Nanoclusters Síntesis de Immunotargeted Magneto-plasmónica

Aquí se describe un protocolo para la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica con un fuerte momento magnético y un fuerte en el infrarrojo cercano (NIR) absorbancia. El protocolo también incluye conjugación de anticuerpos a las nanopartículas a través de la fracción Fc para diversas aplicaciones biomédicas que requieren orientación específica molecular.

Propiedades magnéticas y plasmónicas combinados en una sola nanopartícula proporcionan una sinergia que es ventajoso en un número de aplicaciones biomédicas, incluyendo la mejora del contraste en nuevas modalidades de imagen magnetomotrices, captura simultánea y la detección de células tumorales circulantes (CTC), y la imagen molecular multimodal combinada con la terapia fototérmica de las células cancerosas. Estas aplicaciones han fomentado el interés en el desarrollo de protocolos para la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica con absorción óptica en la región del infrarrojo cercano (NIR) y un fuerte momento magnético. Aquí, se presenta un protocolo novedoso para la síntesis de tales nanopartículas híbridas que se basa en un método de microemulsión de aceite en agua. La característica única del protocolo descrito en este documento es la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica de diversos tamaños de los bloques primarios que también tienen características magneto-plasmónicas. Este enfoque produce nanopartículas con una alta densidad de funcionalidades magnéticos y plasmónicas que se distribuyen de manera uniforme en todo el volumen de nanopartículas. Las nanopartículas híbridas pueden ser fácilmente funcionalizados mediante la unión de anticuerpos a través de la fracción Fc dejando la porción Fab que es responsable de la unión disponibles para la orientación antígeno.

Nanopartículas híbridas que comprendan diferentes materiales con propiedades fisicoquímicas distintas pueden abrir nuevas oportunidades en aplicaciones biomédicas, incluyendo imágenes multimodal molecular, el suministro de terapia y el seguimiento, nuevo cribado y ensayos de diagnóstico ^1-3. La combinación de propiedades plasmónicas y magnéticos en una sola nanopartícula es de particular interés, ya que proporciona una muy fuerte dispersión de luz y de absorción secciones transversales asociados con resonancias de plasmones y la capacidad de respuesta a un campo magnético. Por ejemplo, se utilizaron nanopartículas magneto-plasmónicas para aumentar el contraste en las imágenes de campo oscuro de células marcadas mediante la aplicación de una modulación de la señal temporal a través de un electroimán externa ^3-5. Más recientemente, un principio similar se aplicó en el desarrollo de una nueva modalidad de imagen - imágenes magneto-fotoacústica, donde las nanopartículas magneto-plasmónica permiten grandes mejoras en el contraste y la rata de señal a fondoio ^6,7. También se demostró que las nanopartículas híbridas pueden ser utilizados para la captura y la detección de células tumorales circulantes en la sangre entera e in vivo ^8,9 simultánea. Además, las nanopartículas magneto-plasmónicas son prometedores agentes teranósticos que se pueden usar para formación de imágenes ópticas y MR específica molecular combinado con la terapia fototérmica de las células cancerosas ^10.

Se exploraron varios enfoques para la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica. Por ejemplo, Yu et al. Descomposición utilizado y la oxidación de Fe (CO) ₅ sobre nanopartículas de oro para formar-mancuernas como bifuncionales Au-Fe ₃ O ₄ nanopartículas ^11. Wang et al. Han sintetizado nanopartículas de óxido de hierro recubierto de oro utilizando el método de descomposición térmica ^12. Algunos otros enfoques se basan en polímeros de amina o recubrimiento moléculas funcionales en nanopartículas de núcleo magnético, seguido por la deposición de agcáscara de edad sobre la superficie de polímero para crear el híbrido partículas de ^7,13. Además, las nanopartículas de óxido de hierro se adjunta a nanorods de oro a través de interacciones electrostáticas o una reacción química ^14,15. Aunque estos enfoques producen nanoestructuras magneto-plasmónicas, comprometen a algunas propiedades extensión de la combinación magneto-plasmónica tales como absorbancia óptica en el (NIR) ventana de infrarrojo cercano o un fuerte momento magnético ambos de los cuales son altamente deseables en aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, pesa de gimnasia Au-Fe ₃ O ₄ nanopartículas tienen un pico de resonancia de plasmón a 520 nm lo que limita su utilidad in vivo debido a la alta turbidez tejido en este intervalo espectral. Además, las nanopartículas magneto-plasmónica producidos por los protocolos actuales se limitan a un solo ¹¹ o pocos (menos de 10) ^14,15 mitades superparamagnéticas (por ejemplo, nanopartículas de óxido de hierro) que es significativamente menor que podría ser ACHieved en una nanoestructura densamente poblado. Por ejemplo, una nanopartícula esférica de 60 nm de diámetro densamente poblado puede contener del orden de un millar de 6 nanopartículas superparamagnéticas nm. Por lo tanto, hay una gran sala para mejorar las propiedades magnéticas de las nanopartículas híbridas. Por otra parte, algunos de los protocolos descritos anteriormente son relativamente complejos y requieren optimización cuidadosa para evitar la agregación de partículas durante la síntesis de ^14,15.

Aquí se describe un protocolo para la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica con un fuerte momento magnético y una fuerte absorbancia NIR que aborda las principales limitaciones de la técnica actual. La síntesis tiene sus orígenes en el método ¹⁶ microemulsión de aceite en agua. Se basa en el montaje de las nanopartículas de un tamaño deseado de unas partículas primarias mucho más pequeñas. Este enfoque ha sido utilizado con éxito para producir nanoestructuras de un solo material, como oro, óxido de hierro, y pri semiconductormary partículas ^16. Nos extendió a la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica por, primero, haciendo que las partículas de núcleo de óxido de concha de oro diámetro de 6 nm / hierro y, a continuación, el montaje de las partículas híbridas primarios en la nanoestructura esférica final. Montaje de partículas primarias en nanoclusters no sólo permite la mejora de las propiedades de las nanopartículas constituyentes, tales como el logro de un momento magnético más fuerte, mientras que la preservación de propiedades superparamagnéticas, pero también se aprovecha de las interacciones entre las nanopartículas individuales creando así nuevas características ausentes de las nanopartículas constituyentes, tales como fuerte absorbancia óptica en la ventana de NIR. Este protocolo produce nanopartículas híbridas con una alta densidad de funcionalidades magnéticas y plasmónica. Después de partículas primarias se sintetizan, nuestro método es esencialmente una reacción de una etapa simple. La fuerza total de resonancia de plasmón y momento magnético son determinados por un número de partículas primarias y, therntes, puede ser fácilmente optimizada en función de una aplicación. Además, también hemos desarrollado un procedimiento para la conjugación del anticuerpo a las nanopartículas híbridas para diversas aplicaciones biomédicas que requieren orientación específica molecular. Los anticuerpos están unidos a través de la fracción Fc dejando la porción Fab que es responsable de la unión disponibles para la orientación antígeno.

1. Aparatos y Preparación Cristalería

1. Use el equipo adecuado de protección, es decir, una bata de laboratorio, guantes desechables y protección ocular.
2. Conecte un matraz de fondo redondo a un condensador y sumergirlo en un baño de aceite de silicona con un monitoreo de la temperatura con un termómetro. Coloque una fuente de calor (por ejemplo, la placa caliente) en el baño de aceite (Figura 1). Use un termómetro capaz de medir la temperatura superior a 260 ° C.

Nanopartículas 2 Síntesis de híbrido Primaria Magneto-plasmónicas

1. Haciendo magnética Core nanopartículas
   1. Añadir 353,2 mg (1 mmol) de hierro acetilacetonato (III), 1 ml (2 mmol) de ácido oleico, 1 ml (2 mmol) oleilamina, 1,292 g (5 mmol) de 1,2-hexadecanodiol, y 10 ml de éter de fenilo para una ronda frasco -fondo.
   2. Se agita la mezcla vigorosamente utilizando un agitador de varilla y el calor magnético de 250-260 ° C durante 1 hora a reflujo. Luego, esperar a que se enfríe la solucióna RT. Asegúrese de que la temperatura es inferior a 260 ° C para evitar la ebullición del éter de fenilo y evitar una explosión de la mezcla de reacción desde el matraz de fondo redondo al condensador.
      PRECAUCIÓN: La mezcla de reacción es extremadamente caliente y los productos químicos puede causar irritación. Debe operar bajo una campana de humos y llevar equipo de protección personal adecuado. Asegurar una ventilación adecuada para el baño de aceite.
      NOTA: El baño de aceite se mantiene a 250-260 º C de temperatura durante 1 hora durante la síntesis de las nanopartículas magnéticas. En principio, un plato de vidrio Pyrex se puede utilizar para este propósito. Sin embargo, la temperatura máxima continua de vidrio Pyrex es de ~ 260 º C de acuerdo con la información del proveedor. Por lo tanto, un recipiente de metal proporciona una opción más segura para la reacción, ya que puede resistir una temperatura más alta y durar más tiempo durante múltiples carreras.
2. Deposición de una concha de oro en nanopartículas de núcleo magnético
   1. Añadir 411,5 mg (1,1 mmol) as oroTate, 0,25 ml (0,75 mmol) de ácido oleico, 1,5 ml (3,0 mmol) oleilamina, 775,3 mg (3 mmol) de 1,2-hexadecanodiol, y 15 ml de éter de fenilo a un matraz de fondo redondo.
   2. Añadir 5 ml de suspensión de nanopartículas magnéticas desde el paso 2.1. Calentar la mezcla de reacción a 180 ° C y mantener a reflujo durante 1 h. Esperar a que la solución se enfríe a temperatura ambiente.
   3. Añadir 50 ml de etanol para precipitar las nanopartículas híbridas primarias seguido por centrifugación a 3250 × g durante 15 min.
   4. Resuspender el precipitado en 25 ml de hexano usando un sonicador de baño. Añadir 25 ml de etanol para precipitar las nanopartículas híbridas primarios. Centrifugar a 3250 xg durante 15 min y resuspender el precipitado en hexano. Repita este paso tres veces.
   5. Secar las nanopartículas híbridas primaria precipitados en un desecador de vacío O / N. Confirme que las partículas estén completamente secas.

Nanoclusters 3. híbrido Magneto-plasmónicas Síntesis y Tamaño Separación

1. Resuspender 5 mg de nanopartículas híbridas primarias secos en 1 ml de hexano usando un sonicador de baño. Sonicar la suspensión de nanopartículas hasta que no precipitado visible está presente.
2. Añadir la solución del paso 3,1 a 10 ml de solución acuosa de dodecilsulfato de sodio (2,8 mg / ml) en un vial de vidrio de 20 ml con tapas fijadas. Añadir la suspensión de nanopartículas híbridas primaria gota a gota para evitar la mezcla de las dos fases antes del siguiente paso.
3. Sonicar la solución de dos fases en un baño de ultrasonido durante 2 horas, seguido de calentamiento en un baño de agua a 80 ° C durante 10 min. Esperar a que la solución se enfríe a temperatura ambiente.
   1. Llenar de agua hasta la línea de nivel operativo del baño de ultrasonidos. Centre el vial de vidrio en el baño de ultrasonidos. Se forma una emulsión inmediatamente entre las dos fases. Agite la solución de dos fases a mano después de inicio del tratamiento con ultrasonidos; esto facilita la mezcla entre la fase que contiene nanopartículas híbridas primarios y la fase acuosa inferior.
      NOTA: Tenga en cuenta That sonicador se calentará después de 2 horas de funcionamiento.
4. Centrifugar la suspensión híbrida nanocluster a 100 xg durante 30 min. Recoger tanto el precipitado y el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 0,1 mM citrato de sodio por debajo de 10 min sonicación. El tamaño esperado de los nanoclusters es de ~ 180 nm de diámetro.
5. Transferir el sobrenadante de la etapa 3.3 a un nuevo tubo cónico.
6. Centrifugar la suspensión de la etapa 3.4 a 400 xg durante 30 min. Recoger tanto el precipitado y el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 0,1 mM citrato de sodio por debajo de 10 min sonicación. El tamaño esperado de los nanoclusters es de ~ 130 nm de diámetro.
7. Transferir el sobrenadante de la etapa 3.5 a un nuevo tubo cónico.
8. Centrifugar la suspensión de la etapa 3.6 a 1.500 xg durante 30 min. Recoger el precipitado y resuspender en citrato de sodio 0,1 mM en 10 min sonicación. El tamaño esperado de los nanoclusters es de ~ 90 nm de diámetro.
9. Añadir 300 _6; l de suspensión nanocluster a un lector de microplacas de 96 pocillos para medir un espectro de absorción UV-Vis-NIR. Caiga 10 suspensión nanocluster l en rejilla de cobre recubierta de carbono para obtener imágenes TEM.

4. Conjugación de anticuerpos monoclonales a Nanoclusters

1. Preparar 100 l solución de anticuerpo monoclonal (1 mg / ml) en PBS, pH 7,2, por ejemplo, anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico 2 (HER2) anticuerpos o receptor 1 del factor de crecimiento (EGFR) anticuerpos contra-epidérmica.
2. Añadir la solución de anticuerpo de la etapa 4.1 a 3.9 ml 4 mM HEPES, pH 7,2. Centrifugar la solución a través de un filtro centrífugo 10 k MWCO a 3.250 xg durante 20 min a 8 ° C. Resuspender el anticuerpo en 4 mM HEPES, pH 7,2, hasta un volumen final de 100 l.
   NOTA: Este paso se lleva a cabo para reemplazar el medio original en la solución de anticuerpo con HEPES.
3. Añadir 10 l de 100 mM NAIO ₄ a 100 l de solución de anticuerpos. Cubrir el vial de reacción con un allámina uminum a TA y se mezcla durante 30 min utilizando un agitador orbital.
4. Interrumpir la reacción mediante la adición de 500 l de 1x PBS.
5. Añadir 2 l de solución de enlazador 46,5 mM (dithiolaromatic peg6-CONHNH ₂₎ a la solución de anticuerpo de la etapa 4.4 y agitar durante 1 hora a TA.
6. Filtrar la solución usando un filtro de centrífuga de 10 k MWCO a 3.250 xg durante 20 min a 8 ° C. Resuspender el anticuerpo en 1X PBS hasta un volumen final de 100 l que conduce a una concentración de anticuerpo de ~ 1 mg / ml.
7. Mezclar 100 l de suspensión nanocluster a una DO de 1,0 ~ 1 l con anticuerpos modificados de la etapa 4.6 (1 mg / ml) durante 120 min a RT.
8. Añadir 10 l de 10 ^-3 M 5 kDa tiol PEG y agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
9. Centrifugar la solución a 830 x g durante 3 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 100 l 2% w / v de PEG 5 kDa en PBS, pH 7,2.
10. Medir el espectro de absorción de los nanoclusters-anticuerpo conjugado y comparar a tél absorbancia espectro de los nanoclusters desnudas. Espere un par de nanómetros corrimiento al rojo después de la conjugación.
11. Si las nanopartículas agregadas como se muestra por un cambio significativo con un aumento de OD en la región del rojo-NIR, aumentar la concentración de PEG tiol a 5 x 10 ^-3 M. También, aumentar el tiempo de incubación con PEG tiol a 30 min y disminuir la velocidad centrífuga en incrementos de 200 xg.
12. Para el cáncer de ensayo de marcaje celular, añadir el anticuerpo nanopartículas conjugadas desde el paso 4.9 de la suspensión de células cancerosas, ya sea en medio o 1x PBS (1 ml ~ 10 ⁶ células) y se mezcla durante 60 min.

Un esquema para la síntesis de nanoclusters magneto-plasmónica immunotargeted se muestra en la Figura 2. Primer lugar, magnéticos Fe ₃ O ₄ nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan a través de método de descomposición térmica. Entonces, una cáscara delgada de oro alrededor de 1 nm se deposita sobre las partículas de núcleo de óxido de hierro a través de la descomposición térmica. Las nanopartículas híbridas primaria ca. 6 nm sirven como semillas para crear nanoclusters magneto-plasmónica mediante la utilización de un enfoque microemulsión de aceite en agua. Los nanoclusters están funcionalizados con anticuerpos monoclonales para la focalización específica molecular.

El tamaño de las nanopartículas de óxido de hierro como núcleo de síntesis es de ~ 5 nm de diámetro. Después de la deposición concha de oro sobre el núcleo magnético, el tamaño del núcleo de óxido de hierro primaria / oro shell nanopartículas aumenta a ~ 6 nm de diámetro. Los cambios de color marrón para coloidales de nanopartículas de óxido de hierro a rojo-púrpura después de la deposición de la concha de oro y,por último, con el color púrpura-gris después del montaje de las partículas primarias en ~ 180 nm de diámetro nanoagregados esféricas (Figura 3). UV-Vis espectros muestran que el núcleo de óxido de hierro primario / nanopartículas concha de oro tienen un pico de resonancia distintivo a 530 nm que no está presente en partículas de óxido de hierro desnudos (Figura 4). Tras la formación de clúster, el espectro cambia notablemente y exhibe una fuerte absorbancia NIR amplia (Figura 4).

Los nanoclusters se conjugan con anticuerpos monoclonales para dirigirse específicamente a las biomoléculas de interés. El protocolo de conjugación utiliza un polietilenglicol heterofuncional (PEG) enlazador que une la región Fc de los anticuerpos a la superficie nanocluster. Un extremo del enlazador tiene un resto hidrazida que interactúa con resto de anticuerpo glicosilado oxidado. El otro extremo del enlazador contiene un grupo-di tiol que tiene una fuerte afinidad a la superficie de oro de los nanoclusters. Para demonstrate orientación molecular hemos elegido una línea de EGFR positivo el cáncer de piel de células (A-431) y una línea celular de cáncer de mama positivo HER2 (SK-BR-3). Nanoclusters fueron funcionalizados, ya sea con anti-EGFR o anticuerpos anti-HER2 seguido de la mezcla con A-431 o células SK-BR-3 de cáncer, respectivamente. En la Figura 5, un brillante color dorado-naranja en SK-BR-3 células cancerosas A-431 e indica molecular específica unión de nanoclusters a los receptores en las células cancerosas correspondiente. En contraste, nanoagregados PEGiladas no focalizados no interactúan con las células cancerosas. Estos resultados muestran la especificidad molecular de los nanoclusters funcionalizados.

Figura 1. un montaje experimental para la síntesis de nanopartículas de óxido de hierro primarios de núcleo y corteza / oro. Un matraz de fondo redondo está conectado a un condensador. La reacción se lleva a cabo en un baño de aceite bajo la vigilancia de la temperatura con un termómetro.

Figura 2 un esquema que ilustra los principales pasos en la síntesis de nanoclusters magneto plasmónica immunotargeted. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. imágenes de TEM y el color de suspensiones coloidales de nanopartículas: (izquierda) de óxido de hierro nanopartículas básicas; (Media) nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de oro; nanoclusters (Derecha) magneto-plasmónica híbrido. La barra de escala para las imágenes de TEM es de 50 nm. ps: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52090/52090fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. (A) UV-Vis-NIR espectros de nanopartículas núcleo de óxido de hierro (azul), las nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de oro (verde), e híbridos nanoclusters magneto-plasmónica (rojo). (B) UV-Vis-NIR espectros de nanoclusters magneto plasmónica híbridos con diferentes tamaños: 90 nm (azul), 130 nm (verde) y 180 nm (rojo). Todos los espectros se normalizan a una en la absorbancia máxima para mostrar diferencias en los perfiles espectrales. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. ank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. especificidad molecular de anticuerpo conjugado nanoagregados magneto plasmónica: (Izquierda) EGFR que expresa A-431 células de cáncer de piel se incubaron con nanoclusters EGFR; (Educación media) HER2 que expresan las células de cáncer de mama SK-BR-3 incubadas con nanoclusters HER2; células (Derecha) A-431 incubadas con nanoclusters PEGiladas no focalizados. El color amarillo-naranja de las células indica etiquetado con éxito por los nanoclusters funcionalizados; color gris azulado corresponde a una dispersión endógena de las células. Las imágenes fueron adquiridas mediante microscopio vertical con objetivo 20X de campo oscuro y Xe lámpara de excitación. La barra de escala es de 10 m._blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1. Este video compara una respuesta de las células cancerosas A-431 marcadas por cualquiera de las nanopartículas primarias o nanoclusters a un campo magnético externo. Ambos tipos de partículas donde conjugado con anticuerpos anti-EGFR para la focalización específica del EGFR (+) células A431. En primer lugar, un tubo Eppendorf se llenó con una suspensión de células marcadas. Entonces, un imán se colocó al lado del tubo y el movimiento de las células fue fotografiada a aproximadamente 10 mm de distancia del imán. La película de la izquierda muestra las células marcadas con nanopartículas de primaria (6 nm de diámetro) y la película a la derecha - células marcadas con nanoclusters magneto plasmónica (100 nm de diámetro). Las películas fueron adquiridos utilizando un microscopio invertido en el modo de campo claro con un objetivo 20X. La barra de escala es 100 m.

Los pasos críticos en la síntesis exitosa de nanoclusters magneto plasmónica incluyen la fabricación altamente monodispersas de oro primario shell / hierro nanopartículas núcleo de óxido y la dirección de auto-ensamblaje de las partículas primarias en nanoclusters. Una relación molar entre las partículas primarias y tensioactivos juegan un papel importante en la determinación de la distribución del tamaño de los nanoclusters. Distribución de tamaño no uniforme de nanopartículas primarias puede causar la formación de grandes agregados durante el montaje de nanoclusters magneto-plasmónica. Además, el método de microemulsión de la formación de nanocluster se basa en tensioactivos anfifílicos: grupos de cola hidrófobos tienen nanopartículas primarias juntos y grupos de cabeza hidrófilos estabilizan nanoclusters en una solución acuosa. Concentración de los tensioactivos determina asamblea nanocluster: una alta concentración llevaría a la formación de nanoclusters más pequeñas o partículas primarias individuales y una baja concentración daría lugar a la agregación de partículas.

Un radio hidrodinámico de nanoclusters aumentos de ~ 10-15 nm después de la conjugación de anticuerpos. Este aumento en el diámetro correlaciona well con aproximadamente 12 nm de tamaño de un anticuerpo IgG que se une a través de la fracción Fc a la superficie de las nanopartículas. Por lo tanto, el cambio en el diámetro hidrodinámico es consistente con la química de conjugación direccional de anticuerpos a través de la porción Fc que se implementa en el protocolo. Potencial zeta de las nanopartículas se desplaza de -47,6 mV antes de la conjugación de anticuerpos a -7,0 mV después de la conjugación. El cambio de la carga superficial proporciona evidencia adicional de conjugación de anticuerpos a nanoclusters.

La característica única del protocolo descrito en este documento es la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica de diversos tamaños de los bloques primarios que también tienen características magneto-plasmónicas. Este método proporciona una forma sencilla de controlar simultáneamente la fuerza de características plasmónicas y magnéticas de las nanoestructuras resultantes. En contraste, los protocolos anteriores utilizan una asamblea de nanomaterial plasmónica y magnéticos donde un material sirve como una plantilla para la deposición de la otra; En este enfoque un material ocupa volumen y la otra superficie de las nanoestructuras resultantes. Nanopartículas Magneto-plasmónicas reportados en la literatura tienen significativamente menor densidad y la cantidad total de partículas superparamagnéticas en comparación con los nanoclusters hechas por nuestro protocolo ^14,15. En nuestro método restos magnéticos y plasmónicas se distribuyen uniformemente por todo el volumen de nanopartículas híbridas magneto-plasmónica.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Este trabajo fue apoyado en parte por las subvenciones del NIH R01 y R01 CA103830 EB008101.