Ensayos de desacetilación para desentrañar la interacción entre las sirtuinas (SIRT2) y proteína-sustratos específicos

This protocol describes the required steps to execute in vitro and in vivo deacetylation assays in order to establish the role of proteins as specific deacetylation substrates for sirtuins and further study the role of reversible - lysine acetylation as a post-translational modification.

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further supported by recent findings in high-resolution mass spectrometry based proteomics showing that many new proteins and sites within these proteins can be acetylated. However the identity of the enzymes regulating these proteins and sites is often unknown. Among these enzymes, sirtuins, which belong to the class III histone lysine deacetylases, have attracted great interest as enzymes regulating the acetylome under different physiological or pathophysiological conditions. Here we describe methods to link SIRT2, the cytoplasmic sirtuin, with its substrates including both in vitro and in vivo deacetylation assays. These assays can be applied in studies focused on other members of the sirtuin family to unravel the specific role of sirtuins and are necessary in order to establish the regulatory interplay of specific deacetylases with their substrates as a first step to better understand the role of protein acetylation. Furthermore, such assays can be used to distinguish functional acetylation sites on a protein from what may be non-regulatory acetylated lysines, as well as to examine the interplay between a deacetylase and its substrate in a physiological context.

Post-translational modifications (PTMs) regulate cell signaling networks allowing cells to rapidly respond to internal and external signals. Over the last few decades, many different PTMs playing a pivotal role in diverse processes have been identified but only a few have been studied extensively, such as phosphorylation, acetylation and ubiquitination ^1-3. Focusing on acetylation, Allfrey et al. were the first to propose a role for histone acetylation in regulating gene transcription about 50 years ago ⁴. Research in this field has revealed that histone lysine acetylation modulates chromatin condensation and it is considered to be an epigenetic mark as part of the histone code ⁵. Although it took a long time until the discovery of tubulin as the first non-histone acetylation target ⁶, it is well established now that hundreds of eukaryotic proteins beyond histones can be acetylated and lysine acetylation has been recognized as a wide-spread PTM that may rival phosphorylation and ubiquitination in its prevalence ^7-9. Interestingly, non-histone acetylated proteins can be signaling molecules in the cytoplasm, transcription factors in the nucleus, and metabolic enzymes in mitochondria, highlighting the significance of acetylation in regulating a plethora of cellular processes.

The acetylation status of a protein depends on the coordinated and opposing function of lysine acetyltransferases (KATs) and lysine deacetylases (KDACs) which add and remove acetyl groups from proteins. The reversible acetylation of lysine, which involves neutralization of a positive charge ¹⁰, alters protein structure and it seems very likely to also alter enzymatic function in several cases ^11-13. Focusing on KDACs, 18 proteins have been identified in the human and mouse genomes ^14-16. Among them, mammalian sirtuins (also called class III histone lysine deacetylases) which are distinct from other members as they require NAD⁺ for their enzymatic function, have attracted extensive interest in this research field ¹⁶. In mammals, seven sirtuins (SIRT1-7) have been identified, each of them sharing a conserved 275-amino-acid catalytic core domain, which are mainly categorized according to their subcellular localization to the nucleus (SIRT1, 6, and 7), mitochondria (SIRT3, 4, and 5), or cytoplasm (SIRT2). SIRT1-3 have a robust deacetylation activity, while SIRT4 is reported to display ADP-ribosyltransferase activity, SIRT5 may function as a protein desuccinylase and demalonylase, and SIRT6 and SIRT7 display weak deacetylase activity but are involved in other types of acylations ¹⁷. In accordance with the significance of acetylation as a regulatory PTM modification involved in several cellular functions, sirtuins have also been implicated in a wide range of processes. After the first breakthrough studies establishing the role of sirtuins in life span extension, it has been shown that they are involved in diverse cellular functions including DNA repair, maintenance of genomic instability, apoptosis, response to stress and inflammation, control of energy efficiency, circadian clocks and metabolism, as well as contributing to the initiation and/or progression of age-related diseases such as cancer, neurodegeneration and type 2 diabetes ^15,16.

Despite the significant progress in the field of sirtuin biology, more work remains to unravel undiscovered roles and functions through the identification of novel substrates. This is evidenced more emphatically by recent advances in high-resolution mass spectrometry (MS) based proteomics which have significantly increased the number of proteins found to be acetylated but most importantly have identified several different acetylated lysines in each protein, arguing that acetylation may be as wide-spread as other PTMs such as phosphorylation ^7,8,17. Taking into consideration that specific deacetylases have not yet been identified for most of these acetylated proteins-substrates, it is reasonable to suggest that both in vitro and in vivo deacetylation assays are needed to confirm and establish an acetylated protein as a legitimate substrate of a specific deacetylase. In the experimental protocols described below, details will be given on how to perform both in vitro and in vivo deacetylation assays using SIRT2 as the specific deacetylase.

1. In Vitro Ensayo de desacetilación

1. Purificación de SIRT2
   1. Preparar una placa de cultivo de 10 cm de células HEK 293T cultivadas en 8 ml de DMEM con 10% de FBS y antibióticos y se cultivaron en un 37 ° C, 5% CO incubador de cultivo de tejido ₂ en alrededor de 70% de confluencia el día siguiente.
   2. Al día siguiente, co-transfectar 4 mg Pcdh-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivirus realizado en nuestro laboratorio), 4 mg pCMV dR8.2 dvpr (embalaje vector) y 0,5 g de pCMV-VSV-G (vector sobre) ¹⁸ utilizando polietilenimina (PEI) en una proporción de 3 l PEI de ADN / mg.
   3. Cambiar los medios de comunicación después de 12 horas.
   4. Recoger el sobrenadante después de 36-48 horas.
   5. Eliminar los residuos por centrifugación a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
   6. Después de filtrar a través de filtros de 0,22 micras, hacer alícuotas de 1 ml de SIRT2 lentivirus y mantenerse a -80 ° C.
   7. Descongelar lentivirus SIRT2 en hielo (es importante para almacenar el virus a -80 ° C cuando no se utiliza el virus).
   8. Infectar una placa de 6 pocillos de células 293T confluentes HEK 80-90% con 1 ml de lentivirus en presencia de 8 mg / ml de polibreno.
   9. Colocar las células infectadas por el virus en 37 ° C incubadora hasta el día siguiente (24 h).
   10. Reemplazar medio después de 24 horas.
   11. 48 h después de la infección, visita eficacia de la infección mediante la detección de GFP células positivas bajo un microscopio de fluorescencia.
   12. Si la eficiencia de infección es buena (al menos 40 a 50% de células infectadas), en lugar de medio con medio de cultivo que contiene 2 mg / ml de puromicina para seleccionar para SIRT2 estable en las células que expresan.
       Nota: Este toma aproximadamente 2 semanas, y el medio se cambió cada 3-4 días. las células no infectadas mueren durante este período de selección y sólo las células infectadas con el lentivirus SIRT2 crecer.
   13. Analizar la expresión de SIRT2 Bandera de etiquetado por transferencia de Western usando un anticuerpo anti-Flag (dilución 1: 1000) después de correr 40 g de proteína total en un gel de SDS-PAGE 10% antes de comenzar el purifproceso icación (recomendado) ^19,20.
   14. Para purificar SIRT2 activa, dividir celdas en relación 1: 3 por tripsinización con el fin de tener suficientes platos de células HEK 293T que sobreexpresan de forma estable Bandera-SIRT2 (10 cm Diez platos permitirán purificación de proteínas suficientes para experimentos posteriores).
       1. Para trypsinize las células, eliminar el medio de cultivo y eliminar el suero residual mediante lavado con DPBS células estériles. Añadir lentamente 2,5 ml de una solución 0,25% de tripsina-EDTA para cubrir la monocapa celular, se incuba a temperatura ambiente durante 30 a 45 seg. Después de retirar la solución de tripsina-EDTA, se incuba a 37 ° C hasta que las células comienzan a separar. A continuación, añadir medio de cultivo y transferir las células a los nuevos platos.
   15. Retirar el medio de cultivo, lavar las células dos veces en PBS y recoger las células por tripsinización, seguido de centrifugación a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C.
   16. Sedimento celular Lyse en 500 l de tampón de lisis A (20 mM HEPES pH 7,9, KCl 18 mM, EGTA 0,2 mM, 1,5 mM MgCl ₂, 20% de glicerol, 0,1% NP-40) que incluye un cóctel de inhibidores de proteasa y 1 mM TSA durante 30 minutos a 4 ° C bajo rotación constante.
   17. Centrifugar a 14.000 xg durante 15 min a 4 ° C y la transferencia de sobrenadante a un nuevo tubo.
   18. Realizar la inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo anti-Flag conjugado con perlas de agarosa como se describe a continuación.
       1. Añadir 200 a 300 l de anticuerpo anti-Flag conjugado con perlas de agarosa al lisado de proteínas (proteína total 10 a 20 mg).
       2. Incubar durante la noche a 4 ° C con agitación constante.
       3. Recoger los inmunoprecipitados por centrifugación a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
       4. Lavar el precipitado 5 veces con 10 ml de tampón de lisis A a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Después de cada lavado, sedimentar las perlas y sustituir el sobrenadante con tampón A.
   19. Preparar la solución de péptido Flag 1x (incluyendo un cóctel inhibidores de proteasa y 1 mM TSA en PBS).
   20. Añadir 500 l de la bandera 1x peptídicase solución a las perlas de agarosa y se incuba durante 30 min a 4 ° C bajo rotación constante.
   21. Recoger el sobrenadante por centrifugación a 6000 xg durante 2 min a 4 ° C.
   22. Repetir dos pasos anteriores.
   23. Eliminar los granos de sobrenadante mediante el uso de tubos de filtración y centrifugación a 15.000 xg durante 1 min a 4 ° C.
   24. Concéntrese muestra eluida hasta que la concentración final de proteína es 1 g / l usando una membrana de ultrafiltración.
   25. Compruebe proceso de purificación mediante electroforesis realizan utilizando 1 g de la muestra eluida.
   26. gel mancha con una solución de tinción disponible comercialmente para confirmar la purificación SIRT2.
   27. Mantenga SIRT2 purificada a -80 ° C.
2. Purificación de Proteína acetilado-sustrato
   1. Preparar 10 cm x placas de cultivo de 10 cm con células HEK 293T en alrededor de 70% de confluencia el día siguiente.
   2. Las células día siguiente, co-transfectar con 5 g de una bandera etiquetados plásmido vector Expressing la proteína de sustrato, así como 5 g de la acetil-transferasa específica que puede acetilar la proteína usando PEI en una proporción de 3 l PEI de ADN / mg.
      Nota: Si el acetil-transferasa específica no es conocida, co-transfectar con una mezcla de histonas conocido acetil-transferasas (HAT), tales como p300, CBP, GCN5, Tip60 y PCAF.
   3. Cambiar medio después de 12 horas.
   4. El día antes de la lisis de las células, el tratamiento de las células con 1 mM TSA y nicotinamida 2 mM (NAM) durante la noche mediante la sustitución del medio de cultivo con medio que contiene TSA / NAM para maximizar los niveles de acetilación de la proteína de sustrato mediante la inhibición de desacetilasas.
   5. 48 h después de la transfección, eliminar el medio de cultivo, lavar las células dos veces en PBS y recoger las células por tripsinización, seguido de centrifugación a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C.
   6. sedimento celular Lyse en 500 l de tampón de lisis A por placa (20 mM HEPES pH 7,9, KCl 18 mM, EGTA 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM, 20% de glicerol, 0,1% NP-40) que incluye una proteasa inhibitors cóctel, 1 M TSA y NAM 2 mM durante 30 minutos a 4 ° C con rotación constante.
   7. Centrifugar a 14.000 xg durante 15 min a 4 ° C y la transferencia de sobrenadante a un nuevo tubo.
   8. Realizar la inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo anti-Flag conjugado con perlas de agarosa como se describe a continuación.
      1. Añadir 200 a 300 l de anticuerpo anti-Flag conjugado con perlas de agarosa al lisado de proteínas (proteína total 10 a 20 mg).
      2. Incubar durante la noche a 4 ° C con agitación constante.
      3. Recoger los inmunoprecipitados por centrifugación a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
      4. Lavar el sedimento 2 veces con 10 ml de tampón de lisis A a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Después de cada lavado, sedimentar las perlas y sustituir el sobrenadante con tampón de lisis A.
      5. Lavar el sedimento 3 veces con 10 ml de tampón de lisis A sin NAM a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. Después de cada lavado, sedimentar las perlas y sustituir el sobrenadante con tampón de lisis A. Es Important no llevar sobre cualquier NAM a la reacción de desacetilación.
   9. Preparar la solución de péptido Flag 1x (incluyendo inhibidores de proteasa y 1 mM TSA en PBS).
   10. Añadir 500 l de solución de péptido Flag 1x a las perlas de agarosa y se incuba durante 30 min a 4 ° C bajo rotación constante.
   11. Recoger el sobrenadante por centrifugación a 6000 xg durante 2 min a 4 ° C.
   12. Repetir dos pasos anteriores.
   13. Eliminar los granos de sobrenadante mediante el uso de tubos de filtración y centrifugación a 15.000 xg durante 1 min a 4 ° C.
   14. El uso de una membrana de ultrafiltración, se concentran muestra eluida hasta que la concentración de proteína es 1 mg / ul.
   15. Realizar electroforesis mediante la ejecución de 1 l de la muestra eluida sobre un gel de SDS-PAGE al 4-12%.
   16. Confirmar la acetilación de proteína-sustrato mediante transferencia Western utilizando anticuerpos contra Ac-K (1: 1000 dilución) y la proteína de sustrato (dilución depende del anticuerpo específico utilizado).
   17. Mantenga purificado acetiló la proteína-sustrato a -80 ° C.
3. In Vitro La desacetilación de Reacción
   1. Preparar el tampón de desacetilación B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl 1 mM ₂ 0,5 mM TSA)
   2. Preparar 3 reacciones diferentes en diferentes tubos en 20 l de volumen final (Tabla 1).
   3. Incluir reacciones adicionales para confirmar la desacetilación de la proteína-sustrato por SIRT2 (opcional). Añadir 2 g de desacetilación purificada nula SIRT2 mutante (esto se puede hacer usando el protocolo descrito en 1.1 después de usar un lentivector Pcdh-puro-GFP-SIRT2 ^H187Y -Flag) a la reacción en lugar de desacetilasa SIRT2 activa o añadir 10 mM de nicotinamida (NAM ) a la reacción para inhibir la actividad de desacetilación de SIRT2 (Tabla 1).
   4. Incubar las reacciones durante 3 horas a 30 ° C con agitación constante.
   5. Se detiene la reacción mediante la adición de 20 l de tampón de muestra 2x y hervir las muestras fo 10 min a 95 ° C.
   6. Realizar electroforesis mediante la ejecución de la mezcla de reacción en un gel de SDS-PAGE al 4-12% y detectar el estado de acetilación de la proteína de sustrato por transferencia de Western usando un anticuerpo anti Ac-K (dilución 1: 1000) ^19,20.

2. In Vivo La desacetilación Ensayo

1. SIRT2 sobreexpresión en células cultivadas
   1. Preparar platos de 10 cm de cultivo con células HEK 293T que sobreexpresan de forma estable vector Pcdh-puro-GFP-vacío, Pcdh-puro-GFP-SIRT2-Flag y Pcdh-puro-GFP-SIRT2 ^H187Y -Flag (como se describe en el punto 1.1) sean de alrededor de 70 % de confluencia.
   2. Alternativamente, se preparan 10 placas de cultivo cm con células de aproximadamente el 70% de confluencia y realizar la sobreexpresión transitoria usando 5 g de los vectores mencionados anteriormente usando PEI en una proporción de 3 l PEI de ADN / mg.
   3. Realizar el Western Blot de extractos celulares totales utilizando un anticuerpo anti-Flag (dilución 1: 1000) para demostrar la sobreexpresión de Flag-tagged SIRT2 ^19.
2. Interferencia de ARN a desmontables SIRT2 en células cultivadas
   1. Preparar una placa de cultivo de 10 cm de células HEK 293T en alrededor de 70% de confluencia el día siguiente.
   2. El día siguiente, co-transfectar 4 g pLKO1-puro-sh SIRT2 (lentivirus) ^19, 4 g pCMV dR8.2 dvpr (vector de empaquetamiento) y 0,5 g pCMV-VSV-G (vector sobre) ¹⁸ utilizando polietilenimina (PEI) en una proporción de 3 l PEI de ADN / mg.
      Nota: Para derribar SIRT2, utilizamos shRNAs horquilla simples en el vector lentiviral pLKO.1 diseñado por el Consorcio El ARNi (TRC).
   3. Siga el procedimiento que se describe en el apartado 1.1 para producir shSIRT2 lentivirus e infectar las células diana para derribar SIRT2.
   4. Realizar el Western Blot de extractos celulares totales utilizando un anticuerpo anti-SIRT2 (dilución 1: 1000) para demostrar knockdown SIRT2 eficiente después de correr 40 g de proteína total en un gel de SDS-PAGE 10%.
   5. Alternativamente,preparar 10 placas de cultivo cm con células de aproximadamente el 70% de confluencia y realizar caída transitoria de SIRT2 usando siRNAs siguientes instrucciones del fabricante.
   6. Realizar el Western Blot de extractos celulares totales utilizando un anticuerpo anti-SIRT2 (dilución 1: 1000) para demostrar knockdown SIRT2 eficiente después de correr 40 g de proteína total en un gel de SDS-PAGE 10%.
3. La inmunoprecipitación e inmunotransferencia para detectar los niveles acetilados en células cultivadas
   1. 12 h antes de la recogida de sedimentos celulares de cualquiera de las células que sobreexpresan SIRT2 (véase 2.1 anteriormente) o SIRT2 derribado células (véase 2.2 anterior), añadir 1 micras TSA al medio de cultivo para inhibir la clase III desacetilasas no histonas.
   2. Retirar el medio de cultivo, lavar las células dos veces en PBS y recoger las células por tripsinización, seguido de centrifugación a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C.
   3. Añadir 10 ml de tampón de lisis A (20 mM HEPES pH 7,9, KCl 18 mM, EGTA 0,2 mM, 1,5MgCl mM _2, 20% de glicerol, 0,1% NP-40) que incluye un cóctel de inhibidores de proteasa, TSA 1 M y NAM 2 mM.
   4. Se incuba a 4 ° C durante 30 minutos bajo rotación constante.
   5. Recoger los sobrenadantes por centrifugación a 20.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C.
   6. Calcular la concentración de proteína usando un ensayo de proteínas de Bradford.
   7. Transferencia de 1 mg de proteína total a nuevos tubos en un volumen final de 1 ml usando tampón de lisis A. Use la Tabla 2 como referencia para preparar muestras de proteína a partir de células que sobreexpresan ya sea SIRT2 o después de caída SIRT2.
   8. Realizar una inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo contra la proteína de sustrato específico junto con proteína A / G (se recomienda 40 l suspensión de perlas). Como alternativa, utilizar un anticuerpo Ac-K contra conjugada con perlas de agarosa (20 l suspensión de perlas suele ser suficiente) para inmunoprecipitar todas las proteínas acetilados.
   9. Incubar las muestras a 4 ° C bajo CONSTAnt durante la noche rotación.
   10. Recoger inmunoprecipitados por centrifugación a 1.000 xg durante 2 min a 4 ° C.
   11. Lavar perlas 5 veces con 1 ml de tampón A a 1.000 xg durante 2 min a 4 ° C.
   12. perlas de resuspender en 40 l de tampón de muestra 2x.
   13. Hervir las muestras durante 10 minutos a 95 ° C.
   14. Realizar electroforesis mediante la ejecución de las muestras eluidas (40 mu l de paso 2.3.12) en un gel SDS-PAGE al 4-12% sin perturbar las perlas durante la transferencia de las muestras eluidas.
   15. Detectar niveles acetilados de la proteína de sustrato por transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-Ac-K (dilución 1: 1000) si se utilizó un anticuerpo específico de proteína-sustrato para la inmunoprecipitación, o un anticuerpo específico contra la proteína-sustrato (Seguir las recomendaciones de el anticuerpo específico con respecto a la dilución) si se utilizaran contra cuentas de Ac-K para la inmunoprecipitación.

Para que una proteína para ser considerado como un objetivo desacetilación legítimo para cualquier enzima con actividad de desacetilación, tanto in vitro como in vivo en ensayos de desacetilación se tienen que realizar para establecer la interacción entre la desacetilasa y su sustrato. Para el ensayo de desacetilasa in vitro, se requiere la purificación tanto de la desacetilasa y el sustrato de proteína acetilado antes del ensayo se puede hacer. Aquí se utiliza la SIRT2 sirtuinas citoplasmática como el deacetilasa específico que se estudiará. SIRT2 desacetilasa es una enzima y el uso de un mutante que carece de la actividad desacetilasa es muy recomendable como un control negativo para el ensayo de desacetilación. Usando el procedimiento de purificación descrito en 1.1, tanto SIRT2 y SIRT2 ^H187Y se pueden purificar con éxito a una concentración final de 1 g / l. Esto se puede confirmar después de ejecutar las proteínas purificadas en un gel seguida de tinción(Figura 1A, superior), así como después de la transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-Flag ya que tanto SIRT2 y SIRT2 ^H187Y etiquetados con un péptido Flag (Figura 2A, inferior). El mismo procedimiento de purificación puede ser seguido por la purificación de la proteína sustrato con algunas modificaciones. La proteína tiene que ser acetilado antes de que pueda ser utilizado para el ensayo de desacetilación que significa que necesita ser purificado en las células que sobreexpresan el acetil transferasa específica o una mezcla de los sombreros capaces de acetilar la proteína. Usando el procedimiento de purificación descrito en 1.2, la proteína se puede purificar acetilado (Figura 1B, superior). Para confirmar que la proteína es, en efecto acetilado y se puede utilizar para el ensayo de desacetilación in vitro, transferencia de western usando un anticuerpo anti Ac-K es necesaria para mostrar el aumento de los niveles acetilados de la proteína purificada en células que sobreexpresan la acetil-transferasas (Figura 1B, Lower).

Después de la purificación de proteínas con éxito, el ensayo de desacetilación in vitro se puede realizar. Sirtuinas, incluyendo SIRT2, son de clase III desacetilasas de histonas lisina que son distintas de otras desacetilasas, ya que requieren NAD ⁺ para su función enzimática. Consistente con esto, no desacetilación puede ser detectada mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti Ac-K en ausencia de NAD ^+, independientemente de la presencia de SIRT2 catalíticamente activo (Figura 2, carril 2 vs 1). Por el contrario, la disminución de los niveles acetilados de la proteína acetilado cuando tanto SIRT2 y NAD ⁺ están presentes en la reacción sugieren que la proteína puede ser considerado como un objetivo de desacetilación para SIRT2. Con el fin de verificar estos resultados, los diferentes controles negativos se pueden utilizar. Por ejemplo se puede detectar ninguna diferencia en los niveles de desacetilación de la proteína cuando un SIRT2 deficiente desacetilación (SIRT2 ^H187Y) se utiliza en lugar de la SIRT2 de tipo salvaje catalíticamente activo (Figura 2, carril 5 vs 4). Un efecto similar se puede ver cuando un inhibidor de sirtuin bien establecida, NAM, se añade a la mezcla de reacción, lo que implica que la disminución en los niveles acetilados de la proteína está mediada por la actividad desacetilasa de SIRT2.

desacetilación aberrante está implicada en diversos procesos celulares y enfermedades relacionadas con la edad. Por lo tanto, un paso crucial en la profundización de los conocimientos sobre la interacción entre una histona y su sustrato es establecer esta interconexión en las células, donde este fenómeno puede tener un impacto fisiológico. Por otra parte, la comprobación de desacetilación en sistemas de cultivo celular in vivo permite el estudio de caso de desacetilación en un contexto específico de célula o tejido que se puede conectar más fácilmente a un fenotipo o resultado específico. Esto excluye la posibilidad de que la detectada en Deac vitroactividad etylation es artificial debido a la presencia tanto de la desacetilasa y su sustrato en el tubo al mismo tiempo, que nunca puede ocurrir en condiciones fisiológicas normales en las células. Para el ensayo de desacetilación in vivo, las células que sobreexpresan tanto SIRT2 y SIRT2 ^H187Y, así como el sustrato de proteína se pueden utilizar siguiendo los procedimientos descritos en 2.1 y 2.2. Los extractos celulares preparados a partir de estas células se pueden confirmar de expresar SIRT2, SIRT2 ^H187Y, y el sustrato de la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos. En el ensayo descrito aquí, todas las proteínas expresadas de forma exógena etiquetados para facilidad de los experimentos realizados (Figura 3, panel inferior para detectar SIRT2 marcada con HA / SIRT2 ^H187Y y el panel medio para detectar la proteína sustrato Bandera de etiquetado). Para determinar si la proteína diana es un sustrato de la desacetilación de SIRT2, inmunoprecipitación se lleva a cabo utilizando un anticuerpo anti-Flag para tirar hacia abajo la proteína diana followed por transferencia Western utilizando un anticuerpo anti Ac-K. Disminución de los niveles acetilados de la proteína en células que expresan SIRT2 (Figura 3 panel superior, carril 3 vs 2) y la falta de afectar los niveles de acetilados en células que expresan la desacetilasa mutante deficiente SIRT2 (Figura 3 panel superior, carril 4 vs 3) sugieren que la proteína acetilado puede ser un objetivo de desacetilación de la desacetilasa específica in vivo. Esto se puede confirmar aún más cuando desacetilación SIRT2 mediada se inhibe después de tratar las células con el NAM (Figura 3 panel superior, carril 5 vs 3) el establecimiento de los ejes específicos deacetilasa-sustrato en las células estudiadas.

Figura 1: Purificación de tanto la desacetilasa y la proteína-sustrato acetilado que se utilizarán para el ensayo de desacetilación in vitro. (A) 1 g de tanto SIRT2 y SIRT2 ^H187Y (desacetilación mutante defectuoso) se corrieron en un gel siguiendo el protocolo de purificación como se describe en 1.1. El gel se tiñó con una solución de tinción disponible comercialmente y después de decoloración, tanto proteínas purificadas se puede detectar (superior). Las proteínas pueden ser detectados después de la transferencia en membrana de PVDF y transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-Flag (inferior). (B) 1 g de sustrato de proteína y sustrato de proteína acetilado hiper (alfa-enolasa se ​​utilizó como sustrato SIRT2 basado en espectrometría de masas de datos no publicados generados en nuestro laboratorio) se corrieron en un gel siguiendo el protocolo de purificación como se describe en 1.2. El gel se tiñó con una solución de tinción disponible comercialmente y después de decoloración, el sustrato de proteína purificada se puede detectar (superior). La acetilación se puede detectar después de la transferencia en membrana de PVDF y transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-Ac-K (medio). total de p roteins pueden detectarse utilizando un anticuerpo anti-Flag (inferior). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2:. Ensayo de desacetilación vitro sustrato de proteína purificada acetilado (alfa-enolasa) se incuba con SIRT2 o SIRT2 ^H187Y (desacetilación mutante defectuoso) en presencia de NAD ⁺ (carriles 4 y 5). Disminución de los niveles acetilados son detectados por Western Blot usando un anticuerpo anti Ac-K en presencia de SIRT2 pero no en presencia de SIRT2 ^H187Y (carril 4 vs 5). No se observa actividad de desacetilación cuando NAD ⁺ no está incluido en la mezcla de reacción (carril 2 vs 4) o cuando se añade NAM a la mezcla de reacción (carril 6 vs 4).: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:. En las células HEK293T in vivo desacetilación ensayo de forma estable sobreexpresan ya sea SIRT2 o SIRT2 ^H187Y fueron co-transfectadas con el sustrato de proteína (alfa-enolasa) y sombreros para aumentar los niveles acetilados de la proteína (carril 2 vs 1). La desacetilación se comprobó in vivo después de la inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo anti-Flag para tirar hacia abajo el sustrato de proteína y transferencia de Western usando un anticuerpo anti Ac-K. La acetilación se reduce significativamente en las células que sobreexpresan SIRT2 en comparación con el SIRT2 ^H187Y células que sobreexpresan (carril 3 vs 4). La desacetilación SIRT2 mediadadel sustrato de proteína se inhibe cuando las células se tratan con NAM (carril 5 vs 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: ingredientes de la reacción.

Tabla 2: Proteína muestras.

Recent high throughput proteomic studies have established acetylation as a widespread PTM found not only in nucleus but also in cytoplasm and mitochondria ^7,8,21-23. Taking into account the likelihood that many more acetylated proteins and sites might have been not detected due to several reasons, such as specificity of the anti-Ac-K antibodies used, the low abundance of the acetylated proteins, and the transient nature of the PTM, it is safe to predict that more acetylated proteins remain to be discovered in the future, highlighting the importance of reversible acetylation as a regulatory modification directing diverse cellular processes. Regardless of the magnitude of acetylation, identifying the deacetylases which can specifically deacetylate such protein-substrates is an important first step in unraveling the biology of protein acetylation and understanding the complexity of this phenomenon. Towards this direction, use of both in vitro and in vivo deacetylation assays are crucial and necessary to establish the regulatory interplay between deacetylases and their substrates.

Here we present an example of how deacetylation assays can be used in order for an acetylated protein to be considered as a legitimate deacetylation target of SIRT2. As it has already been mentioned, the sirtuin family of proteins consists of seven members which can be found in the cytoplasm, mitochondria, and nucleus ¹⁵. Given the increasing interest regarding the role of these proteins in the different subcellular compartments which can be associated with distinct cellular processes, the above described deacetylation assays can be used with slight modifications to identify new substrates for all different members of the sirtuin family. For example, when mitochondrial proteins are used in deacetylation assays related to SIRT3, it may be necessary to include a mitochondrial isolation step ^24,25 between cell lysis and immunoprecipitation during the purification process for the in vitro deacetylation assay or during the in vivo deacetylation assay before detecting acetylated protein levels. In a similar way, when nuclear proteins need to be used as deacetylation targets in these assays, nuclear extracts following subcellular fractionation might be used for protein purification and the in vivo deacetylation assay.

A critical step for executing the in vitro deacetylation assay is the successful purification of both the deacetylase and the acetylated protein-substrate. Verification of the cells overexpressing the deacetylase as well as the acetylated protein-substrate before the initiation of the purification step is highly recommended. Furthermore, detection of the purified proteins after running a small amount of the isolated proteins on an SDS-PAGE gel before the in vitro deacetylation reaction is also recommended. This will not only confirm the completion of the purification step but will help investigators to focus their efforts on optimizing the deacetylation reaction conditions for any given protein-substrate and deacetylase of interest in case of an unsuccessful deacetylation assay which may require changes in the enzyme-substrate ratio used. Of note, even if a positive deacetylation reaction is detected using the in vitro assay, further validation is required before any conclusion can be made regarding the establishment of a protein as a deacetylation target of a specific deacetylase. This limitation is due to the fact that the co-presence of the substrate and the deacetylase in the tube does not mean that both can be found in the same complex in cells or tissues. This implies that the deacetylation needs to be further validated in vivo. With the focus on the in vivo deacetylation assay, it is worth mentioning that the steady state acetylation levels of a given protein under the experimental conditions tested is a crucial factor in determining whether overexpression or knockdown experiments are more suitable to establish the functional interplay between a deacetylase and its substrate. High levels of acetylation may direct the experimental design towards overexpressing the specific deacetylase to detect a decrease in the acetylation levels. On the contrary, when low levels of acetylation are detected under normal conditions, increased acetylation after knocking down the specific deacetylase might establish the mechanistic connection between a deacetylase and its substrate. Taking all these together, it is clear that the deacetylation assays described in this protocol are necessary to link a deacetylase with its potential substrate.

The next challenges in the field of lysine acetylation dictate that deacetylation assays will be used in the future to address some of the missing links. The considerable gap between the large number of identified mitochondrial lysine sites and the few with a validated regulatory function ²⁶ highlights the need to distinguish bona fide functional acetylation sites from what may be widespread spurious modifications. In vitro and in vivo deacetylation assays carried over by specific deacetylases may be further combined with small scale MS analysis to reveal specific target lysines on a tested substrate to distinguish functional acetylation sites from what may be non-regulatory acetylated lysines. In this regard, sites which are deacetylated due to the enzymatic activity of a sirtuin are more likely to play a functional role compared to sites that are not deacetylated. Another significant challenge is the examination of lysine acetylation in a physiological context. It seems very likely that the acetylation profile of a cell may vary under specific experimental conditions. In vivo deacetylation assays in cells under specific experimental conditions can provide further insight into the connection between the deacetylase and the potential substrate in physiological and pathophysiological scenarios depending on the cell type, or the exposure to specific signaling molecules and stressors. Such studies can establish the functional role of a deacetylation event in a physiological context and connect it to a phenotypic outcome or response. More importantly, deacetylation assays in combination with small scale MS analysis can further provide meaningful information regarding regulatory acetylated lysines under specific cellular conditions.

In conclusion, identification of the enzymes that deacetylate acetylated proteins and sites by using both in vitro and in vivo deacetylation assays will help to resolve the complexity of the acetylome and will contribute to better understanding of the regulatory role of acetylation under various physiological conditions.

Los autores no tienen nada que revelar.

El proyecto descrito aquí fue apoyado por una subvención del NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1), así como por el H. Lurie Centro Integral del Cáncer Robert - La Fundación Familia Lefkofsky / Liz y Premio de Investigación Eric Lefkofsky Innovación a AV Quisiéramos agradecer a los miembros del laboratorio (Carol O'Callaghan y Elizabeth Anne Wayne) para la lectura crítica y la edición de este manuscrito.