Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato

A continuación, se presenta un protocolo para obtener la evolución adaptativa de laboratorio de microorganismos bajo condiciones de cultivo utilizando quimiostato. Además, se discute el análisis genómico de la cepa evolucionado.

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Los microorganismos pueden sobrevivir y adaptarse a diversos ambientes. En situaciones de estrés severo, la adaptación puede ocurrir a través de la adquisición de fenotipos beneficiosos por mutaciones genómicas al azar y la selección positiva posterior ^1-3. Por lo tanto, las células microbianas se pueden adaptar cambiando metabólica o las redes de regulación para un crecimiento óptimo, que se denomina "evolución adaptativa". microbianas tendencias recientes importantes, tales como brotes de superbacterias y la aparición de cepas microbianas resistentes, están muy estrechamente relacionados con la evolución adaptativa en condiciones de estrés. En condiciones de laboratorio definidos, somos capaces de estudiar los mecanismos de la evolución molecular e incluso controlar la dirección de la evolución microbiana para diversas aplicaciones. A diferencia de los organismos multicelulares, los organismos unicelulares son muy adecuadas para la evolución adaptativa de laboratorio (ALE) por las siguientes razones: se regeneran rápidamente, mantienen grandes poblaciones, y es fácil de crear y mantener homogeneous entornos. En combinación con los recientes avances en las técnicas de secuenciación de ADN y las tecnologías de alto rendimiento, ALE permite la observación directa de los cambios genómicos que conducen a cambios en la regulación sistémicos. dinámica mutacional y una diversidad de la población también son observables. Estrategias de ingeniería genética se pueden determinar a partir del análisis de las cepas ALE ^4,5.

Cultura quimiostato es un método utilizado para obtener células en estado de equilibrio y aumentar la productividad en los procesos ^de fermentación de ^6. se añade medio fresco y el caldo de cultivo se recoge durante el proceso (el último incluye medio y biomasa). Cultura quimiostato a largo plazo, sin embargo, cambia la productividad de estado estacionario de la cultura y provoca la acumulación de mutaciones espontáneas y la selección durante el cultivo (Figura 1a). Bajo diferentes presiones de selección (estrés), la acumulación de mutaciones es mayor. Un aumento gradual de la tensión en un largo plazo chemostat prevé una selección continua de las mutaciones que trabajan contra los factores de estrés dadas, tales como temperatura, pH, presión osmótica, el hambre de nutrientes, la oxidación, los productos finales tóxicos, etc. transferencia de colonias a partir de un medio sólido y la transferencia en serie de un medio líquido (repetido cultivo por lotes) también permiten a los investigadores obtener microorganismos evolucionados (Figura 1B y 1C). Aunque la cultura chemostat requiere métodos complicados, la piscina de la diversidad (número de repeticiones y tamaño de la población) es mayor que la obtenida por transferencia de colonias y las técnicas de transferencia en serie. La exposición al estrés estable a las células individuales y la disminución de la variación en el estado celular durante el cultivo en quimiostato (estado estacionario) son otros beneficios de ALE comparación con las técnicas basadas en el cultivo por lotes. ALE inducida por estrés de Escherichia coli sometidos a altas condiciones de succinato se introduce en este artículo.

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Figura 1: Métodos de laboratorio de la evolución adaptativa (A) Chemostat;. (B) la transferencia en serie; (C) la transferencia de la colonia. Las máximas figuras ilustran el concepto de los métodos para ALE, y las cifras de abajo ilustran el número de células que crecieron durante la ALE. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación del equipo

1. Obtener un frasco quimiostato (150-250 ml) o un matraz Erlenmeyer (250 ml) que contiene un orificio de entrada y un puerto de salida. Conectar los puertos con tubo de silicona que permite velocidades de flujo de 10 a 100 ml / hr. Opcionalmente, utilizar una salida de aire, un puerto de salida de aire, y puertos de entrada y salida de agua de temperatura controlada.
2. Obtener un dispositivo adecuado para el frasco chemostat que proporciona para el control de la agitación y la temperatura (o utilizar una incubadora de agitación rotatoria).
3. Obtener dos bombas peristálticas con el fin de entregar medio fresco y recoger el cultivo.
4. Obtener un frasco de depósito (10 a 20 L) que contiene un puerto de salida de medios y un puerto de entrada de aire.
5. Obtener tubo de silicona adecuado para la tasa de dilución (es decir, ID 0,8 mm, rango de flujo desde 0,06 hasta 36 ml / min; L / S 13 tubos).

2. Medio preparación y esterilización

1. medio inicial
   1. Disolver 0,3 g de glucosa, 0,08 g NH ₄Cl, 0,05 g de NaCl, 0,75 g de Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O y 0,3 g de KH ₂ PO ₄ en 90 ml de agua destilada (DW) en un frasco quimiostato.
   2. Sellar el frasco quimiostato junto con el tubo con abrazaderas. No selle la salida de aire.
   3. Esterilizar el frasco quimiostato en un autoclave a 121 ° C durante 15 min. Después de la esterilización, almacenar el frasco quimiostato a temperatura ambiente.
   4. Disolver 0,02 g _MgSO4 · 7H ₂ O, 0,01 g de CaCl _2, y 0,1 mg de tiamina en 10 ml DW (solución A).
   5. Filtrar la solución A mediante una jeringa y un filtro de jeringa pre-esterilizado (un filtro de 0,45 micras de poro).
   6. Añadir la solución A los filtrados a la jarra quimiostato.
2. Medio estrés
   1. Disolver 30 g de glucosa, 8 g _{de NH4Cl,} 5 g de NaCl, 75 g de Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 30 g de KH ₂ PO _4, y 300 g de hexahidrato de succinato disódico (Na ₂ · · 6H succinato _{2 O; el factor estresante usado en este experimento) en 9,9 L DW en un frasco de depósito.}
   2. Sellar el vaso del depósito junto con el tubo con abrazaderas. No selle la salida de aire.
   3. Esterilizar el vaso del depósito en un autoclave a 121 ° C durante 15 min. Después de la esterilización, almacenar el frasco a temperatura ambiente.
   4. Disolver 2 g MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1 g de CaCl _2, y 10 mg de tiamina en 100 ml DW (solución A).
   5. Filtrar la solución A con una jeringa y un filtro de jeringa pre-esterilizado (un filtro de 0,45 micras de poro).
   6. Añadir la solución A los filtrados al vaso del depósito.
   7. Asépticamente conectar el tubo de silicona esterilizado al vaso del depósito y adjuntar las bombas peristálticas.
3. Medio-alto estrés
   1. Preparar el medio como en la sección 2.2, pero con una mayor concentración de factor de estrés (es decir, 3-5 g / L mayor en la adaptación succinato).
      Nota: Este protocolo es para la adaptación a un esfuerzo de THen el se pueden entregar a través del medio. En el caso de los factores estresantes físicos tales como la temperatura, agitación, o iluminación, el cultivo debe ser diseñada en consecuencia.

3. El cultivo inicial

1. Se inocula una sola colonia de tipo salvaje E. coli en un tubo de ensayo 15 ml que contiene 4 ml de medio inicial.
2. Incubar el tubo de ensayo en una incubadora de agitación durante 12 horas a 37 ° C y 220 rpm.
3. transferencia asépticamente 1 ml de cultivo previo a la jarra quimiostato.
4. Incubar el frasco quimiostato, proporcionando para la aireación (aire 50 ml / min) y agitación (200 rpm), a 37 ° C durante 6 horas.

4. Adaptación del estrés

1. Asépticamente conectar el extremo del tubo de silicio de las bombas a la jarra quimiostato.
2. Arrancar la bomba de salida (10 ml / hr o superior) y recoger la cultura.
   Nota: El cultivo debe estar en la fase exponencial, típicamente 4-8 horas después del cultivo inicial.
3. check la densidad óptica (600 nm) del cultivo de la tubería de salida.
4. Arrancar la bomba de entrada (10 ml / h, correspondiente a una tasa de dilución de 0,1 ^-1 hr).
5. Comprobar la densidad óptica del cultivo a 600 nm desde el tubo de salida cada 24 horas.
6. Operar el quimiostato durante 96 horas (volumen de negocios 9.6 veces) o más. Si la densidad óptica es estable, intercambiar el depósito que contiene el medio de alta tensión. Si la densidad óptica es inferior a 0,2, detener la bomba de entrada de alimentación durante 6 horas. Reiniciar la bomba de entrada y comprobar que la densidad óptica es superior a 0.2.
7. Aumentar gradualmente la concentración del factor de estrés al cambiar a un depósito que contiene una concentración de factor de estrés superior.
8. Tomar muestras de la cultura adaptada cada vez que llegue un hito (por ejemplo, una cepa adaptada a 100 g / L estrés succinato), y almacenar para su posterior análisis genómico.
9. Para el almacenamiento de la muestra, mezclar la muestra de cultivo (0,5 ml) con una soluti glicerol esterilizado 80%en (0,5 ml) y almacenarlo a -80 ° C.
   Nota: Si el microorganismo adquiere una capacidad de degradar el factor de estrés durante el proceso de ALE, la concentración de estrés en la jarra de fermentación no es el mismo que en el depósito fresco.

5. Single-colonia aislamiento de la cepa Stress-adaptado

1. Preparar medio de placa de agar (1,6% de agar) que contiene el mismo factor de estrés y a la misma concentración de medio.
2. Placa de la cultura de salida (0,1 ml) de la quimiostato, y se incuba a 37 ° C durante 16 hr.
3. Recoger colonias individuales de la placa usando un palillo de dientes estéril e inocular en 15 ml tubos de ensayo que contienen el mismo factor de estrés y a la misma concentración medio como en el quimiostato, y se incuba durante 6 hr.
4. Transferir 1 ml de caldo de cultivo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 50 ml de medio. Cosecha 0,5 ml de caldo de cultivo cada 1 hr, y medir la DO a 600 nm. Comparación de la tasa de crecimiento de la strai adaptadon a la de la cepa de tipo salvaje dado el factor de estrés.

Para la adaptación de alta tensión succinato, la de tipo salvaje E. coli cepa W3110 se cultivó en un quimiostato a D = 0,1 ^h-1 por 270 días (Figura 2).

Figura 2: High-succinato de adaptación al estrés de E. coli W3110 uso de la cultura quimiostato. flechas delgadas indican los momentos en que se aumentó la concentración de factor de estrés, y flechas en negrita indican los momentos en los que se conservaban las culturas. Los números con flechas indican las concentraciones del factor de estrés, hexahidrato de succinato disódico. El cambio en la biomasa durante ALE y las concentraciones de factor de estrés están representados. La figura fue modificado a partir de J. Biosci. Bioeng ^7. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una concentración de factor de estrés inicial de 30 g / L (succinato disódico hexahidratado) se incrementó gradualmente cada vez que la cultura chemostat alcanzó un estado de equilibrio, hasta que la concentración de factor de estrés era 160 g / L. El E. adaptado coli cepa DST160 (tolerantes a 160 g / l de estrés succinato disódico) se adquirió después de 270 días. La cepa DST160 exhibió crecimiento no inhibido bajo tensión de alta succinato (160 g / L de estrés), mientras que la cepa ancestro (W3110) mostró casi ningún crecimiento (Figura 3).

Figura 3: Curvas de crecimiento de la de tipo salvaje (W3110, círculo blanco) y la cepa adaptada (DST160, círculo negro) bajo tensión alta succinato La figura muestra que la cepa adaptada creció sin demora a alto succinato condiciones de estrés, mientras que el salvaje. tipo no lo hizo. El errorbarras indican la desviación estándar de tres experimentos independientes. La figura fue modificado a partir de J. Biosci. Bioeng ^7. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los microorganismos son capaces de adaptarse a casi todos los entornos debido a su rápida tasa de crecimiento y la diversidad genética. la evolución adaptativa de laboratorio permite a los microorganismos a evolucionar en condiciones diseñadas, lo que proporciona una manera de seleccionar los organismos individuales que albergan mutaciones espontáneas que son beneficiosos en las condiciones dadas.

La técnica quimiostato es más robusta para lograr la evolución impulsada artificialmente que las técnicas de transferencia por las siguientes razones: (a) un entorno estable - porque las técnicas de transferencia se basan en cultivos de lotes o bien en sólido o en medio líquido, el medio ambiente de las células varía durante lote la cultura, mientras que el estrés ambiental del quimiostato es constante; (B) una población más grande y una selección continua - la población más grande de la chemostat proporciona más la diversidad genética de la población menor de técnicas de transferencia. selección continua de la chemostat técnica es una manera más rápida de lograr la evolución de la selección intermitente de técnicas de transferencia. Es fundamental que la cultura quimiostato eviten la contaminación por otros microorganismos durante el procedimiento ALE, y se requieren condiciones asépticas en toda la cultura quimiostato. El procedimiento ALE puede ser modificada por cambios en los factores de estrés, como el estrés oxidativo, estrés osmótico, y el estrés producto tóxico. Hay algunas limitaciones técnicas a ALE por la cultura quimiostato. La evolución tiene lugar por casualidad; por lo tanto, diferentes investigadores no pueden ser capaces de obtener el mismo resultado de la evolución, aunque las consecuencias de las mutaciones podrían estar relacionados. Otra limitación es el lavado de la cultura quimiostato cuando la concentración de factor de estrés se incrementa demasiado rápido. Si la biomasa se ​​reduce a una cierta cantidad (es decir, OD = 0,2 en este procedimiento) después de que se aumentó la concentración de factor de estrés, la administración del factor de estrés debe detenerse durante al menos unas pocas generaciones adar tiempo para adaptar la tensión.

Los acontecimientos recientes en la tecnología de secuenciación del genoma han ayudado a la comprensión de las mutaciones que se desarrollan en respuesta a ciertas condiciones de estrés. Por ejemplo, una mutación del ADN altera un efecto sistémico en particular que es beneficioso para el medio ambiente dado (es decir, la tolerancia a un factor de estrés tóxico). Por lo tanto, ALE puede ser utilizado para estudiar la función de genes o regulación de la red, o como una materia prima para la 'evolución acelerada'. estudios ALE también son útiles en la simulación el desarrollo de bacterias resistentes a los antibióticos, lo que indica los mecanismos por los que surgen cepas bacterianas resistentes a los fármacos peligrosos. A medida que la trayectoria de la evolución está grabado en el genoma, el descubrimiento de las alteraciones genéticas que conducen a los fenotipos deseados (tales como la tolerancia al estrés) es el siguiente obstáculo cepas evolucionadas vez se obtienen ^8. Entre las tecnologías de secuenciación de próxima generación disponibles en la actualidad, la plataforma Illumina y Ion Torrentformas son adecuados para la detección de sustituciones de nucleótidos o pequeños indeles que se producen en las cepas evolucionadas, y ambos son asequibles. Debido a que la detección de la variante por lo general implica la cartografía de leer la altura de las secuencias de referencia, la disponibilidad de la secuencia del genoma de la cepa ancestral es crucial. Incluso si la secuencia del genoma de la cepa fundador está disponible en bases de datos públicas, a menudo es deseable para secuenciar simultáneamente con el evolucionado, porque puede haber algunas diferencias adicionales en la cepa de partida real. Los protocolos para la identificación de mutaciones son fácilmente disponibles a través de Internet o una búsqueda en la literatura ^9,10. Por ejemplo, BRESEQ es una tubería especialmente diseñado para el análisis genómico de los microbios en el laboratorio utilizando evolucionado próxima generación de datos de secuenciación ^11. Las comparaciones de las cepas evolucionadas en ciertos hitos (por ejemplo, en estos datos representativos, de tipo salvaje, DST50, DST100 y DST160) pueden proporcionar la secuencia de la cepa evolucionadas y dar una idea de las consecuencias de un factor de estrés dado. Por lo tanto, el conocimiento y las aplicaciones de los experimentos ALE, junto con la biología de sistemas y la identificación de las variables de perturbación sistémica, se espera que en un futuro próximo.

The authors have nothing to disclose.

This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).