Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Edad relacionados con la degeneración macular (AMD) es una de las principales causas de ceguera en personas mayores de 50 ^1.3. AMD se puede clasificar en dos formas: atrófica ("secar") y AMD neovascular ("húmeda") de AMD. El primero se caracteriza por la atrofia geográfica del epitelio pigmentario de la retina (RPE), coriocapilar, y los fotorreceptores, mientras que el último se caracteriza por la invasión de vasos anormales de la coroides en las capas externas de la retina causando fugas, hemorragia y fibrosis, y en última instancia que conduce a la ceguera ^1,2. De las dos formas, AMD neovascular da cuenta de la mayoría de la pérdida de visión ^1. Afortunadamente, esta forma tiene numerosas opciones de gestión farmacológicos eficaces, mientras que su contraparte atrófica Actualmente no ha probado los tratamientos médicos ^3. Además, debido a la forma neovascular ha sido re-capitulado fácilmente en un modelo animal, ha sido más ampliamente accesible a A básicaInvestigación MD explorar los mecanismos patológicos subyacentes a fin de desarrollar nuevas terapias ^4.

El primer modelo animal experimental de la neovascularización coroidea (CNV) fue desarrollado por Ryan et al. en primates no humanos ^5. Esta ruptura modelo inducido de la membrana de Bruch a través de la fotocoagulación con láser, lo que provocó una respuesta inflamatoria local dando como resultado en la angiogénesis similar a la observada en neovascular AMD. Se encontró que la progresión histopatológico de la angiogénesis inducción post-láser para imitar la DMAE neovascular, que confirmó la validez del modelo de ^6. Los primates no humanos ofrecer la anatomía más similares a los humanos, pero desafortunadamente, son caros de mantener, no puede ser manipulado fácilmente genéticamente, y tienen un curso lento tiempo de progresión de la enfermedad ^7. En contraste, los modelos de roedores son mucho más rentable para mantener, pueden ser manipulados genéticamente con relativa facilidad, y tienen un mucho más rápido course de progresión de la enfermedad (experimentos pueden llevarse a cabo en una escala de tiempo de semana frente a meses). Estos experimentos solamente deben llevarse a cabo en roedores pigmentadas ya que es muy difícil de visualizar en animales albinos.

El modelo CNV inducida por láser del ratón, primero desarrollado por el grupo Campochiaro a finales del 90 de ^10, se ha convertido en el modelo animal dominante en la mayoría de los estudios recientes ^11-16. Debido a la patogénesis complejo y todavía no está claro de CNV, el modelo de láser se ha aplicado en todos los aspectos de la investigación AMD húmeda que van desde el estudio de los mecanismos moleculares de conducción de la angiogénesis para la evaluación de nuevas modalidades de tratamiento para el futuro uso humano. Por ejemplo, Sakurai et al. y Espinosa-Heidmann et al. utilizado el modelo de láser para investigar el efecto de los macrófagos en el desarrollo de la CNV utilizando ratones transgénicos y los tratamientos farmacológicos de agotamiento ^{15, 16.} Giani et al. y Hoerster et al. usado tomografía óptica de coherencia-(OCT) para la imagen de la CNV en un esfuerzo por caracterizar la progresión de la CNV y comparar los resultados con los hallazgos histopatológicos observados en imágenes de OCT ^12,17 inducida por láser. Finalmente, los estudios que implican la inyección intravítrea de agentes anti-angiogénicos se han utilizado como pre-requisitos para los ensayos en humanos y fueron vitales en el desarrollo de la primera generación de agentes anti-VEGF utilizadas en la gestión de AMD neovascular hoy ^10,18,19.

Modelos alternativos para la CNV experimental utilizan métodos quirúrgicos para inducir la CNV. Este procedimiento implica la inyección de sustancias pro-angiogénicos (por ejemplo, vectores virales recombinantes que sobreexpresan VEGF, inyección subretiniana de células del EPR y / o perlas de poliestireno) para imitar el aumento de la expresión del VEGF se ve en neovascular AMD, con el objetivo de causar la angiogénesis ^8,20. Sin embargo, este método produce una incidencia drásticamente inferior de la neovascularización; estos estudios mostraron que en la CNVRatones C57 / BL6 se produce en 31% de las inyecciones frente al ~ 70% de éxito visto en el método de la fotocoagulación con láser en la misma cepa de ratones ^8,14. Por estas razones, y dadas las ventajas del uso de roedores en comparación con primates no humanos, el modelo de ratón de la CNV inducida por láser se ha convertido en el modelo animal estándar para la mayoría de CNV neovasculares experimentos de estudio de AMD ^8.

El ojo es un ratón, delicado tejido minúsculo para trabajar. Maniobras del ojo para visualizar la retina es difícil y requiere mucha práctica hasta que se alcanza la maestría. Esta tarea se complica por el hecho de que debe ser aprendido con la mano dominante y no dominante. Por otra parte, después de que los finos movimientos necesarios para visualizar la retina se han aprendido, la coordinación entre ambas manos y el pedal de funcionamiento del láser son importantes. En este trabajo, hemos tratado de destilar los desafíos de aprender todas las manipulaciones físicas involucradas en la CNV proc inducida por láseredure en una guía que ayudará a los operadores a lograr un rápido éxito con este modelo.

Todos los animales son tratados de acuerdo con la Guía del Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 2013 Edition, la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y aprobada por el Animal Institucional Cuidado y el empleo Comisión de la Universidad Northwestern.

Nota: El siguiente procedimiento se puede realizar en su totalidad con un operador; sin embargo, se llevó a cabo mucho más eficiente con dos operadores con las tareas se dividen en consecuencia.

1. Prepare la estación láser y Pre-láser

1. Coloque el láser y lámpara de hendidura donde puede ser fácilmente accesible. A su vez en láser y ajustado a los parámetros predeterminados (por ejemplo, 75 micras de tamaño punto, 100 mW de potencia, 100 ms de duración).
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el operador lleva todas las señales de seguridad láser animales y equipo de protección personal y de seguridad láser pertinente se muestran fuera de la sala de procedimientos.
   1. Antes de usar cualquier animales de experimentación, encontrar parámetros ideales utilizando una calibración, el ratón no experimental. Los parámetros del láser dependerá del láser utilizado. Ideal parámetros son definidos por el ajuste de la potencia del láser más bajo que hace que constantemente la formación de "burbuja" cuando se enfoca correctamente. Ver video de ejemplo de lesión con la formación adecuada "burbuja".
2. Prepare la estación de pre-láser de modo que la anestesia, todas las gotas para los ojos (tropicamida, tetracaína, y lágrimas artificiales) animales más cálido, toallitas de tejidos, y son fácilmente a su alcance para el operador.
   1. Asegúrese de que los animales más cálido se precalienta para corregir la temperatura (37 ° C) antes de la inyección de anestésico en primer ratón con el fin de evitar la hipotermia inducida por anestesia.
3. Coloque etapa del ratón en más cálido por lo que puede retener el calor y permanecer caliente una vez que comience el procedimiento láser.

2. Ratón Anestesia y Preparación Pre-láser

1. Antes de inyectaring anestesia, inspeccione el ojo macroscópicamente para asegurarse de que no tiene deformaciones o anomalías que disminuyen la claridad de la córnea (por ejemplo, cataratas).
2. Pesar ratón.
3. Apunte el peso, el sexo y el número de identificación de los animales.
4. Usando peso, calcular la cantidad adecuada de anestesia que se utilizará en base a las directrices dadas por la institución (por ejemplo, 100 mg / kg de clorhidrato de ketamina, 10 mg / kg de xilazina O tribromoetanol 250 mg / kg; para un ratón de 20 g inyectar 0,20 ml de xilazina / cóctel de ketamina O 0,25 ml de tribromoetanol). Tener una tabla de dosis previamente calculado por peso en incrementos de 1 g con el fin de reducir los errores matemáticos.
5. Scruff ratón e inyectar anestesia intraperitoneal basan en cálculos del paso 2.4.
6. Coloca el ratón sobre los animales más cálido y espere hasta que el ratón está completamente anestesiado marcando el reflejo pedal a través pizca dedo del pie (aproximadamente 3-5 minutos).
7. Enrolle un tejido limpiar y proteger la zona nasal del ratón para evitar que aspiratión de líquido roll-off. Ratón rollo en su lado y colocar una gota (aproximadamente 30 l) de clorhidrato de tetracaína en cada ojo para la anestesia tópica. Espere 2 minutos para la solución tenga efecto.
8. Repita el paso 2.7 con una gota de tropicamida tópico para la dilatación pupilar. Como alternativa, utilice clorhidrato de fenilefrina (2,5%) para la dilatación.
9. Espere 2 minutos para las soluciones que se apliquen; mantener a los animales en el más cálido durante este tiempo.
10. Una vez transcurrido el tiempo adecuado, colocar rápidamente el ratón en el escenario del ratón y colocar la etapa en la barbilla resto de lámpara de hendidura.
11. Encienda la lámpara de hendidura para el brillo de la luz más baja y comprobar el grado de dilatación pupilar. Si alumno no se dilata de manera adecuada (aproximadamente 2,5 a 3 mm), devuelva ratón para animales más caliente y esperar. Alternativamente, administrar otra gota de tropicamida. Una vez que el ojo es suficientemente dilatada, continúe con el procedimiento con láser.

Procedimiento 3. Láser

Nota: Asegúrese de otra personas en la sala de llevar gafas de protección cuando están lejos de láser protegido lámpara de hendidura ocular

1. Ajuste la colocación del ratón en la etapa del ratón, por lo que está en una posición ideal para la visualización de nervio óptico (ver 3.1.2).
   1. Oriente el ratón sobre su soporte de manera que quede en posición horizontal, perpendicular a la hendidura del haz de la lámpara, con la cabeza en un lado y la cola en el otro. Colocación Ideal ratón hará que la visualización del nervio óptico mucho más fácil una vez que se aplica hoja de la cubierta.
   2. Ligeramente gire el ratón por lo que es en un ángulo de 170 ° ~ con la cabeza más cerca de operador de láser.
   3. Asegúrese de que el ratón es tan cerca como sea posible de la lámpara de hendidura, sin embargo, todavía en una posición en la que es estable y donde la mano del operador tendrá espacio suficiente para la manipulación fina.
2. Después de que el ratón está en una posición ideal, coloque una gota de solución de lágrimas artificiales en un 25 mm x 25 mm cubreobjetos de vidrio.
   1. Coloque una gota de solución de lágrima artificial en del opp del ratónojo osite - este ojo se asegurará se hidrata y la formación ayuda retardo de cataratas.
3. Mantenga esquina de cubreobjetos entre el pulgar y los dedos de puntero; posición de modo que el vidrio se comprime entre las puntas de los dedos de ambas.
4. Envolver suavemente los tres dedos restantes en todo el cuerpo del animal para el apoyo y la estabilización mano. Posición de la mano de modo que el cubreobjetos de vidrio se puede colocar fácilmente en el ojo del ratón.
   1. Asegúrese de que la muñeca se estabiliza en una superficie firme con el fin de reducir el temblor de las manos.
5. Una vez que se obtiene la posición estable, presione con cuidado cubreobjetos de vidrio (con la gota de lágrima artificial todavía adherido) en el ojo del ratón.
   1. Asegúrese de que el cubreobjetos se coloca lo más perpendicular posible al rayo láser con el fin de prevenir la dispersión de haz de láser o la reflexión. El cubreobjetos actúa como una lente de contacto para aplanar la córnea.
6. Mira a través de la lámpara de hendidura y con la mano libre de palanca centrarse untretina il se pueden visualizar. La retina tendrá un color claro-amarillo / rojo dependiendo de la ubicación visualizada, vasos, rojas definidas serán visibles.
7. Poco a poco y con cuidado manipular cabeza de ratón y / o cubreobjetos hasta visualizar el nervio óptico. El nervio óptico será de color amarillo con múltiples vasos que irradian de él.
8. Una vez que el operador ha confirmado la visualización del nervio óptico, encienda el láser de enfoque del haz.
9. Una vez que haz de láser se ha encendido, maniobrar enfoque del láser de haz a la posición deseada (aproximadamente 1 diámetro del disco del nervio óptico).
10. Enfoque rayo láser en la RPE del fondo de ojo. El enfoque correcto se logra haciendo que el rayo láser más nítida y más clara. Si el objetivo del haz se ve oval o fuera de foco, alternar el foco de la lámpara de hendidura o colocar cubreobjetos de vidrio.
11. Una vez que el haz de encuadre se centra en RPE, iniciar la administración láser utilizando gatillo pie del láser.
    1. Asegúrese de evitar los vasos de la retina para prevenir intraocular quemorrhage.
12. Atento a la aparición de una burbuja inmediatamente después de la administración láser. El contorno de la disparo de láser debe ser clara y no turbia de ninguna manera.
    1. Si el disparo de láser no da lugar a la formación de burbujas, o área de impacto se ve nebuloso (aspecto turbio con borde circular mal definido vs. clara frontera claramente definida de un impacto con éxito), o si la hemorragia es visto después de la administración de láser, NO incluir estas lesiones para el análisis futuro.
13. Repita los pasos 03.10 a 03.12 para todas las posiciones deseadas de la CNV (por lo general a las 3, 6, 9, y 12 en punto alrededor del nervio óptico). Si se aplican las inducciones láser en aproximadamente misma distancia del nervio óptico, el nuevo enfoque no debería ser necesario. Sin embargo, debido a la fuerte curvatura del ojo del ratón y pequeñas variaciones que puedan existir en la retina, la reorientación de la viga puede ser necesario entre las administraciones de láser consecutivos.
14. Grabar en un cuaderno la ubicación y el resultado de correoadministración disparo de láser ada y resultado (éxito, nebuloso, hemorragia, etc.) de cada disparo se administra para el ojo. Asegúrese de colocar el láser en modo de espera cuando no esté en uso.
15. Repita 03/01 a 03/14 para el ratón del otro ojo, si es necesario, usando la mano opuesta para la estabilización y un nuevo cubreobjetos.
16. Después se administran todos los disparos de láser deseados, apague láser y con lámpara de hendidura.
17. Deseche cubreobjetos y el lugar del ratón en más cálido para la recuperación de la anestesia. Macroscópicamente inspeccionar ojo por cualquier lesión y colocar una gota de solución de lágrimas artificiales para mantener el ojo hidratado y potencialmente prevenir futuro desarrollo de cataratas. Una vez que el ratón se recupere de la anestesia, volver a la jaula.

Tabla 1: Dosis XyIKet Chart.

La cuantificación de las lesiones CNV se puede realizar mediante el análisis de coroides-plana montada utilizando la tinción de inmunofluorescencia para etiquetar los vasos de la CNV. Los dos métodos utilizados con mayor frecuencia de la preparación del tejido son etiquetado FITC-dextrano, hecho a través de la perfusión inmediatamente antes del sacrificio de los animales, o post-mortem inmuno-tinción con un marcador de células endoteliales. Ambos métodos se han descrito anteriormente en detalle ^13,14,21; Figuras 1 y 2 muestran ejemplos de cada uno, respectivamente. Después de la adquisición confocal imagen de microscopía, ya sea de área (2-Dimensiones) o el volumen (3-dimensiones) se puede calcular y visualizar con el software ImageJ o Volocity. Además de la cuantificación, de formación de imágenes OCT se pueden usar para visualizar la lesión CNV in vivo. Un ejemplo de una imagen en sección transversal de la retina con CNV resultante se muestra en la Figura 3.

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Figura 1:. CNV tinción de perfusión y de la zona (2D) Ejemplo de cálculo (25X) (A) FITC dextrano perfundido lesión de NVC. Método de cuantificación (B) Área ImageJ través de umbrales. Ratón Strain:. C57BL / 6J Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: CNV inmunotinción y de volumen (3D) Ejemplo de cálculo (25X) (A) isolectina GS-IB4 manchada lesión de NVC.. (B) la reconstrucción 3D de la lesión de NVC en opinión de la cara. (C) la reconstrucción 3D vista lateral (B y C un ancho de tile = 35 micras). Ratón Strain: C57BL / 6J.g2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:. Octubre Transversales CNV visualización (A) octubre en vista de la cara de la lesión CNV. (B) octubre transversal B-scan de retina con CNV círculo en amarillo. Ratón Strain:. C57BL / 6J Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Existen múltiples factores que pueden afectar la entrega de láser y la consiguiente desarrollo de la lesión NVC tras éxito láser inducción. Estos factores deben ser controlados por y estandarizados con el fin de tener los resultados más confiables. El más pertinente de estos factores son la selección del ratón (genotipo, edad y sexo), la selección de anestésico, y la configuración de láser.

El modelo específico de ratón utilizada puede tener un efecto significativo en el curso del desarrollo de la CNV. El genotipo más ampliamente usado es el ratón C57BL / 6. El vendedor del que se obtienen los animales puede afectar el tamaño CNV resultante. Poor et al. demostrado diferencias significativas en el tamaño final lesión de NVC en ratones C57BL / 6 ratones de Jackson, Charles Rivers, y los laboratorios de Taconic, con ratones de Taconic en desarrollo significativamente mayor CNV que los otros dos proveedores ^4. Por lo tanto, la compra de una empresa y el uso de todos los ratones a partir de ese mismo vendedor ayudará a minimizar las diferencias externasen CNV tamaño de la lesión. La edad y el sexo del ratón también ha demostrado ser un factor importante a considerar al diseñar el experimento. Mujeres ratones desarrollan más CNV que los ratones machos de la misma edad, y los ratones de más edad de ambos sexos se desarrollan más CNV que los ratones más jóvenes ^22,23. En función de los parámetros experimentales, los operadores deben tener en cuenta estos factores. Por ejemplo, si los operadores están utilizando el procedimiento con láser-CNV para dilucidar efectos mecánicos y fármacos de desarrollo, ambos sexos en las diferentes edades deben utilizarse para definir los mecanismos que son específicos de los sexos y las que no lo son.

Anestesia adecuada es un paso crítico para este procedimiento, especialmente durante el proceso de aprendizaje. La mayoría de los regímenes aprobados IACUC pueden inducir la anestesia durante al menos 15 a 30 minutos, lo cual es más que suficiente tiempo para entregar 4-5 disparos de láser para cada ojo una vez que el procedimiento ha sido dominado. Sin embargo, si transcurre demasiado tiempo, la anestesia puede llevar a la opacificación del cristalino reversible, rendering el ojo ópticamente impermeable para experimentación CNV ^24. Los dos protocolos principales utilizados para inducir la anestesia son una xilazina / cóctel de ketamina o tribromoetanol (TBE) entregados por vía intraperitoneal. Aunque algunos informes postulan las ventajas de TBE a xilazina / ketamina en términos de la formación de cataratas, tanto con el tiempo como resultado el desarrollo de una lente nublado si el operador no funciona rápidamente ^14. Una manera de extender el tiempo antes de que el desarrollo de cataratas es para mantener la hidratación del ojo, como se mencionó en el protocolo detallado, mediante la aplicación de lágrimas artificiales ^25. Este método, sin importar la sustancia anestésica utilizada, debe ayudar a retrasar la formación de cataratas y dar al operador más tiempo para completar el procedimiento.

Configuración de láser puede ser un factor importante en la inducción fiable de la CNV. Calibración de la potencia del láser y la duración son un importante paso preliminar antes de realizar el procedimiento en animales de experimentación. Disparos de láserque causa hemorragia o están fuera de foco y sin formación de burbujas deben excluirse del cálculo, ya que esto interrumpe el proceso de desarrollo de la CNV. Si varios vasos se rompen causando hemorragia difusa, todo el ojo debe ser excluido. Idealmente, la potencia más baja y menor duración de láser que rompe constantemente la membrana de Bruch causando la formación de burbujas y una lesión con clara demarcación deben usarse ^4. Protocolos experimentando con diferentes ajustes de potencia han demostrado que el aumento de la potencia y la duración a un daño tisular excesiva y tarifas posteriormente inferiores de formación CNV ^{4, 14,17.} Además, la ubicación de la lesión con láser también puede afectar el desarrollo de la CNV. Impactos entregados aproximadamente 1 diámetro de disco (DD) desde el disco óptico producido zona de mucho mayor volumen de la CNV que aquellos entregados <1 DD o 2 o más DDs distancia ^23. Dependiendo del análisis post-láser, localización de la lesión puede o puede no ser crucial. Por ejemplo,si una imagen octubre se va a obtener de todas las lesiones, la ubicación central alrededor del nervio óptico es vital. En contraste, si las lesiones se van a analizar a través de planos de montaje, localización de la lesión no es tan crucial. Por último, asegúrese de que los últimos disparos no están demasiado cerca uno del otro, o bien dos lesiones pueden "crecer" juntos.

El ensayo CNV es un método robusto para estudiar experimentalmente AMD neovascular. La angiogénesis resultante de la inducción láser es similar en ubicación y el aspecto general a la angiogénesis observada en los pacientes con AMD humanos. Sin embargo, está lejos de ser un modelo perfecto. A diferencia del ojo humano, los ratones no tienen una mácula definido, y la angiogénesis por lesión aguda visto en el modelo CNV inducida por láser difiere fundamentalmente de la influencia genética, patología crónica de AMD ^7,8,14. El entorno de la retina del ratón es saludable y de la angiogénesis resultante se produce como una reacción al trauma causado por el impacto de láser, en lugar de genética / efactores y la edad mbiental, como en AMD humana. En contraste, el ambiente de la retina humana en AMD se encuentra en un estado de inflamación crónica, durante el cual las anormalidades en la expresión del VEGF y otras citoquinas causan CNV ^3. Claramente, el desarrollo neovascular en estos dos entornos es marcadamente diferente.

En conclusión, el protocolo CNV inducida por láser es uno que es inicialmente difícil de realizar, pero en última instancia gratificante de dominar. La destreza fina necesaria para sostener el ratón y cubreobjetos, así como manipular la cabeza cubreobjetos y el ratón para visualizar el nervio óptico son ejercicios que requieren paciencia y práctica, sobre todo desde que necesitan para llevar a cabo bien mediante cualquiera de las manos del operador. Sin embargo, una vez que se aprende la técnica que puede ser una manera eficaz de poner en práctica CNV experimental y se puede aplicar a la mayoría de los aspectos de la investigación AMD neovascular.

The authors declare they have no competing financial interests.

The authors would like to acknowledge Jonathan Chou, MD for his assistance on preparation and editing of the final manuscript and Wenzhong Liu for the OCT data. We would also like to acknowledge support from the Macula Society Research Grant (AAF), support from an unrestricted grant to Northwestern University from Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, and support from NIH-EY019951.