientos compuestos agudos) Si no realiza tratamientos farmacológicos, continúe con los pasos 3.5 y 3.6 sin modificaciones. Para probar los efectos de moléculas pequeñas en la secreción de insulina, se pueden agregar compuestos a las células durante el período de preincubación, período de estimulación, o ambos.
   1. Una técnica es añadir compuestos por lotes al KRBH en tubos de 1,5 ml y utilizar una pipeta digital ajustable de 8 canales para transferir el fármaco-KRBH de los tubos a las células en placas de 96 pocillos.
      NOTA: Si no hay una pipeta ajustable disponible, se puede hacer una réplica de 96 pocillos de fármaco-KRBH y se puede utilizar una pipeta estándar de 8 canales para transferir el búfer. Se pueden realizar modificaciones adicionales en el paradigma del tratamiento para tratar las células durante 24 horas en medios anteriores al ensayo, como se describió anteriormente^1,8.
5. Añadir 100 l de KRBH que contenga la concentración deseada de glucosa o compuestos y colocar el plato en la incubadora de 37 oC durante 1 h.
   NOTA: Dependiendo del diseño experimental, es extremadamente útil tener una pipeta electrónica multicanal que permita la transición de las distancias de canal de una columna de ocho tubos de 1,5 ml a las 8 filas de una placa de 96 pocillos.
6. Después de la 1 h de preincubación, decantar el tampón en el fregadero y blot firmemente en la toalla de papel. Añadir 100 l de KRBH libre de glucosa por pozo para lavar el fondo acumulado de Gaussia luciferase. Decantar la placa de nuevo y añadir condiciones de control y estimulantes a la placa a 100 ol por poca. Colocar el plato en la incubadora de 37oC durante 1 h.
7. Recoja cuidadosamente 50 ml de sobrenadante utilizando una pipeta multicanal, cambiando las puntas entre las condiciones de tratamiento según sea necesario, y transfiera el sobrenadante a una placa de ensayo blanca opaca limpia de 96 pocillos.
   NOTA: Las placas de fondo transparente de paredes blancas se pueden utilizar si es necesario, aunque se perderá una cantidad significativa de señal de luciferasa.
8. Después de la recolección de 50 l de sobrenadante KRBH, la muestra se puede analizar inmediatamente. Si es necesario, sellar y almacenar las muestras a 4 oC durante unos días (vida media de la actividad de GLuc a 6 días) o -20 oC hasta un mes^11,12.

4. Ensayo secreto de Gaussia luciferase

1. Para preparar la solución de trabajo del ensayo GLuc, pipetee la cantidad necesaria de solución de stock CTZ (4,2 l/ml) en el búfer de ensayo DeLuc. Para evitar el calentamiento del CTZ, pipetee el CTZ rápidamente en el congelador de -80 oC o mantenga el tubo en hielo seco.
2. Usando una pipeta electrónica multicanal, agregue rápidamente 50 sde la solución de trabajo de ensayo GLuc por pozo en el plato de 96 pozos que contiene los sobrenatantes KRBH recogidos. Si hay gotas en los lados de cualquier pozo, gire brevemente la placa en una centrífuga de columpio de mesa.
3. Lea la luminiscencia en un lector de placas adecuado en pocos minutos y lea cada pozo con un tiempo de integración de 0,1 s.

Para medir el rendimiento del ensayo en condiciones de control, se puede completar una simple curva de dosis-respuesta de glucosa o una estimulación utilizando el paradigma de diazoxida. En el caso de la primera, la preincubación de las células durante 1 h en condiciones libres de glucosa seguida de tratamiento durante 1 h con concentraciones de glucosa crecientes debe dar lugar a muy poca actividad secretora en y por debajo de 5 mM, mientras que el aumento de la secreción se observa por encima de 8 glucosa mM (Figura2). La estimulación con 35 mM de KCl también sirve como un control positivo para la secreción estimulada. La inclusión de fármacos moduladores de secreción durante el período de estimulación debe dar la inhibición o potenciación esperada de la actividad secreta de GLuc (Figura3). Por ejemplo, el diazoxida se une al canal K_ATP y evita que se cierre tras una relación [ATP/ADP] aumentada, bloqueando la despolarización de la membrana y previniendo la secreción¹³. Los ésteres de phorbol como la para-metoxianfetamina (PMA) activan la proteína quinasa C (PKC) y son amplificadores conocidos de la secreción de insulina¹⁴. Por último, la estimulación con epinefrina de 1 M activa los receptores adrenérgicos_{de 2A}que a su vez activan el complejo heterotrimérico de proteína G Gi, inhibiendo la despolarización de la membrana y la secreción de insulina¹⁵. Es importante reconocer que si bien las células MIN6 son una línea celular inmortal, comienzan a perder las respuestas adecuadas de secreción de insulina inducidas por glucosa (como el cambio a la izquierda de la curva de respuesta) después del paso prolongado¹⁶. Por esta razón, es una buena práctica cultivar rutinariamente todas las líneas celulares MIN6 durante un máximo de ocho semanas (dividiendo una vez por semana) antes de comenzar de más de las reservas de nitrógeno líquido.

Figura 1: Descripción del reportero de InsGLuc. (A) En primer lugar, se generó una línea celular estable (en este caso células MIN6) expresando el transgén de insulina-Gaussia del promotor de insulina de rata. (B) La proteína completa se sintetiza y envasa en gránulos de insulina junto con insulina endógena. Las convertasas de prohormona separan el péptido, indicada por asteriscos. (C) La insulina procesada y Gaussia se cosecretan y la actividad luciferasa se detecta mediante la adición de CTZ en una reacción independiente de ATP, dependiente del oxígeno.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: El reportero de InsGLuc es un fiel proxy de la secreción de insulina de las células beta MIN6. (A) Respuesta de las células MIN6 InsGLuc al aumento de las concentraciones de glucosa y KCl (35 mM) con secreción de Gaussia luciferasa. Los datos son la actividad media de la luciferasa de plegado en comparación con las condiciones de glucosa de 0 mM para tres experimentos independientes. *, P < 0.05. La cifra ha sido modificada con permiso de Kalwat et al. ACS Sensors 2016¹. © 2016 Sociedad Química Estadounidense. (B) El reportero de InsGLuc en células MIN6 exhibe la respuesta secretor esperada al paradigma de diazoxida (Dz) donde el tratamiento dz de 250 m mantiene abierto el canal ATP K, bloqueando la despolarización de la membrana a menos que se proporcione KCl extracelular (35 mM) para provocar la "activación" de la afluencia de calcio. La adición adicional de glucosa (20 mM) bajo la condición Dz + KCl revela la amplificación metabólica de la secreción que se produce sin más aumentos en la afluencia de calcio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Inclusión de compuestos moduladores de secreción durante la glucosa estimula la secreción de InsGLuc. Las células InsGLuc MIN6 chapadas en formato de 96 pocillos como se describe fueron preincubadas en KRBH libre de glucosa durante 1 h. Las células fueron tratadas con o sin glucosa de 20 mM en presencia de dimetil sulfóxido (DMSO) (0,1%), KCl (35 mM), diazoxida (250 oM), PMA (100 nM), o epinefrina (1 m) durante 1 h. El gráfico de barras representa la media de se de al menos 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Recetas de tampón y solución en stock utilizadas para realizar los ensayos presentados.

Aquí presentamos un método para evaluar rápidamente las respuestas de secreción de insulina estimuladas por la glucosa de las células MIN6. Para obtener las mejores respuestas en el ensayo es importante sembrar las células MIN6 con la densidad adecuada y permitir que se conviertan en un confluente del 85-95%. Esto mejora las respuestas celulares a la glucosa debido a la mejora de los contactos y la sincronización de células celulares, que se produce tanto en los islotes primarios^{17,18,19,20,21} y MIN6 células^16,18. Para evitar pérdidas en la respuesta secretora a la estimulación de la glucosa, es importante mantener las células en la tan baja de un pasaje como sea posible y cultivar las células durante sólo 6-8 semanas antes de descongelar un nuevo vial de las reservas de nitrógeno líquido. Se pueden realizar modificaciones en la estrategia de chapado en la sección 2 del protocolo para adaptarse al equipo disponible según sea necesario. Plating InsGLuc MIN6 células en placas de 96 pocillos para ensayos de secreción permite un gran número de pozos para manipulaciones experimentales (incluyendo réplicas), así como mantener la precisión del chapado en un entorno de laboratorio normal, como chapado en platos con pozo más alto números a menudo requiere equipos especiales generalmente disponibles en núcleos de cribado de alto rendimiento.

Los ensayos actuales para la secreción de insulina, distintos del ensayo de luciferasa indirecta descrito aquí, incluyen: ELISA que utilizan lecturas colorimétricas (ensayo directo), radioinmunoensayos (ensayo de competencia) que utilizan lecturas radiactivas, anticuerpos basados en FRET ensayo de competencia²² y HTRF²³ que utiliza FRET entre anticuerpos ligados a tinte para medir directamente la insulina, y aptámeros de ADN²⁴. Cada uno de estos métodos tiene sus propias ventajas, pero en general son más caros y / o consumen mucho tiempo que un ensayo luciferasa. Una limitación clave del ensayo InsGLuc es el hecho de que la actividad luminiscente de la luciferasa co-secretada es sólo un proxy para la secreción real de insulina. Además, no hay diferencia esperada en la actividad luciferasa entre Gaussia con fragmentos de péptido C en su N- y C-termini o Gaussia dentro de la proteína proinsulina, ya que Gaussia luciferase se ha utilizado con éxito como una etiqueta para medir la secreción de otras proteínas²⁵. Esto pone de relieve el requisito de estudios de confirmación utilizando ensayos que miden la insulina procesada específicamente. También se pueden utilizar alternativas a las mediciones directas e indirectas de la secreción de insulina para evaluar la función celular. Existen una variedad de reporteros ópticos para lecturas que incluyen la relación ATP:ADP, la afluencia de calcio, la relación NAD⁺/NADH, la activación de quinasas reguladas por señal extracelular (ERK) o los niveles de monofosfato de adenosina cíclico (CAMP)^26.

Las futuras aplicaciones de InsGLuc en particular parecen estar en cribado de alto rendimiento. Este ensayo ya se ha utilizado en unpuñado de pantallas pequeñas publicadas 1,² y pantallas más grandes inéditas se completan⁷ o en curso. El desarrollo de otras iteraciones de esta tecnología puede implicar el etiquetado de otras hormonas de islotes secretadas con luciferasas para facilitar mediciones rápidas, como para glucagón o somatostatina. Las modificaciones podrían realizarse en cualquier caso en el que la línea celular se vuelva a crear utilizando enfoques alternativos, como CRISPR/Cas9, lentivirus o inserción mediada por transposasa en cualquier línea de célula beta adecuada. Otras posibles modificaciones al reportero original pueden incluir la sustitución de luciferasas secretas alternativas por Gaussia o la combinación de múltiples luciferasas secretas diferentes vinculadas a diferentes hormonas para un ensayo multiplexado. Más allá del cultivo celular, la tecnología CRISPR/Cas9 presenta la posibilidad de generar un modelo de ratón donde una luciferasa adecuada es derribada en la región de codificación c-péptido de Ins2 en el genoma. Tal ratón sería factible dado que los ratones transgénicos han sido creados con GFP en el mismo sitio 27 del péptido C y permitiría la medición de la función celular endógena con un ensayo de luciferas in vivo o ex vivo.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores agradecen a todos los miembros actuales y anteriores del laboratorio Cobb por su valioso trabajo y debate, y a Dionne Ware por la asistencia administrativa. Michael Kalwat cuenta con el apoyo de una Fundación de Investigación de la Diabetes Juvenil SRA-2019-702-Q-R. Este trabajo fue posible gracias a NIH R37 DK34128 y Welch Foundation Grant I1243 a Melanie Cobb. Las primeras partes de este trabajo también fueron apoyadas por un NIH F32 DK100113 a Michael Kalwat.